مقدمه

تب برفکی دشمن سرمایه دامی و یکی از مهم‌ترین بیماری­های ویروسی دام می‌باشد (1). این بیماری به‌شدت واگیر‌دار است و تمام زوج سمان را در‌گیر کرده و به کاهش تولید شیر (25 درصد)، گوشت (25 درصد) و پشم (25 درصد) در گله منجر می‌شود و 5 درصد تلفات در دام‌های جوان ایجاد‌ می‌کند. ویروس تب برفکی از خانواده پیکورناویریده و از جنس آفتوویروس است که 7 تیپ C،O ،A ،Asia1 ،SAT1 ،SAT2 ، SAT3 و بیش از 85 تحت‌تیپ‌ دارد. تیپ‌های A و O در آفریقا، آسیا و بخشی از آمریکای جنوبی در گردش می‌باشند، در‌حالی‌که تیپ C ظاهراً ناپدید شده است (1). تیپ  SAT2در عراق در سال 2022 به‌طور محدود و همچنین تیپ Asia1 در سال 2021 در پاکستان گزارش شده است (2، 3)‌. از دیرباز در ایران تیپ­های O‌، A و Asia1 ویروس تب برفکی بومی می­باشند. ناحیه ژنومی 1D ژن ویروس مسئول صدور رمز برای تولید مهم‌ترین پروتئین‌‌ آنتی‌ژن سطحی (‌(VP1‌ است. با مطالعه فعالیت مناطقی از VP1 و نیز تعیین توالی این منطقه در سروتیپ­های مختلف FMDV معلوم شد بیشترین تغییرات آنتی­ژنتیکی مربوط به مناطقی از ژنوم ویروس است که اسید آمینه‌های 141 تا 160 و 200 تا 213 کد‌ می‌دهد (4). تنوع بالای ویروس باعث‌ می‌شود کنترل این بیماری از‌طریق واکسیناسیون سخت باشد. وجود دام‌های ناقل هم سبب باقی ماندن ویروس در گله می‌شود و کنترل بیماری را دشوار‌ می‌‌کند. تشخیص اولیه ویروس در نمونه‌های مشکوک توسط آزمایش الایزا انجام‌ می‌شود. همچنین از RT-PCR و Real time PCR برای تشخیص و تعیین تیپ‌های ویروس تب برفکی در آزمایشگاه مرجع جهانی (World Reference Laboratory for FMD, pirbright) استفاده‌ می‌گردد.

باید در نظر داشت درکشورهای همسایه، کشورهایی وجود دارند که نه‌تنها بیماری در آن‌ها بومی است، بلکه بعضاً مبارزه با این بیماری در این کشورها، نظیر افغانستان، با علامت سؤال مواجه است. ترس از بیماری نه‌تنها برای کشورهای اندمیک آزاردهنده می‌باشد، بلکه تهدید احتمال سرایت آن به کشورهای پاک نیز حاشیه امنیت آن‌ها را با خطر مواجه کرده است. چنانچه نگاهی به پدیده بیوتروریسم اقتصادی داشته باشیم، وسعت میدان مبارزه بسیار وسیع­تر می‌شود. استان خراسان رضوی دارای 6 میلیون و 700 هزار رأس دام سبک و 315 هزار رأس دام سنگین است. تعداد دام سنگین روستایی و عشایری استان 200 هزار رأس‌ می‌باشد. کسب رتبه نخست کشور در تولید گوشت قرمز (با تولید حدود ۸۳ هزار تن) و مقام سوم در تولید شیر (با تولید بیش از 1 میلیون و ۱۴۰ هزار تن شیر) نشان از جایگاه این استان در حوزه دام دارد. در‌صورتی‌که بیماری تب برفکی شیوع پیدا کند و تنها 5 درصد خسارت اقتصادی ناشی از تلفات، کاهش گوشت و کاهش شیر را در نظر بگیریم، طبق برآورد خسارت اقتصادی ناشی از بیماری در 1 سال حدوداً 5020 میلیارد ریال خواهد بود. آگاهی از وضعیت ژنتیکی سویه‌های در گردش سبب پیش‌بینی وقوع احتمالی همه‌گیری‌های شدید خواهد شد و یا ممکن است موجب تصمیم‌گیری برای تغییر سویه‌های واکسینال گردد. مطالعه حاضر سویه‌های در گردش مزارع را طی سال‌های 1400 و 1401 پایش ژنومی کرده و قرابت ژنتیکی ویروس‌های جدا‌شده را با ویروس‌های ثبت‌شده در بانک ژنی و ویروس‌های موجود در واکسن تب برفکی تولید‌شده در مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی بررسی کرده است.

مواد و روش کار

نمونه‌گیری و آماده‌سازی نمونه: 51 نمونه از ضایعات لثه و زبان دام‌های مشکوک توسط دامپزشکان اخذ و داخل بافر فسفات حاوی 50 درصد گلیسرول به آزمایشگاه ارسال شد. جهت آماده‌سازی، نمونه پس از له و ساییده شدن کامل در هاون چینی و هموژن کردن زیر هود کلاس II با شرایط 3000 دور به‌مدت 5 دقیقه در 4 درجه ­سانتی­گراد سانتریفیوژ شد (‌سوسپانسیون حاوی ویروس مشکوک برای کشت سلولی با استفاده از فیلتر میلی پور 22/0 میکرومتر فیلتر شد). مایع رویی یا بلافاصله برای آزمایش مورد استفاده قرار گرفت و یا تا انجام آزمایش داخل فریزر 70- درجه سانتی گراد نگهداری گردید (5، 6).

آزمایش الایزا: پس از آماده‎سازی نمونه‎ها طبق دستورالعمل کیت (کیت الایزای تشخیص‌‌ آنتی‌ژن تب برفکی IZSLER Brescia، ایتالیا) آزمایش ساندویچ الایزای غیر‌مستقیم  انجام شد. متوسط OD هر نمونه پس از کسر OD (Blank) در‌صورتی‌که عدد 1/0 یا بیشتر بود نمونه مثبت تلقی گردید.

جدا­سازی ویروس: جهت جداسازی ویروس، از سلول کلیه خوک IB-RS-2 استفاده شد. پس از عمل جذب ویروس، برای رشد سلول از محیط کشت سلولی ایگل کامل Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) حاوی 2 درصد سرم جنین استفاده شد. مدت‌زمان انکوباسیون برای کنترل و دیدن CPE برای هر پاساژ ­48 ساعت بود. نمونه‌های منفی تا 3 پاساژ کشت داده شدند (7).

بررسی مولکولی ((RT-PCR‌: از کیت (QIAamp® Viral RNA Mini‌، GmBh، آلمان) جهت استخراج RNA استفاده شد. طبق پروتکل، کیت‌ استخراج‌، برچسب‌گذاری و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری گردید. به‌منظور انجام RT-PCR و جهت توالی‌یابی‌VP1 ، واکنش یک‌مرحله‌ای مطابق با استاندارد آزمایشگاه مرجع جهانی تب برفکی با استفاده از پرایمر جلوبر ‌O-1C244F GCAGCAAAACACATGTCAAACACCTT-3') (5'- و پرایمر معکوسGACATGTCCTCCTGCATCTG-3')  NK-61 (5'- و با استفاده از کیت QIAGEN انجام شد. همچنین برای تعیین تیپ از پرایمر جلوبر O-F1 (CCGAGACAGCGTTGGATAACA) و پرایمر معکوس O-R1 (CCATACTTCCAGTTCCCGTTGT) استفاده شد (4).

خالص‌سازی و تعیین توالی اسید نوکلئیک: به‌منظور خالص‌سازی محصول PCR از کیت (Roche/Germany) و برای انجام تعیین توالی از پرایمر جلوبر O1-C (AATTACACATGGCAAGGCCGACGG) و پرایمر معکوس NK72 (GAAGGCCCCAGGGTTGGACTC) استفاده شد‌.

تشخیص ویروس و تیپ‌های ویروس تب برفکی با استفاده ازReal Time PCR : RNA استخراج‌شده به شیوه‌ای که به آن اشاره شد، برای شناسایی حضور ویروس تب برفکی به کمک پرایمرها و پروب اختصاصی منطقه 3D ژنوم تب برفکی انجام شد. سپس نمونه‌های مثبت جهت تعیین تیپ به روش Multiplex Real Time PCR آزمایش شدند‌. پس از اتمام آزمایش نتیجه با استفاده از نرم‌افزار دستگاه و آنالیز در کانال Fam,Yellow, Red بررسی و نتیجه ثبت گردید.

بررسی میزان شباهت‌‌ آنتی‌ژنیسیته ویروس در گردش با ویروس واکسن Relationship value (R-value): بدین منظور از آزمایش دو‌بعدی خنثی‌سازی ویروس (‌‌‌‌Two Dimensional Virus Neutralisation Test‌) با استفاده از سرم معلوم سویه واکسن که تیتر‌‌ آنتی‌بادی همولوگ آن از پیش تعیین شده است، انجام شد. در تیتر درصد TCID50 بر میلی‌لیتر در برابر دُز مشابه از ویروس‌های هترولوگ در گردش در مزرعه استفاده گردید بنابر‌این سرم و ویروس استاندارد (‌استفاده‌شده در واکسن) و ویروس جدا‌شده از مزرعه تیتر شدند‌. جهت تیتراسیون سرم، داخل چاهک‌های میکروپلیت 96 خانه‌ای به‌جز خا‌نه‌های ستون اول مقدار 50 میکرو‌لیتر محیط ایگل کامل حاوی 2 درصد سرم جنین ریخته و مقدار 100 میکرو‌لیتر از نمونه سرم خالص به دو خانه ابتدایی ستون اول منتقل و رقت‌های متوالی تا آخرین ستون تهیه گردید. به تمام خانه‌‌ها مقدار 50 میکرو‌لیتر ویروس همولوگ حاوی درصد TCID50 ‌بر میلی‌لیتر واحد ویروسی اضافه گردید و در انکوباتور حاوی 5 درصد CO₂، به‌مدت 1 ساعت بر روی شیکر قرار داده شد. به هر‌یک از خانه‌‌ها مقدار 50 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی حاوی 10⁶ سلول بر میلی‌لیتر سلول BHK21 کلون H9 رازی اضافه، به انکوباتور منتقل و به‌مدت 72 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. پس از گذشت 72 ساعت میکروپلیت‌‌ها توسط میکروسکوپ غیر‌مستقیم بررسی و نتایج ثبت و در‌نهایت تمام چاهک‌‌ها توسط محلول رنگی حاوی متیلن بلو، آمیدو بلاک و اسید سیتریک رنگ‌آمیزی گردید. تیتر سرم بر‌اساس آخرین رقتی که 50 درصد خانه‌های آن سالم باقی مانده با روش Reed and Muench محاسبه شد. کنترل سرم، کنترل ویروس‌، کنترل سلول و کنترل محیط در نظر گرفته و ویروس مورداستفاده هم‌زمان در میکروپلیت جداگانه تیتر شد. برای تیتراسیون از ویروس‌هایی که قبلاً تیتر آن را داشتند (5/5-10) رقت‌های یک‌دوم از 5/2-10 تا 5/4-10 تهیه شد. برای هر رقت 8 چاهک استفاده و به هر‌یک از چاهک‌‌ها سلول IBRS-2 افزوده و به‌مدت 72 ساعت گرمخانه‌گذاری گردید. اگر ویروس به اندازه کافی رشد می‌کرد، سلول‌‌ها می‌مردند (CPE). برای محاسبه، جمع خانه‌هایی که CPE 100در‌صد داشتند بر تعداد چاهک‌هایی که برای هر رقت استفاده شده (8 چاهک)، تقسیم و عدد به‌دست‌آمده منهای 5/0 و سپس ضربدر 3/0 شد و با رقتی که درصد چاهک‌‌ها CPE ایجاد کرده بود، جمع گردید. جهت محاسبه میزان شباهت‌‌ آنتی‌ژنتیکی ویروس در گردش با ویروس واکسنRelationship value (R-value) تیتر ویروس به‌دست‌آمده از ویروس در گردش پس از  VNدر برابر سرم مرجع، منهای تیتر ویروس به‌دست‌آمده از ویروس واکسن پس از  VNدر برابر سرم مرجع محاسبه و سپس‌‌ آنتی‌لوگاریتم گرفته شد.

روش‌های تجزیه‌و‌تحلیل داده­ها و نرم­افزار­های مورد‌استفاده: در این بررسی ملاک قضاوت در‌مورد آلوده بودن نمونه­ها از کانون‌های مشکوک، نتایج آزمایشات ELISA یا Real -Time PCR می­باشد. توزیع نتایج به‌دست‌آمده بر‌اساس نام شهرستان و ماه جداسازی به‌صورت فراوانی نسبی تهیه شد. همچنین از سیستمBlast   در پایگاه NCBI برای جست‌وجوی اسید­های نوکلئیک مشابه با توالی­های نوکلوتیدی به‌دست‌آمده و در برخی موارد برای تعیین درصد تشابه استفاده شد. برای مقایسه اسید­های نوکلئیک ویروس‌های تعیین توالی‌شده و تعیین درصد تشابه نوکلوتید­ها، همچنین رسم دندروگرام‎ها از نرم‌افزار‌های BioEdit و MEGA-X استفاده گردید.

نتایج

نتایج حاصل از الایزا و‌Real Time: در سال 1400 از تعداد 40 نمونه موردآزمایش، 14 نمونه برای گاو و 4 نمونه برای گوسفند مثبت بود و در سال 1401 از تعداد 14 نمونه موردآزمایش، 5 نمونه متعلق به گاو و 1 نمونه متعلق به گوسفند مثبت بود که همه نمونه‎های موردآزمایش سال 1400 و 1401 تیپ O تشخیص داده شدند.

نتایج حاصل از آزمایش کشت سلولی‌: از 9 ویروس جدا‌شده در کشت سلولی در سال 1400، تعداد 7 نمونه گاوی و 2 نمونه گوسفندی بود؛ از 7 ویروس جدا‌شده در سال 1401، تعداد 5 نمونه گاوی و 2 نمونه گوسفندی بود که تمام نمونه‌‌ها با الایزا و Real Time PCR تیپ O تشخیص داده شدند.

نتایج حاصل از بررسی مناطق مشکوک و آلوده به بیماری تب برفکی در فصل‌های سال‌: نتایج نشان داد در بهار، تابستان، پاییز و زمستان 1400 به‌ترتیب 44/44، 56/5، 33/33، 67‌/16 درصد و در سال 1401 به‌ترتیب 67/16، 0، 50 و 33/33 درصد‌ می‌باشند.

نتایج حاصل از تعیین توالی اسیدهای نوکلئیک 5 ویروس تب برفکی تیپ O تعیین توالی‌شده‌: نتایج با استفاده از پرایمر‌های اختصاصی (جدول 1) نشان داد ویروس O/IRN/KHO/1/2022 (جدول2) بیشترین تشابه (5/98 درصد) را با ویروس O/IRN/KHO/3/2022 و ویروس O/IRN/KHO/7/2022 کمترین تشابه (7/90 درصد) را با ویروس O/IRN/KHO/4/2022 دارد (‌جدول 3، نمودار1).

نتایج حاصل از بررسی قرابت‌‌ آنتی‌ژنیسیته ویروس‌های جدا‌شده در سال‌های 1400 و 1401 با ویروس مرجع واکسینال (ویروس به‌کار‌رفته در واکسن): نتایج نشان‌ داد در هر 5 موردمحاسبه ضریب شباهت‌‌ آنتی‌ژنتیکی ویروس در گردش با ویروس واکسن (R-value) بزرگتر از 3/0‌ می‌باشد.

بحث

بیماری تب برفکی بسیار واگیر‌دار است، بنابراین به‌منظور سیاست‌گذاری برای مبارزه با بیماری، تشخیص سریع آن بسیار ضروری می‌باشد. یکی از راه‌های مهم کنترل بیماری استفاده از واکسن‌ می‌باشد. اثر‌بخشی واکسن‌های مورد‌استفاده‌ می‌تواند اطلاعات با‌ارزشی برای برنامه‌ریزی جهت کنترل بیماری فراهم کند (8). در مطالعه حاضر 52/34 درصد از نمونه­های مشکوک مثبت تشخیص داده شدند. از این تعداد 33/33 درصد متعلق به گوسفند و 67/66 درصد متعلق به گاو‌ می‌باشد. تمام سروتیپ‌های تشخیص داده‌شده تیپO  می‌باشند. طبق گزارش آزمایشگاه مرجع جهانی (WRL) در سال 2023 تمام ویرو‌س‌‍‌های تب برفکی سال 2022 در ایران تیپO ‌ می‌باشند (9). هم‌اکنون آزمایش الایزا یکی از مهم‌ترین و معتبرترین آزمایش­های تشخیصی برای ویروس تب برفکی است. Real Time PCR و RT-PCR آزمایش‌هایی می‌باشند که توانایی شناسایی مقادیر اندک ژنوم ویروسی موجود در نمونه را دارند و می­توانند به‌عنوان جایگزین سریع و ساده برای آزمایش کشت سلولی مطرح شوند. آنتی­ژن و RNA شناسایی‌شده در الایزا و RT-PCR الزاماً بیانگر وجود ویروس عفونی نیست و ممکن است ویروس‌های گرفته‌شده با آزمایش الایزا مثبت تشخیص داده شوند، اما در کشت سلولی رشد نکنند (4، 7).

مطالعه Zibaee و همکاران در سال 2006 نشان‌ داد آزمایش RT-PCR آزمایش معتبری برای تشخیص ویروس تب برفکی است (10). نتایج میزان تشابه اسیدهای نوکلئیک ویرو‌س‌های جدا‌شده با ویروس به‌کار‌رفته در واکسن MN539142.1 /O/IRN/93/2016  بیشتر از 5/87 درصد‌ می‌باشد. بنابراین احتمال اینکه تفاوت سویه در گردش در مزرعه چنان باشد که واکسن با سویه به‌کار‌رفته نتواند ایمنی لازم را ایجاد کند بسیار کم و نزدیک به صفر است (نتیجه R-Value به‌دست‌آمده تأیید‌ می‌کند). نتایج حاصل از بررسی قرابت‌‌ آنتی‌ژنیسیته ویروس‌های جدا‌شده از استان در سال‌های 1400 و 1401 با ویروس مرجع واکسینال (ویروس به‌‎کار‌رفته در واکسن مؤسسه رازی) نیز این مورد را تأیید کرد. به‌طور کلاسیک ویروس تب برفکی تیپ O به 11 تیپ‌‌ آنتی‌ژنیک تقسیم­ می‌شود (11). با‌توجه‌به جایگزینی تیپ O سویه Pan-Asia در خاورمیانه می‌توان حدس زد این ویروس­ها از سویه پان آسیا و عضوی از توپوتیپ خاورمیانه ـ جنوب‌شرقی آسیا (Middle East - Southeast Asia topotype) باشند. هم‌اکنون مشخص شده است دگرگونی آنتی­ژنیک در سروتیپ O از آنچه تصور می­شده وسیع­تر نیست و چند سویه واکسن به‌طور نسبی قادر به محافظت علیه بیشتر همه‌گیری­ها می‌باشند. مگرآنگه اختلاف ژنتیکی آن‌قدر زیاد باشد که اجازه دسته‌بندی در چندین دودمان جداگانه را بدهد (12). ویروس­های دارای RNA به‌دلیل اینکه قدرت بهره­جویی از مکانیسم اصلاح اشتباه در حین نسخه‌برداری و تکثیر ژنومی را ندارند، میزان موتاسیون (1 درصد در سال) در آن‌ها زیاد است. این میزان تغییرات بسیار زیادتر از آن است که در عمل در جامعه دامی در ویروس در حال گردش اتفاق‌ می‌افتد و این شاید به دلایل برآورد زیاد میزان موتاسیون، موتاسیون‌های بی‌اثر و قدرت عفونت‌زایی تعداد کم ویروس­های جهش‌یافته باشد و اینکه بسیاری از موتاسیون‌ها در جایگاه تأثیرگذار‌‌ آنتی‌ژنتیکی نمی‌باشند (13).

اداره کل دامپزشکی خراسان رضوی بیان‌ می‌کند طی سال‌های 1398 و 1399، 50 در‌صد از نمونه­هایی که در گاو آلوده تشخیص داده شده­اند، تیپO  ویروس تب ­برفکی بودند و این میزان در گوسفند، 1/72 درصد نمونه­های تأیید‌شده‌ می‌باشد. نتایج به‌دست‌آمده با نتایج  Zibaee و همکاران در سال 2007 همخوانی دارد (4). نتایج بررسی قرابت‌‌ آنتی‌ژنیسیته ویروس‌های جدا‌شده نشان‌ داد در هر 5 مورد‌، ضریب شباهت‌‌ آنتی‌ژنتیکی ویروس در گردش با ویروس واکسن (R-value) بزرگتر از 3/0‌ می‌باشد. این امر حاکی از آن است که واکسن ساخت مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی قدرت محافظت‌کنندگی در برابر ویروس همولوگ را دارد. طبق گزارش اداره کل دامپزشکی استان خراسان رضوی، دامدارها علاوه‌بر واکسن پلی‌والان رازی از واکسن‌های ساخت کشور‌های خارجی (واکسن تب‌های برفکی رکشا واک هند، آفتو واک ترکیه، مریال و وتاک) استفاده‌ می‌کنند‌. پیشنهاد‌ می‌شود با برگزاری جلسات ترویجی مناسب به دامداران توصیه شود به دلایل ذکر‌شده از واکسن ساخت کشور استفاده کنند و هر 2 تا 3 سال بررسی قرابت‌‌ آنتی‌ژنیسیتی ویروس‌های در گردش با ویروس‌های واکسینال انجام شود. درمورد کانون­های درگیر چنین به نظر‌ می‌رسد که طبق گزارش اداره کل دامپزشکی استان، تعداد کانون­های مشکوک (براساس علائم بالینی و ارسال نمونه) از تعداد متناسبی برخوردار‌ می‌باشند و آنچه از بروز بیماری طی 1 سال رخ داده طبق موارد قابل‌انتظار بوده است. این امر تأیید‌کننده نتایج حاصل از مطالعه حاضر‌ می‌باشد که بنا‌بر بررسی ژنتیکی و‌‌ آنتی‌ژنتیکی واکسن مصرفی ساخت مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی قدرت محافظتی مناسبی را نشان داده است.

نکته قابل‌ذکر این است که OIE بر انجام واکسیناسیون جمعیت گاوی تأکید می‌کند و معتقد است با کنترل بیماری در گاو، بیماری در جمعیت گوسفندی خودبه‌خود کنترل می­شود، اما علی‌رغم این توصیه باید توجه کرد که در کشور ما جمعیت نشخوارکنندگان کوچک حدوداً 10 برابر جمعیت گاوی است و به‌علت فرهنگ دامداری در منطقه و وجود دام­های عشایری، می­بایست برای جمعیت گوسفندی و واکسیناسیون آن اهمیتی ویژه قائل شد. باید توجه کرد که گوسفند و بز می­توانند در اپیدمیولوژی تب برفکی نقش خطرناکی داشته باشند، چرا‌که نشانه بیماری در این حیوانات معمولاً فاقد علائم بالینی واضح است و یا با علائم بسیار خفیف همراه می­باشند (1، 4). اگر­چه اولویت برنامه­ کنترلی بر روی مایه­کوبی سراسری در جمعیت گاو و گوساله متمرکز می­باشد، به نظر می­رسد به‌دلیل نقش گوسفند در اپیدمیولوژی بیماری اسکان عشایر و یا پوشش واکسیناسیون کامل جمعیت دامی آن­ها بتواند گامی مؤثر در کنترل بیماری تب برفکی باشد. گسترش ویروس تب برفکی در روسیه، قزاقستان و مغولستان که عاری از ویروس گزارش شده بودند در سال‌های 2021 و 2022 نتایج نشان داد این جدایه‌ها متعلق به زیرشاخه O/ME-SA/Ind-2001 می‌باشند. بنابراین با‌توجه‌به حرکت فرامرزی و جهانی ویروس O، به‌منظور توسعه استراتژی‌های به‌موقع و آماده‌سازی واکسن جهت مطابقت با تنوع ژنتیکی، یک برنامه مناسب برای نظارت بر بیماری تب برفکی در کشورهای دارای دامداری پیشرفته نیاز است (14).

نتیجه‌گیری نهایی: در‌مورد کانون­های درگیر در استان چنین به‌ نظر‌ می‌رسد که طبق گزارش اداره کل دامپزشکی تعداد کانون­های مشکوک (براساس علائم بالینی و ارسال نمونه) از تعداد متناسبی برخوردار‌ می‌باشد و آنچه از بروز بیماری طی 1 سال رخ داده، قابل‌انتظار بوده است. این امر تأیید‌کننده نتایج حاصل از مطالعه حاضر است که واکسن مصرفی ساخت مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی قدرت محافظتی مناسبی در استان نشان داده است.

سپاسگزاری

از اعضای محترم کمیته علمی مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی جهت تصویب طرح مشترک با اداره کل دامپزشکی استان خراسان رضوی و آقای سیادتی‌فر تشکر و قدردانی می­‌گردد.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.