مقدمه

قارچ‌ها یکی از مهم‌ترین عوامل بیولوژیک دخیل در فساد مواد غذایی به شمار می‌آیند که با تولید سموم مختلف، تهدید‌کننده جدی سلامت انسان می‌باشند (1). آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس از‌جمله قارچ‌های رشته‌ای می‌باشند که روی انواع فراوانی از مواد آلی فاسد‌شدنی یافت می‌شوند (2). ظهور گونه‌های قارچی مقاوم و عوارض جانبی داروهای ضد‌قارچی، محققین را به گسترش روش‌های جدید درمانی علیه قارچ‌ها وادار کرده است. مایکوتوکسین‌ها متابولیت‌های ثانویه سمی می‌باشند که برای اعمال طبیعی سلول‌ها ضروری نمی‌باشند. یک گونه‌ قارچ ممکن است مایکوتوکسین‌های مختلف یا مایکوتوکسین شبیه سایر گونه‌ها را تولید کند. اگر شرایط مطلوب باشد، قارچ‌ها زیاد می‌شوند و میزان مایکوتوکسین نیز افزایش می‌یابد.

یکی از مهم‌ترین مایکوتوکسین‌ها، آفلاتوکسین است. آفلاتوکسین‌ها ترکیبات سرطان‌زای قوی می‌باشند که به‌عنوان متابولیت‌های ثانویه به‌وسیله‌ برخی سویه‌های آسپرژیلوس فلاووس، پارازیتیکوس، نومیوس و تاماری تولید می‌شوند (3). حداقل 4 تیپ مختلف آفلاتوکسین در طبیعت تولید می‌شود. آفلاتوکسین‌های B₁ و B₂ به‌وسیله آسپرژیلوس فلاووس و پارازیتیکوس تولید می‌شوند که آفلاتوکسین B₁ سمی‌ترین نوع آفلاتوکسین است. آفلاتوکسین‌های G₁ و G₂ منحصراً به‌وسیله آسپرژیلوس پارازیتیکوس تولید می‌شوند. آفلاتوکسین‌های M₁ و M₂ در شیر گاوهایی که از دانه‌های قارچی تغذیه می‌کنند، وجود دارند. آفلاتوکسین M₁ متابولیت آفلاتوکسین B₁ در انسان‌ها و حیوانات است و آفلاتوکسین M₂ متابولیت آفلاتوکسین B₂ در شیر گاوهایی است که از غذای آلوده تغذیه می‌کنند. در معرض قرار گرفتن با مقدار زیاد آفلاتوکسین باعث نکروزه شدن شدید کبدی و در‌نهایت سرطان کبد می‌شود. آسیب‌های شدید کبدی با خونریزی، ورم، تغییر در هضم و جذب یا سوخت‌و‌ساز مواد غذایی و تغییرات ذهنی و از دست دادن هوشیاری همراه است. داروهای گیاهی نسبت به داروهای شیمیایی به‌علت داشتن منشأ طبیعی، سازگاری بیشتری با ارگانیسم‌های زنده از‌جمله بدن انسان دارند (4). استفاده از گیاهان دارویی و عصاره آن‌ها به‌دلیل عدم عوارض جانبی، در دسترس بودن و همچنین قیمت نسبتاً پایین در حال گسترش است. با‌توجه‌به محدود بودن و گران بودن داروهای ضد‌قارچی موجود در بازار و اثرات سوء شیمیایی و همچنین ایجاد مقاومت دارویی، می‌توان به عصاره گیاهان به‌عنوان داروی مؤثر ضد‌قارچی اعتماد داشت (5).

از‌آنجایی‌که مصرف ترکیبات گیاهی هیچ‌گونه تأثیر منفی به جای نمی‌گذارد، می‌توان شرایط آزمایشگاهی برون‌تن را به شرایط بدن یا درون‌‌تن تعمیم داد (6). کارواکرول ترکیب اصلی گیاهانی، مانند مرزنجوش، آویشن و ترنج وحشی است و خواص مفید این گیاهان نیز به‌دلیل وجود همین ترکیب است. کارواکرول خواص درمانی فراوانی دارد. کارواکرول به‌عنوان ماده آنتی‌اکسیدان، ضد‌استرس اکسیداتیو و ضد‌التهاب قوی شناخته شده است و همچنین اثرات حفاظت نورونی، کبدی و کلیوی این ماده پلی‌فنولیک در مدل بیماری‌های مختلف مشخص شده است (7، 8). علاوه‌بر‌این کارواکرول تجمع پلاکتی را مهار می‌کند، قادر است مسیرهای سیگنالینگ درگیر در التهاب و پرولیفراسیون سلولی را نیز تعدیل کند. نقش حفاظتی کارواکرول در بعضی از دستگاه‌های بدن ازجمله سیستم تنفس، گوارش و غدد نیز گزارش شده است (9). خواص ضد‌قارچی متعددی درخصوص اثرات ضد‌قارچی گیاهان دارویی مانند شوید، آویشن، گشنیز و گل محمدی بر روی برخی از گیاهان، مانند کلاله زعفران، گیاه خرزهره، اکالیپتوس، مرزنجوش، پیاز، دارچین، زردچوبه، مریم‌گلی، نعناع و همیشه‌بهار اثبات شده است (10، 11). نتایج مطالعات نشان می‌دهد کارواکرول توانایی بالایی در کنترل رشد قارچ‌های آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس و تولید سم توسط آن‌ها دارد (12).

قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس از‌جمله میکروارگانیسم‌های آلوده‌کننده مواد غذایی است که با تولید آفلاتوکسین باعث اثرات زیان‌باری بر انسان و حیوان می‌شود. از‌جمله راه‌های کنترل این قارچ‌ها جلوگیری از رشد و کنترل آن‌ها بر روی بستر است. کارواکرول را در بازدارندگی از رشد و توکسین‌زایی قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس ارزیابی کردند. نتایج حاصل، حاکی از اثر ترکیبات فوق به‌عنوان ترکیب قارچ‌کش و نگهدارنده ایمن مواد غذایی است (13).

مطالعات فارماکولوژیکی نشان داده‌اند پتانسیل بالا یا آنتی‌اکسیدانی کارواکرول به‌دلیل وجود ترکیبات فنولی، مانند اریگانوزاید است (14، 15). با وجود تمام مزایا، کاربرد ترکیبات گیاهی با چالش‌های جدی ازجمله اثرگذاری نامطلوب بر ارگان‌های غیر‌هدف و اکسید شدن برخی مواد همراه است. کارواکرول در آب نامحلول ولی در الکل و اتر حل می‌شود (16، 17). مطالعات محققین نشان می‌دهد کارواکرول به‌صورت مولکول‌های کوچک و چربی‌دوست است که به‌راحتی از سد خونی مغزی عبور کرده و اثرات خود را بر قسمت‌های مختلف مغز اعمال می‌کند (18، 19). همچنین نتایج مطالعات در محیط آزمایشگاهی ((in vitro و در داخل بدن موجود زنده in vivo)) نشان می‌دهد که کارواکرول دارای خواص مختلف بیولوژیکی و دارویی، مانند آنتی‌اکسیدان، ضد‌باکتری، ضد‌قارچ، ضد‌سرطان، ضد‌التهاب، هپاتواستروئید و اسپاسمولیتیک بودن و همچنین شل‌کننده عروق است (20). با‌توجه‌به خواص متعدد کارواکرول، در طی مطالعه حاضر سعی شده است تا اثر کارواکرول و نانوامولسیون این ترکیب بر مهار رشد و میزان کشندگی این ترکیب در قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس به روش میکرودایلوشن بررسی شود.

مواد و روش کار

تهیه کارواکرول: کارواکرول آماده به‌عنوان ترکیب اصلی اسانس مرزنجوش از شرکت سیگما کشور انگلیس تهیه شد.

سنتز نانوامولسیون حاوی کارواکرول: بدین‌ منظور ابتدا 2/0 میلی‌لیتر کارواکرول (سیگما، انگلیس) و 8/0 میلی‌لیتر سورفکتانت توئین 80 درصد (مرک، آلمان) با یکدیگر ترکیب و با سرعت 250 دور در دقیقه به‌مدت 10 دقیقه هم زده شد. 33/2 میلی‌لیتر آب دیونیزه به آن اضافه و مخلوط حاضر مجدداً به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 250 دور در دقیقه همگن شد. سپس امولسیون حاصله به‌مدت نیم‌ساعت با قدرت 60 کیلوهرتز تحت التراسونیک قرار گرفت. جهت تأیید نانوامولسیون کارواکرول از آزمایش‌های DLS و تحلیل Zeta و برای بررسی اندازه و شکل ذرات از میکروسکوپ الکترونی روبشی استفاده شد (21، 22).

ارزیابی ویژگی‌های نانوامولسیون کارواکرول تهیه‌شده: جهت تعیین سایز نانوامولسیون سنتز‌شده از تحلیل DLS استفاده شد. همچنین جهت تعیین نوع بار سطحی و میزان پایداری، تحلیل Zeta بر روی نمونه انجام شد. به‌منظور تعیین مورفولوژی کروی ذرات نانو و میانگین اندازه ذرات از میکروسکوپ SEM استفاده شد (23).

تهیه آسپرژیلوس پارازیتیکوس: آسپرژیلوس پارازیتیکوس سویه PTCC 5018 از مرکز کلکسیون میکروارگانیسم‌های صنعتی ایران تهیه گردید. سپس در محیط کشت اختصاصی سابرو دکستروز آگار به‌مدت 7 روز در دمای 28 درجه سانتی‌گراد کشت داده شد (24). بعد از رشد انبوه و کنیدی‌زایی قارچ، با افزودن 9/0 گرم سدیم کلراید به 1 لیتر آب‌مقطر، سرم فیزیولوژی حاصل همراه با توئین 80 درصد به محیط کشت اضافه شد و با ایجاد خراش در شرایط استریل روی محیط کشت، سوسپانسیون قارچ‌ها به دست آمد و توسط لام نئوبار و زیر میکروسکوپ، شمارش کنیدی‌ها انجام شد. کنیدی‌ها در غلظت شمارش کلنی بر میلی‌لیتر 10⁶×1 تنظیم شدند. در تمام مراحل کار از این سوسپانسیون استفاده شد.

تعیین حداقل غلظت مهار‌کننده (MIC) از رشد به روش میکرودایلوشن: براساس پروتکل مرجع CLSI روش میکروپلیت دایلوشن و پلیت 96 خانه جهت تعیین MIC نانو‌امولوسیون حاوی کارواکرول و کارواکرول خالص استفاده شد. میزان غلظت ترکیب خالص به‌صورت 100 درصد و از غلظت 01/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر برای نانو کارواکرول استفاده گردید. به‌طور خلاصه ابتدا، کشت 7 روزه قارچ در محیط کشت اختصاصی سابورو دکستروز آگار در دمای 28 درجه سانتی گراد تهیه گردید. به‌منظور تعیین MIC، ابتدا 100 میکرولیتر از محیط RPMI1640 در هر‌یک از گوده‌های پلیت 96 خانه ریخته شد. سپس 100 میکرولیتر از غلظت پایه ترکیبات مورد‌آزمایش بر روی اولین گوده پلیت 96 خانه ریخته شد و از آن رقت‌های سریال دوتایی (از 5000 الی 7/9 غلظت ماده در 1 میلیون برای کارواکرول و از 500 الی 97/0 غلظت ماده در 1 میلیون برای نانوکارواکرول) تا گوده 10 تهیه گردید. در‌نهایت به تمام گوده‌ها از شماره 1 تا 11، 100 میکرولیتر از سوسپانسیون قارچی با غلظت 10⁶ کنیدی در میلی‌لیتر اضافه شد. گوده 12 به‌عنوان کنترل منفی و گوده 11 به‌عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد. سپس پلیت 96 خانه 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. در پایان آخرین گوده‌ای که رشدی در آن دیده نمی‌شد، به‌عنوان MIC در نظر گرفته شد. تمام آزمایش‌ها در 3 تکرار انجام شد.

تعیین حداقل غلظت کشندگی کارواکرول و نانوامولسیون کارواکرول (MFC): بعد از انکوباسیون جهت تعیین MFC مقدار 20 میکرولیتر از محتوای گوده MIC و 2 گوده قبل از آن، برداشته و در محیط سابورو دکستروز آگار کشت داده شد و 48 ساعت در انکوباتور و در 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. بالاترین رقت موجود از عصاره که رشد قارچ در آن مشاهده نشد به‌عنوان MFC در نظر گرفته شد.

نسبتMFC  به MIC: میانگین تأثیرات مهاری رشد و قارچ‌کشی کارواکرول و نانوکارواکرول نسبت به آسپرژیلوس پارازیتیکوس برحسب میلی‌گرم بر میلی‌لیتر محاسبه شد و بررسی اثر بر قارچ تحت آزمایش به دست آمد. چنانچه این نسبت بالاتر یا مساوی 4 باشد، ترکیب مورد‌نظر مهارکننده قارچ و در‌صورتی‌که پایین‌تر از 4 باشد، ترکیب مورد‌نظر قارچ‌کش در نظر گرفته می‌شد.

تجزیه‌و‌تحلیل آماری نتایج: تمام آزمایش‌ها در 3 تکرار انجام شد. داده‌ها به‌صورت میانگین‌±خطای استاندارد (SE) نمایش داده شدند. به‌منظور تجزیه‌و‌تحلیل داده‌های حاصل از مطالعه حاضر از نرم‌افزار SPSS نسخه 21 و آزمون تحلیل واریانس دو‌طرفه استفاده شد (05/0<‌P).

نتایج

ارزیابی ویژگی‌های نانوامولسیون کارواکرول تهیه‌شده: جهت تعیین سایز نانوامولسیون سنتز‌شده از تحلیل DLS استفاده شد. طبق نتیجه حاصله، نمونه دارای اندازه 5/88 نانومتر است که بنا‌بر نتایج اعلام‌شده در مقالات متعدد، به مقدار ایدئال نزدیک است (جدول 1).

همچنین جهت تعیین نوع بار سطحی و میزان پایداری، تحلیل Zeta بر روی نمونه انجام شد. طبق نتیجه حاصله نوع بار سطحی منفی است که به ماده امولسیون‌کننده بستگی دارد و میزان بار سطحی آن 5/16 میلی‌ولت است که در مقیاس قابل‌قبول است (جدول 2). تصاویر SEM، مورفولوژی کروی ذرات و میانگین اندازه ذرات را حدود80 نانومتر نشان داد (تصویر 1).

تعیین حداقل غلظت مهار‌کننده رشد (MIC): حداقل غلظت مهار از رشد به عنوان کم­ترین غلظتی از نانوامولسیون و اسانس مورد مطالعه که قادر  به جلوگیری از رشد قارچ مورد مطالعه است، تعریف می­شود. نتایج بررسی MIC نانوامولوسیون حاوی کارواکرول و کارواکرول خالص با روش میکروپلیت دایلوشن برای قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس تعیین شد. بررسی نتایج نشان داد حداقل غلظت مهارکنندگی رشد قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس در حضور نانوکارواکرول 97/0 میکروگرم بر میلی‎لیتر و کارواکرول خالص 97 میکروگرم بر میلی‎لیتر است.

تعیین حداقل غلظت کشندگی نانوامولسیون کارواکرول (MFC): حداقل غلظت کشندگی ترکیبات مورد‌استفاده  (MFC)در حضور نانو‌کارواکرول 9/3 میکروگرم بر میلی‎لیتر و کارواکرول تنها 390 میکروگرم بر میلی‎لیتر به دست آمد.

تعیین نسبت MFC/MIC: در مطالعه حاضر نسبت MFC به MIC در هر 2 ترکیب کارواکرول و نانوکارواکرول علیه قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس برابر با 4 بود که می‌توان گفت هر 2 ترکیب خاصیت مهار رشد قارچ (فانجیستات) را دارند.

تعیین ویژگی‌های نانو‌امولسیون کارواکرول: طبق نتیجه حاصله، نمونه دارای اندازه 5/88 نانومتر بود که بنا‌بر نتایج اعلام‌شده در مقالات متعدد، به مقدار ایدئال نزدیک بود (جدول 1). طبق نتیجه حاصله نوع بار سطحی هیست بود که به ماده امولسیون‌کننده بستگی داشت و میزان بار سطحی آن 5/16 میلی‌ولت بود که در مقیاس قابل‌قبول است (جدول 2). تصاویر SEM، مورفولوژی کروی ذرات و میانگین اندازه ذرات را حدود 80 نانومتر نشان داد (تصویر 1).

بحث

با‌توجه ‌به نتایج مطالعه حاضر، خاصیت ضدقارچی نانوامولسیون مورد استفاده به روش میکروپلیت دایلوشن علیه قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس کمتر از اسانس کارواکرول بوده است.

از نتایج مطالعه حاضر همراه با یافته‌های مطالعات تکمیلی جهت تولید داروهای حاصل از نانوکارواکرول و کارواکرول جهت درمان بیماری‌های ناشی از آسپرژیلوس پارازیتیکوس جدا یا همراه با داروهای شیمیایی می‌توان استفاده کرد (25-28).

Abbasi و همکاران در سال 2018 با ارزیابی فعالیت ضد‌قارچی اسانس‌های آویشن، رزماری و مرزه دریافتند که این ترکیبات قادر به بهبود تیتر آنتی‌بادی علیه ویروس نیوکاسل می‌باشند. همچنین استفاده از جیره‌های حاوی اسانس‌های آویشن، رزماری و مرزه سطح لیپوپروتئین با چگالی بالای سرم خون را افزایش و سطح لیپوپروتئین با چگالی پایین خون را کاهش داد. به‌علاوه غلظت‌های کلسترول و تری‌گلیسیرید در تیمار بدون آنتی‌اکسیدان افزایش معنی‌داری داشت. همچنین نسبت باکتری‌های اشرشیاکلی به لاکتوباسیل‌ها، در تیمارهای حاوی اسانس رزماری و آویشن نسبت به تیمار بدون آنتی‌اکسیدان کاهش معنی‌داری داشت (29). در مطالعه Shahvardi و همکاران در سال 2019 فعالیت ضد‌قارچی و قدرت مهار‌کنندگی و کشندگی اسانس گیاهان دارویی، شامل زیره سبز، رازیانه و گلپر ایرانی بر روی سم زرالنون خوراک دام بررسی شد. نتایج نشان داد اسانس این 3 گیاه دارای فعالیت ضد‌قارچی و قدرت مهار‌کنندگی و کشندگی بر روی سم زرالنون در شیرابه شکمبه گاو بود (30).

در مطالعه Qu و همکاران در سال 2021، اثر ضد‌میکروبی کارواکرول بر آسپرژیلوس فلاووس و کاهش بیان ژن aflr در مسیر بیوسنتز آفلاتوکسین بررسی شد. نتایج آزمایش‌های MIC و MFC نشان داد که کارواکرول به‌ترتیب در غلظت‌های 8/0 میکروگرم بر میلی‌لیتر و 5/3 میکروگرم بر میلی‌لیتر، به ترتیب قادر به مهار رشد قارچ به میزان 33 درصد و 67 درصد نسبت به غیاب کارواکرول است. نتایج مطالعه اشاره شده نشان داد که کارواکرول دارای فعالیت ضد‌میکروبی در مقابل آسپرژیلوس فلاووس نیز می‌باشد. نتیجه RT-PCR نشان داد سطح بیان ژن aflR هم کاهش می‌یابد (31). در مطالعه Zhang و همکاران در سال 2019، فعالیت ضد‌قارچی تیمول و کارواکرول در برابر پاتوژن‌های قارچ بوتریتیس سینرا بررسی شد. نتایج نشان داد تیمول و کارواکرول فعالیت ضد‌قارچی قوی علیه پاتوژن مورد‌نظر با حداقل غلظت بازدارنده و حداقل غلظت قارچ‌کش 65 میلی‌گرم در لیتر و 100 میلی‌گرم در لیتر برای تیمول و 120 میکرولیتر در لیتر و 140 میکرولیتر در لیتر برای کارواکرول از خود نشان دادند. تیمول و کارواکرول مورفولوژی بوتریتیس سینرا را با مختل کردن و تخریب میسلیوم از‌طریق میکروسکوپ الکترونی روبشی تغییر دادند. نفوذپذیری غشای بوتریتیس سینرا با افزایش غلظت 2 عامل شیمیایی تحریک شد. همچنین با افزایش رسانایی خارج‌سلولی، آزادسازی اجزای سلولی و کاهش pH خارج‌سلولی مشهود است. علاوه‌بر‌این، کاهش قابل‌توجهی در محتوای کل چربی سلول‌های بوتریتیس سینرا توسط 2 عامل شیمیایی ایجاد شد که نشان می‌دهد ساختارهای غشای سلولی تخریب شده‌اند؛ بنابراین نتایج حاضر نشان داد تیمول و کارواکرول می‌توانند به‌عنوان جایگزین مناسبی برای قارچ‌کش‌های معمولی علیه بوتریتیس سینرا در کنترل کپک‌های خاکستری در محصولات باغبانی استفاده شوند (32).

در مطالعه حاضر، نتایج آزمایش‌های MIC و MFC نانوکارواکرول به‌ترتیب در غلظت‌های 97/0 و 9/3 میکروگرم بر میکرولیتر مشاهده شد که نشان‌دهنده تأثیر قابل‌ملاحظه نانوذرات همراه با کارواکرول بود و تصاویر SEM، مورفولوژی کروی ذرات را همراه با نانوکارواکرول و میانگین اندازه ذرات را حدود80 نانومتر نشان داد.

نتیجه‌گیری نهایی: به‌طور‌کلی نتایج مطالعه حاضر اثر ضد‌قارچی ذرات نانو حاوی کارواکرول با برخورداری از ویژگی‌های مناسب فیزیکوشیمیایی افزایش پایداری دارو را روی آسپرژیلوس پارازیتیکوس ثابت کرد. تمام غلظت‌های استفاده‌شده از نانو‌کارواکرول تأثیر مهاری بر رشد قارچ داشتند، هم چنین در مطالعه حاضر حداقل غلظت میزان کشندگی نانو کارواکرول نسبت به کارواکرول بر سموم آفلاتوکسین قارچ بیشتر بود و می‌تواند نشان‌دهنده این موضوع باشد که مواد مؤثر نانو همراه با کارواکرول تأثیرگذاری بیشتری دارند و می‌تواند یک عامل ضد‌قارچ امیدوارکننده با اثرات ضد‌قارچ بالا و عوارض جانبی کم باشد.

سپاسگزاری

مطالعه حاضر، حاصل پایان‌نامه دکتری تخصصی تصویب و اجرا‌شده در دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران است (شماره گرنت: 30792/6/5).

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.