بررسی تغییرات صفات فیزیولوژیکی و بیان ژن‌های آنتی‌اکسیدانی درگیر در تحمل به تنش خشکی چهار ژنوتیپ گندم نان حساس و متحمل به تنش خشکی

. مقدمه

گندم مهمترین گیاه زراعی است که حدود 20 درصد از اراضی جهان به کشت آن اختصاص یافته است. مطابق گزارش سازمان خواروبار کشاورزی جهانی (FAO)، مصرف غلات جهان هفت میلیون تن (3/0 درصد) افزایش یافته است. همچنین پیش­بینی شده بود در سال 2018 سطح تولید غلات ایران به 1/20 میلیون تن برسد که این میزان اندکی بالاتر از تولید 6/19 میلیون تن آن در سال 2017 و 12 درصد بالاتر از میانگین پنج ساله خود است (FAO, 2018). گندم مورد نیاز برای تامین غذا در سال 2020 به 145 مگاتن رسیده است که شیب رشد آن نسبت به دهه گذشته، آهسته­تر است (FAO, 2011-2020).

تنش خشکی هرساله خسارت فراوانی را در محصولات زراعی ایجاد می­کند و موجب کاهش 17 درصدی عملکرد می­شود
 (et al., 2016 Hadi). برای غلبه بر تنش خشکی، گیاهان پاسخ­های گوناگونی از قبیل تولید اسمولایت (Osmolyte) برای تنظیم اسمزی و تغییر در بیان پروتئین­ها را نشان می‌‌‌دهند (Bohnert & Jensen, 1996) که نحوه سازوکار فیزیولوژیکی گیاهان در شرایط تنش را تغییر می­دهند (Tamura et al., 2003). در زمان رویارویی با تنش، گیاهان از مکانیسم­های متفاوتی جهت جاروب گونه­های اکسیژن فعال و حفاظت خود در برابر اثرات منفی این گونه­ها استفاده می­کنند (Ahmadi et al., 2018). گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو ایجاد­شده در طی تنش خشکی، دارای سیستم دفاعی با کارایی بالاتری هستند که می­تواند رادیکال­های آزاد را از بین برده و یا خنثی کنند. این سیستم دفاعی­شامل سوپراکسیددیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، آسکوربات­پراکسیداز (APX) و گلوتاتیون­ردوکتاز (GR) است و سیستم غیر آنزیمی شامل آسکوربات، توکوفرول، کاروتنوئیدها و ترکیبات متفرقه (از جمله فلاونوئیدها، مانیتول­ها و پلی فنل­ها) می باشد (Blokhin et al., 2003; Verma et al., 2014; Fita et al., 2015). گیاهان از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت برای افزایش تحمل در برابر تنش اکسیداتیو استفاده می‌کنند. مطالعات انجام‌شده نشان می‌دهد که فعالیت آنتی‌اکسیدان‌ها (نظیر آنزیم‌های پراکسیداز، سوپراکسید­دیسموتاز و کاتالاز) تحت تنش افزایش می‌یابد که نمایانگر مقاومت گیاه در مقابل تنش است (Parida & Das, 2005).Movludi et al.  (2014) در مطالعه اثرات کمبود آب و نیتروژن روی فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی و عملکرد دانه جو زراعی (Hordeum vulgare L.) گزارش کردند که فعالیت آنزیم­های کاتالاز، پراکسیداز و پلی­فنیل­اکسیداز در شرایط تنش خشکی افزایش می‌یابد.

تنش آبی سطوح پروتئینی گیاهان را تحت تاثیر قرار داده و نتایج ضد و نقیضی را به همراه داشته است؛ به­طوری­که برخی کاهش و گروهی افزایش در سطوح پروتئینی را تحت تنش آبی گزارش کرده­اند (Tod & Basler, 1965; Svensson et al., 2002; Marian et al., 2003). مشخص شده است که تحت تنش خشکی میزان پروتئین متصل­شونده به روبیسکو کاهش می­یابد (Aranjuelo et al., 2011). از طرف دیگر، تحت تنش کمبود آب انجام پاسخ به تنش از نظر پروتئین­ها دارای تنوع می­باشد و برخی پروتئین­ها تنها در رقم متحمل دیده می­شوند و پروتئین­های مشترک نیز بین ارقام متحمل و حساس دارای تغییر در نوع بیان هستند (Riccardi et al., 2004). علاوه بر این ارقام متحمل­تر به تنش خشکی، دارای فعالیت بهتر کنترل روزنه­ای هستند که این امر تحت تاثیر بیان یکسری پروتئین­های خاص انجام می شود و در مجموع به این ارقام اجازه تثبیت کربن درشرایط تنش، بهبود کارایی مصرف آب و فعالیت فتوسنتزی را می­دهد (Yordanov et al., 2000).

خشکی باعث تجمع گروه پیچیده­ای از پروتئینها می­شود که از سلول­ها در برابر خسارت­های ناشی از آن حفاظت می­کنند. این پروتئین­ها شامل چاپرون­ها، LEAs (Late embryogenesis abundants) و بازدارنده پروتئینازهای عمل­کننده (تقاطعی) (Intercepter proteinase) هستند. اگرچه بخش عمده­ای از پروتئین­های درگیر هنوز ناشناخته هستند (Bohnert & Jensen, 1996; Wang et al., 2004).

مطالعاتی که به منظور درک مکانیسم پاسخ به تنش خشکی انجام می­شود، در راستای توسعه ارقام متحمل گندم به تنش خشکی است. گیاهان به منظور رهایی از شرایط نامطلوب رشد، حفظ هموستازی، سم­زدایی عناصر مضر و بازیابی رشد، اقداماتی در سطوح فیزیولوژیکی و مولکولی را به اجرا می­گذارند (Rampino et al., 2006). با این وجود دانش حاضر در مورد ژن­های درگیر در مکانیسم پاسخ به تنش خشکی هنوز دارای محدودیت­هایی است (Bray, 2002). ترنسکریپتومیکس، پروتئومیکس و مطالعات بیان ژن، فعالیت و تنظیم نسخه­ها و پروتئین­های متعدد وابسته به تنش را تنظیم می­کند (Blomqvist et al., 2006). پروتئومیکس ابزار قدرتمندی برای تفکیک بافت­های پروتئینی و روشی مناسب برای بررسی تغییرات پروتئین­ها در پاسخ به تنش­ها و تغییرات محیطی به حساب می­آید (Tamura et al., 2003; Zang & Komatsu, 2007). با استفاده از پروتئومیکس می­توان اثر تنش­های غیر زیستی از جمله کمبود آب، شوری و دماهای بالا و پایین را با اطمینان کافی بررسی کرد (Zang & Komatsu, 2007). این رهیافت امکان تشخیص ژن­های جدید را در شرایط محیطی مختلف فراهم می­کند. تجزیه پروتئوم، روشی مستقیم برای تشخیص عمل ژن­ها است و تجزیه و تحلیل ارتباط پروتئوم با اطلاعات توالی ژنوم، در ژنومیک کاربردی یک راهبرد باارزش محسوب می­شود
 (Komatsu & Tanaka, 2004). در این راستا تجزیه و تحلیل پروتئینی روشی مستقیم برای تشخیص فعالیت ژنها محسوب می­شود و تجزیه ارتباط پروتئوم با اطلاعات توالی ژنوم راهبرد مهمی برای ژنومیکس کاربردی به شمار می­آید
 (Komatsu & Tanaka, 2004).

گزارش­ها نشان می­دهد سطح بالایی از تنوع ژنتیکی در بین گونه­های خویشاوندی گندم در پاسخ به شرایط تنش خشکی شدید وجود دارد (Byrt et al., 2014; Warschefsky et al., 2014; Masoomi-Aladizgeh et al., 2015;
 Pour-Aboughadareh et al., 2017)؛ از این­رو هدف از انجام این تحقیق، بررسی اهمیت نسبی صفات فیزیولوژیکی مؤثر بر عملکرد ژنوتیپ‌های مورد مطالعه و بررسی بیان برخی از ژن‌های آنتی­اکسیدانی درگیر در تحمل به تنش خشکی در ارقام متحمل و حساس به تنش خشکی بود.

2. روش­شناسی پژوهش

به­منظور بررسی صفات فیزیولوژیکی مؤثر بر عملکرد دانه و بیان نسبی ژن‌های مرتبط با تحمل به تنش خشکی، آزمایشی در سال زراعی 1396-1395 در مزرعه تحقیقاتی دانشگاه شهید مدنی آذربایجان (واقع در 35 کیلومتری جاده تبریز- مراغه با عرض جغرافیایی 37°46′59″ شمالی و طول جغرافیایی 45°54′14″ شرقی و ارتفاع 1318 متر از سطح دریای آزاد با اقلیم نیمه­خشک با زمستان­های سرد و یخبندان) تحت شرایط آبیاری مطلوب و تنش خشکی در زمان گلدهی به‌عنوان فاکتور B، با 4 ژنوتیپ گندم نان (جدول 1) به­عنوان فاکتور A تحت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح بلوک‌های کامل تصادفی با سه تکرار انجام گرفت. در این بررسی ارقام میهن، اروم به­عنوان ژنوتیپی که تا حدودی به تنش خشکی در مرحله شروع گلدهی در مناطق سرد متحمل است، در آزمایش­ها گنجانده شد.

جدول 1. شجره ارقام مورد مطالعه.

    کدهای C-93 مربوط به ژنوتیپ­های آزمایش یکنواخت سراسری URWYT سال 1393 مناطق سرد می­باشند.

عملیات آماده­‌سازی زمین، شامل انجام شخم، دیسک، تسطیح و ایجاد فارو در قطعه مورد نظر انجام شد. عمق کاشت بذور دو تا سه سانتی­‌متر در نظر گرفته شد. هر تکرار شامل هشت کرت بود. در هر کرت چهار ردیف از هر ژنوتیپ در عمق دو تا سه سانتی‌متر کاشته شد. طول خطوط کاشت دو متر، فاصله بین بذور دو سانتی‌متر و فاصله خطوط کاشت 17 سانتی‌متر منظور شد. آبیاری مزرعه یک نوبت در پاییز بعد از کاشت انجام شد. در فصل بهار و تابستان، آبیاری در هر دو شرایط فاقد و واجد تنش تا مرحله گلدهی به‌صورت یکسان و با دور آبیاری 10 روزه انجام شد و در زمان اجرای تنش در کرت‌های تحت تنش رطوبتی گلدهی، قطع آبیاری از مرحله گلدهی تا انتهای دوره رشد گیاه اعمال شد. با استفاده از دستگاه صفحه فشاری (Mosadeghi et al., 2009)، میزان ظرفیت زراعی مزرعه تعیین و بر اساس آن تنش اعمال شد. نمونه­های خاک در داخل دستگاه اشباع شده و مکش مورد نظر بر آنها اعمال شد. پس از برقراری تعادل رطوبتی (با گذشت 24 ساعت)، درصد رطوبت نمونه­ها با استفاده از آون 105 درجه سانتی­گراد اندازه­گیری شد. با در نظر گرفتن احتمال بارندگی از پوشش نایلونی برای جلوگیری از نفوذ آب به تیمارهای تحت تنش استفاده شد. عملکرد دانه در یک متر مربع از هر کرت تعیین شد.

1-2. بررسی صفات فیزیولوژیکی درگیر در تحمل به تنش خشکی

نمونه‌برداری از چهار رقم انجام و نمونه‌ها با انجماد سریع در ازت مایع و انتقال به فریزر  تا زمان استفاده نگهداری شدند. صفات مقدار کلروفیل a، b و مقدار کلروفیل کل، محتوای پرولین برگ، غلظت کاروتنوئید برگی، محتوای پروتئین محلول، غلظت مالون­دی­آلدهید (MDA)، مقدار پراکسید هیدروژن برگ (H₂O₂)، پراکسیداز (POX) و کاتالاز (CAT) اندازه‌گیری شدند. جهت تعیین غلظت پروتئین از روشBradford  (1976) استفاده شد. فعالیت سینتیکی آنزیم کاتالاز با استفاده از روش
 Chance & Maehly (1955) صورت گرفت. برای سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز از روش Kar & Mishra  (1976) استفاده شد. میزان پرولین برگ با استفاده از روش Bates et al. (1973) اندازه‌گیری شد. محتوای کلروفیل و کاروتنوئید برگ با استفاده از روشArnon  (1976) اندازه‌گیری شد.  

2-2. بررسی بیان ژن­های آنتی­اکسیدانی درگیر در تحمل به تنش خشکی

نمونه‌برداری از چهار رقم (دو رقم حساس و دو رقم مقاوم به تنش رطوبتی) انجام شد و نمونه‌ها با انجماد سریع در ازت مایع و انتقال به فریزر  تا زمان استخراج RNA نگهداری شدند. بررسی الگوی بیان ژن‌ها در نمونه‌های مورد بررسی با روش پی­سی­آر نیمه­کمی در سه تکرار انجام شد. استخراج RNA کل از ریشه و سرشاخه‌ی نمونه‌های گیاهی با استفاده از کیت
RNax plus انجام شد. به منظور تأیید کیفیت RNA استخراجی چهار میلی­لیتر از نمونه روی ژل آگارز 5/1% الکتروفورز شد. همچنین با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مدل Eppendorf BioPhotometer Plus جذب نمونه‌ها در 260 و 280 نانومتر قرائت شد. نمونه مطلوب دارای نسبت طول موجی 260 به 280 بین 7/1 تا 2 می‌باشد. از آنجایی که احتمال دارد نمونه‌های RNA استخراج­شده به DNA ژنومی آلودگی داشته باشند از آنزیم DNaseI جهت رفع آلودگی استفاده شد. از ژن گلوتاتیون­پراکسیداز (GAPDH) به­عنوان ژن خانه‌­دار استفاده شد. طراحی آغازگرها با استفاده از نرم­افزار Primer premier5 انجام گرفت و ویژگی­های از جمله تشکیل دایمر آغازگر، هترودایمر آغازگر رفت و برگشت، تشکیل ساختار سنجاق­سری، تکثیر قطعات ناخواسته
 (False priming) مورد مطالعه و با استفاده از نرم­افزار تحت وب Primer Blast اختصاصی­بودن قطعات تکثیری برای هر کدام از ژن­ها به­طور مجزا مورد بررسی قرار گرفت. مشخصات آغازگرهای مورد بررسی در جدول 2 درج شده است.

جدول 2. توالی آغازگرهای مورد استفاده.

F (Forward): جلوبر، R (Reverse): برگشتی.

3-2. ساختDNA مکمل تک­رشته­ای

با استفاده از کیت سنتز cDNA شرکت سیناکلون و RNA­های استخراج­شده، cDNA تک­رشته‌ای طبق پروتکل شرکت سازنده انجام شد. ترکیبات واکنش RT-PCR و چرخه زمانی واکنش برای تکثیر قطعات در جدول ۳ درج شده است. میانگین Ct ژن­های مورد مطالعه در تیمارهای مختلف در جدول 4 آورده شده است.

جدول 3. چرخه زمانی واکنش RT-PCR برای تکثیر قطعات مورد نظر.

جدول 4. میانگین Ct ژن­های مورد مطالعه در ارقام مختلف گندم.

در نهایت بیان نسبی ژن مورد نظر نسبت به ژن خانه­دار نرمال شده سپس با روش مقدار Fold Change هر ژن تحت شرایط نرمال و تنش محاسبه شد. سپس میزان تغییرات بیان ژن در همۀ تیمارهای تحت تنش نسبت به شرایط نرمال محاسبه و به­صورت نمودار ستونی ترسیم شد (Livak & Schmittgen, 2001).

برای مقایسه بیان ژن بین تیمارهای تنش خشکی و شاهد و بین ارقام حساس به تنش و متحمل به تنش خشکی از برنامه اکسل 2017 استفاده شد. تجزیه واریانس و مقایسه میانگین برای داده­های بیان ژن به روش دانکن در سطح احتمال پنج درصد برای سه تکرار بیولوژیک با استفاده از برنامه SPSS 23 انجام شد. به منظور مقایسه ژنوتیپ‌های مورد آزمایش تجزیه واریانس به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح بلوک‌های کامل تصادفی برای کلیه صفات فیزیولوژیکی انجام شد. مقایسه میانگین‌ صفات فیزیولوژیکی و عملکرد دانه با استفاده از آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد با استفاده از نرم‌افزار SAS صورت گرفت.

3. نتایج پژوهش و بحث

1-3. تجزیه واریانس و مقایسه میانگین صفات

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثر تنش خشکی و ژنوتیپ‌های مورد بررسی و اثر متقابل این دو عامل بر اکثر صفات مورد ارزیابی معنی‌دار بود (جدول 5). نتایج حاصل از مقایسه میانگین صفات مربوط به ژنوتیپ‌ها و سطوح تنش و اثر متقابل ژنوتیپ × تنش در جداول 6، 7 و 8 درج ‌شده است. تحت شرایط نرمال و تنش خشکی، ژنوتیپ میهن بیشترین کلروفیل b و ژنوتیپ اروم کمترین آن را به خود اختصاص دادند (جدول 6). از لحاظ غلظت کلروفیل a و کلروفیل کل، ژنوتیپ میهن در شرایط نرمال بیشترین مقدار (49/0) را به خود اختصاص داد (جدول 8). بررسی روند تغییرات غلظت کلروفیل a و کلروفیل کل از شرایط نرمال به تنش خشکی نشان می‌دهد که این تغییرات در ارقام موردبررسی روند کاهشی دارد (جدول 8). به نظر می­رسد کاهش غلظت کلروفیل در اثر تنش شدید خشکی می­تواند ناشی از افزایش تولید رادیکال­‌های آزاد اکسیژن در سلول باشد که این رادیکال­ها موجب پراکسیداسیون و تجزیه این رنگدانه­ها می­شوند (Schutz & Fangmeir, 2001)؛ همچنین این موضوع نشان می­دهد که این گیاه برای حفظ آب، تعرق را کاهش داده و به همین دلیل فتوسنتز نیز در تیمار تحت تنش به حداقل رسیده است. دوام فتوسنتز و حفظ کلروفیل برگ تحت شرایط تنش از جمله شاخص­های فیزیولوژیکی مقاومت به تنش است. تنش خشکی باعث تولید اکسیژن فعال همراه با کاهش و تجزیه کلروفیل می­شود. در برخی پژوهش‌ها گزارش‌های ضد و نقیضی درباره اثر تنش خشکی روی غلظت کلروفیل ارائه‌شده است. Sheteawi & Tawfik (2007) بیان کردند که افزایش تنش خشکی منجر به افزایش کلیه رنگدانه‌های فتوسنتزی در ماش شده است.et al.   Nikolaeva(2010) گزارش کردند که تنش خشکی منجر به افزایش محتوای کلروفیل می‌شود. علت افزایش محتوای کلروفیل تحت شرایط تنش خشکی، کوچک‌تر شدن سلول‌های برگ به علت کاهش سطح برگ و ضخیم­شدن آن‌ها گزارش ‌شده است (Darvishi-Baloochi et al., 2010).        

نتایج بررسی روند تغییرات محتوای کاروتنوئید از شرایط نرمال به تنش خشکی نشان می‌دهد که این تغییرات در ارقام اروم و c-93-11 سیر نزولی و در ارقام میهن و c-93-4 سیر صعودی دارد (جدول 8). ژنوتیپ میهن در شرایط تنش خشکی بیشترین غلظت کاروتنوئید را داشت که غلظت آن حدود دو برابر شرایط نرمال بود.

تحت شرایط تنش خشکی ژنوتیپ‌های میهن و c-93-11 بیشترین پرولین را به خود اختصاص دادند (جدول 8). بررسی روند تغییرات محتوای پرولین از شرایط نرمال به تنش خشکی نشان می‌دهد که این تغییرات در چهار رقم مورد بررسی سیر صعودی دارد (جدول 8). افزایش پرولین در گیاه هنگام تنش، نوعی مکانیسم دفاعی است. پرولین از طریق تنظیم اسمزی، جلوگیری از تخریب آنزیم‌ها و پاک­کردن رادیکال‌های هیدروکسیل، تحمل گیاه را در برابر تنش‌ها افزایش می‌دهد
 (Kuznetsov & Shevyankova, 1997). تحت شرایط نرمال ژنوتیپ اروم بیشترین محتوای پروتئین را به خود اختصاص داد، اما در شرایط تنش خشکی ژنوتیپ c-93-4 دارای کمترین محتوای پروتئین بود (جدول 8). نتایج بررسی روند تغییرات پروتئین از شرایط نرمال به تنش خشکی نشان می‌دهد که این تغییرات در ارقام اروم و c-93-4 روند نزولی و در ارقام میهن و c-93-11 روند صعودی دارد (جدول 8). در شرایط تنش خشکی ژنوتیپ c-93-11 بیشترین پراکسیداز را به خود اختصاص داد، درصورتی‌که در شرایط نرمال ژنوتیپ‌های میهن و c-93-11 دارای کمترین پراکسیداز بودند (جدول 8). نتایج بررسی روند تغییرات فعالیت آنزیم پراکسیداز از شرایط نرمال به تنش خشکی نشان می‌دهد که با اعمال تنش خشکی، فعالیت آنزیم پراکسیداز به‌طور معنی‌داری افزایش پیدا می‌کند؛ به‌طوری‌که کمترین فعالیت این آنزیم در شرایط بدون تنش به­دست آمد (جدول 8). تحت شرایط تنش خشکی ژنوتیپ c-93-4 بیشترین محتوای مالون­دی­آلدهید و پراکسید هیدروژن برگ و ژنوتیپ اروم بیشترین مالون­دی­آلدهید را به خود اختصاص دادند (جدول 8). نتایج بررسی روند تغییرات محتوای مالون­دی­آلدهید و پراکسید هیدروژن برگ از شرایط نرمال به تنش خشکی نشان می‌دهد که این تغییرات در چهار رقم مورد بررسی سیر صعودی دارد (جدول 8).

تحت شرایط تنش خشکی، ژنوتیپ‌های c-93-11 و اروم به­ترتیب بیشترین و کمترین کاتالاز را به خود اختصاص دادند (جدول 8). بررسی روند تغییرات آنزیم کاتالاز از شرایط نرمال به تنش خشکی نشان می‌دهد با اعمال تنش خشکی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در ارقام مورد بررسی به‌طور معنی‌داری افزایش می‌یابد (جدول 8).

بر اساس شاخص‌های STI، GMP و MP ژنوتیپ­های میهن و اروم به‌عنوان متحمل‌ترین و ژنوتیپ­های c-93-11 و c-93-4 به‌عنوان حساس‌ترین ژنوتیپ ارزیابی شدند (جدول 6). تحت شرایط نرمال ژنوتیپ­های میهن و اروم (به­ترتیب با میانگین­های 76/389 و 59/385 گرم در متر مربع) بیشترین و ژنوتیپ c-93-4 (با میانگین 67/243 گرم در متر مربع) کمترین عملکرد دانه را به خود اختصاص دادند، درصورتی‌که تحت شرایط تنش گلدهی، ژنوتیپ میهن (با میانگین 70/232 گرم در متر مربع) بیشترین و ژنوتیپ c-93-4 (با میانگین 860/127 گرم در متر مربع) کمترین عملکرد دانه را دارا بودند، بنابراین بیشترین و کمترین عملکرد دانه در شرایط نرمال و تنش گلدهی به­ترتیب متعلق به ژنوتیپ­های میهن و c-93-4 بود (جدول 8).

جدول 5. تجزیه واریانس صفات مختلف تحت ‌تأثیر ژنوتیپ و سطوح مختلف تنش در ژنوتیپ‌های مورد ارزیابی.

جدول 6. مقایسه میانگین صفات مربوط به ژنوتیپ‌های مورد مطالعه گندم نان.

                                                                                                حروف متفاوت در هر ستون بیانگر اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال پنج درصد است.

جدول 7. مقایسه میانگین صفات مربوط به سطوح تنش رطوبتی.

                                                                         حروف متفاوت در هر ستون بیانگر اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال پنج درصد است.

جدول 8. مقایسه میانگین صفات مربوط به اثرات متقابل ژنوتیپ‌ها در سطوح مختلف تنش خشکی.

حروف متفاوت در هر ستون بیانگر اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال پنج درصد است.

2-3. بیان نسبی ژن سوپراکسیددیسموتاز

یکی از مؤثرترین آنتی­اکسیدان­های درون­سلولی سوپراکسیددیسموتاز (SOD) می­باشد. بسیاری از پژوهشگران آن را قویترین آنتی­اکسیدان شناخته­شده می­دانند که می­تواند بسیاری از گیاهان را در مقابل حمله رادیکال­های آزاد اکسیژن ایمن نگه دارد و سبب پایداری گیاه در برابر بسیاری از تنش­­های محیطی شود (Mittler, 2002). میزان تغییرات نسبی بیان ژن سوپراکسیددیسموتاز (SOD) تحت تنش خشکی نسبت به شاهد در دو رقم متحمل اروم و میهن بیشترین مقدار و در رقم C-93-4 کمترین مقدار بود و رقم
 C-93-11 از نظر این صفت تفاوت معنی­داری با رقم میهن و C-93-4 نداشت (شکل 1). با توجه به اینکه تعداد زیادی از مطالعات، رابطه مثبت بین فعالیت سوپراکسیددیسموتاز و تحمل در برابر تنش­های زیستی و غیر زیستی را نشان می­دهند
 (Gill & Tuteja, 2010). بنابراین می­توان نتیجه گرفت افزایش کارایی ارقام متحمل در مقایسه با ارقام حساس در شرایط تنش مرتبط با افزایش فعالیت سوپراکسیددیسموتاز باشد. گزارش شده تنش خشکی در ارقام مختلف گندم سبب بالا رفتن بیشتر سوپراکسیددیسموتاز می­شود (Kar, 2011) که موافق با نتایج تحقیق می باشد. مطالعات نشان داده است که در گیاهچه­های برنج میزان بیان ژن سوپراکسیددیسموتاز در شرایط تنش اسمزی بسیار بیشتر از شرایط عدم تنش بوده است (Sharma et al., 2015).

3-3. بیان نسبی ژن آسکوربات­پراکسیداز

آسکوربات­پراکسیداز گرایش بالایی به H₂O₂ دارد و قادر است در غلظت­های کم، H₂O₂ را سم­زدایی کند (Gupta, 2011). ازآنجایی­که آسکوربات­پراکسیداز باعث حذف رادیکال­های آزاد اکسیژن می­شود، بالاتر بودن فعالیت این آنزیم به معنی حذف بیشتر رادیکالهای اکسیژن و در نتیجه آن کاهش مرگ سلولی و افزایش مقاومت به خشکی است (Akhila et al., 2008). آنزیم‌های آنتی­اکسیدان مانند کاتالاز، آسکوربات­پراکسیداز در پاک­سازی رادیکال‌های آزاد اکسیژن در سلول نقش دارند. میزان تغییرات نسبی بیان ژن آسکوربات­پراکسیداز (APX) تحت تنش خشکی نسبت به شاهد در رقم متحمل میهن بیشترین و در رقم C-93-4 کمترین مقدار بود. ارقام اروم و C-93-4 از لحاظ مقدار این صفت حد واسط بوده و اختلاف معنی­داری با دو رقم میهن و C-93-4 داشتند (شکل 2). بنابراین احتمالاً می­توان تا حدودی عملکرد بالای رقم میهن را تحت شرایط تنش نسبت به سایر ارقام، به فعالیت بیشتر آنزیم‌های آنتی­اکسیدانی ­سکوربات­پراکسیداز نسبت داد.

شکل 1. بیان نسبی ژن سوپراکسید­دیسموتاز ارقام گندم متحمل و حساس تحت تنش رطوبتی نسبت به شاهد.

شکل 2. بیان نسبی ژن آسکوربات­پراکسیداز ارقام گندم متحمل و حساس تحت تنش رطوبتی نسبت به شاهد.

4-3. بیان نسبی ژن پراکسیداز

پراکسیدازها معمولاً واکنش اکسیداسیون و احیا را بین پراکسید هیدروژن به عنوان گیرنده الکترون و انواع زیادی از سوبستراها مثل مواد فنلی، اسید­آسکوربیک، آمین­های آروماتیک و سیتوکروم c کاتالیز کرده و به­عنوان آنزیم­های سم­زدای گونه­های فعال اکسیژن عمل می­کنند (et al., 2015 Hashemi). یکی از دلایل افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز این است که آنزیم پراکسیداز با واکنش‌های اکسنده به­وجود­آورنده رادیکال‌های آزاد و پراکسیدهای آلی همبستگی دارد و پراکسیداز نقش مؤثری در پاکسازی پراکسید هیدروژن دارد (Sofo et al., 2010). میزان تغییرات نسبی بیان ژن پراکسیداز (POX) تحت تنش خشکی نسبت به شاهد در رقم متحمل اروم بیشتر از سایر ارقام بود (شکل 3). بنابراین احتمالاً می‌توان تا حدودی عملکرد بالای رقم اروم و تحمل به تنش خشکی آن را تحت شرایط تنش نسبت به سایر ارقام، به فعالیت بیش از حد آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی پراکسیداز نسبت داد.

شکل 3. بیان نسبی ژن پراکسیداز ارقام گندم متحمل و حساس تحت تنش رطوبتی نسبت به شاهد.

5-3. بیان نسبی ژن گلوتاتیون­پراکسیداز

میزان تغییرات نسبی بیان ژن گلوتاتیون­پراکسیداز (GAPDH) در ارقام اروم و C-93-11 تحت شرایط تنش نسبت به شاهد بیشترین و در دو رقم متحمل و حساس میهن و C-93-4 کمترین میزان بود و این موضوع نشان‌دهنده این است که مکانیسم تحمل به تنش این ارقام احتمالاً به سایر آنزیم‌ها بستگی دارد (شکل 4).

شکل 4. بیان نسبی ژن گلوتاتیون­پراکسیداز ارقام گندم متحمل و حساس تحت تنش رطوبتی نسبت به شاهد.

6-3. بیان نسبی ژن پلی­فنل­اکسیداز

میزان تغییرات نسبی بیان ژن پلی­فنل­اکسیداز (PPO) در رقم C-93-4 تحت تنش نسبت به شاهد بیشتر از سایر ارقام می­باشد (شکل 5). میزان این صفت در رقم حساس C-93-11 کمترین مقدار و اختلاف معنی­داری با رقم متحمل اروم داشت، ولی با رقم متحمل میهن اختلاف معنی­داری نداشت (شکل 5). از­آنجایی­که هم شرایط رشد (مانند بروز تنش) و هم نوع ژنوتیپ بر فعالیت پلی­فنل­اکسیداز تأثیرگذار می‌باشد (Thipyapong et al., 2004)، می‌توان تفاوت ژنوتیپ‌ها در میزان فعالیت این آنزیم را تحت شرایط نرمال و تنش توجیه کرد.

شکل 5. بیان نسبی ژن پلی­فنل­اکسیداز ارقام گندم متحمل و حساس تحت تنش رطوبتی نسبت به شاهد.

7-3. بیان نسبی ژن کاتالاز

آنزیم کاتالاز (CAT) نیز یکی از مهمترین آنزیم‌های سیستم آنتی‌اکسیدانی می‌باشد که با افزایش تنش خشکی در گیاهان مختلف از جمله جو افزایش می‌یابد (EL-Tayeb, 2005). کاتالاز آنزیمی است که پراکسید هیدروژن تولید­شده در مسیرهای تنفس نوری داخل پراکسیزوم‌ها را مهار می‌کند (Mittler, 2002) و مسئول سم­زدایی سطوح افزایش­یافته H₂O₂ می­باشد (Gupta, 2011). میزان تغییرات نسبی بیان ژن کاتالاز تحت تنش خشکی نسبت به شاهد، در رقم متحمل میهن بیشترین مقدار و از ارقام دیگر تفاوت معنی­داری داشت (شکل 6). بنابراین می‌توان تا حدودی عملکرد بالای رقم میهن تحت شرایط تنش را نسبت به دو ارقام دیگر، به فعالیت بیشتر آنزیم کاتالاز نسبت داد. طبق نتایج آنزیم‌های آنتی­اکسیدانی سوپراکسید­دیسموتاز و کاتالاز نقش قابل توجهی در تعیین پاسخ ژنوتیپ­های گندم به تنش خشکی ایفا می­کنند (Abedi & Pakniyat, 2010; Yang & Deng, 2015) که موافق با نتایج این پژوهش است.

شکل 6. بیان نسبی ژن کاتالاز ارقام گندم متحمل و حساس تحت تنش رطوبتی نسبت به شاهد.

8-3. بیان نسبی ژن پرولین­سنتتاز

ژن پرولین­سنتتاز (P5CS) جزء اصلی در بیوسنتز و تجمع پرولین را کد می­کند. مطالعات زیادی همبستگی مثبت تجمع پرولین با سازگاری گیاهان به تنش خشکی را بیان می­کند (Garaghanipur et al., 2014; Farooq et al., 2017). میزان تغییرات نسبی بیان ژن پرولین­سنتتاز در رقم متحمل اروم بیشترین مقدار و در رقم حساس C-93-4 کمترین مقدار بود. از لحاظ این صفت رقم میهن اختلاف معنی­داری با رقم C-93-11 نداشت (شکل 7). بنابراین می­توان نتیجه گرفت افزایش کارایی رقم متحمل اروم در مقایسه با سایر ارقام در شرایط تنش احتمالاَ مرتبط با افزایش فعالیت ژن پرولین­سنتتاز باشد. پرولین نقش محافظتی در مقابل گونه­های فعال اکسیژن (ROS) داشته و باعث پایداری ماکرومولکول­ها )مانند پروتئین و نوکلئیک­اسید( و ایفای نقش تأمین منبع کربن و نیتروژن تحت تنش خشکی می­شود (Giri, 2011; Marček et al., 2019). با توجه به نتایج به­دست­آمده تمامی ارقام از انباشت پرولین­سنتتاز به عنوان یک واکنش حفاظتی در برابر تنش خشکی استفاده کردند، ولی سرعت واکنش و تجمع پرولین در هر رقم متفاوت و تعیین­کننده سطح تحمل به خشکی آن رقم بود. نتایج این آزمایش موافق با یافته­های سایر محققان (Vendruscolo et al., 2007) در گیاه گندم بود. افزایش بیان ژن P5CS برای بالارفتن سطح پرولین در گیاه سیب زمینی با افزایش روزهای تنش اسمزی گزارش شده است (Kishor, 1995). بر اساس این پژوهش می­توان اظهار داشت که محتوای پرولین­سنتتاز و بیان ژن­های کلیدی درگیر در بیوسنتز پرولین در شرایط تنش نسبت به شرایط شاهد تغییرات قابل توجهی را نشان دادند. تنش خشکی سبب القای بیان ژن پرولین­سنتتاز (P5CS) و افزایش سطح پرولین­سنتتاز در همه ارقام شد. بنابراین، می­توان از میزان بیان ژن P5CS تحت شرایط تنش به­عنوان یک شاخص در برنامه­های اصلاحی جهت انتخاب ارقام متحمل به خشکی استفاده شود و از این نتایج در اصلاح مولکولی گیاه گندم بهره برد. در تحقیقی دیگر بیان ژن کلیدی دخیل در متابولیسم پرولین (P5CS) در برگها و جوانه­های گل ژنوتیپ­های لوبیای معمولی (Phaseolus vulgaris L.) تحت تنش خشکی مورد بررسی قرار گرفت و نتایج آنها نشان داد که در نتیجه تنش خشکی ژن P5CS افزایش معنی­داری پیدا کرد (Garaghanipur et al., 2014).

شکل 7. بیان نسبی ژن پرولین­سنتتاز ارقام گندم متحمل و حساس تحت تنش رطوبتی نسبت به شاهد.

عملکرد دانه بالا و کیفیت خوب دانه­ها اهداف مهم در زمینه تولید غلات می­باشند (Fischer, 2008). از­آنجایی­که عملکرد صفت بسیار پیچیده­ای است، بنابراین هرگونه افزایش عملکرد از طریق تغییر مدیریت مزرعه و یا از طریق برنامه­های اصلاحی نیازمند شناخت دقیق عوامل تعیین­کننده عملکرد می­باشد (Acreche & Slafer, 2006 ). در همین راستا، افزایش عملکرد از طریق مهندسی ژنتیک تنها زمانی حاصل می­شود که مکانیزم­های فیزیولوژیکی تعیین­کننده عملکرد دانه به­خوبی درک شده باشند و در این صورت است که می­توان گلوگاه­هایی که عملکرد را محدود می­کنند را بدون هیچ­گونه هزینه اضافی باز کرد. بنابراین، سازگاری گیاهان به شرایط تنش اغلب مرتبط با کنترل محتوای ROS از طریق سیستم­های آنتی­اکسیدانتی آنزیمی و غیر آنزیمی، و همچنین تجمع اسمولیت­های سازگار است.

4. نتیجه‌گیری

با توجه به نتایج مقایسه میانگین صفات فیزیولوژیکی، عملکرد بالای ژنوتیپ اروم در شرایط نرمال و تنش به میزان پروتئین کل و مالون­دی­آلدهید بیشتر، مرتبط است، درصورتی‌که عملکرد بالای ژنوتیپ میهن در شرایط نرمال و تنش به غلظت کلروفیل کل، غلظت کلروفیل a و b، میزان کاروتنوئید و میزان پرولین بیشتر مرتبط است. به­طور کلی، نتایج آزمایش نشان داد که تحمل به تنش خشکی بالای رقم میهن را می­توان احتمالاً به فعالیت بالای آنزیم کاتالاز و آسکوربات­پراکسیداز، و تحمل بالای رقم اروم به فعالیت بیشتر آنزیم‌های آنتی­اکسیدانی پرولین­سنتتاز، پراکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز نسبت داد.

5. سپاسگزاری

از مسئولین مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان آذربایجان شرقی که ژنوتیپ­های مورد مطالعه برای انجام این پژوهش را فراهم کردند تشکر و قدردانی می­شود.

6. منابع

Abedi, T., & Pakniyat, H. (2010). Antioxidant enzyme changes in response to drought stress in ten cultivars of oilseed rape (Brassica napus L.). Czech Journal Genetic and Plant Breeding, 46(1), 27–34.

Acreche, M., & Slafer, G.A. (2006). Grain weight response to increases in number of grains in a Mediterranean area. Field Crop Research, 98, 52-59.

Ahmadi, J., Pour-Aboughadareh, A., Fabriki-Ourang, S., Mehrabi, A.A., & Sidique, K.H.M. (2018). Wild relatives of wheat: Aegilops–Triticum accessions disclose differential antioxidative and physiological responses to water stress. Acta Physiologiae Plantarum, 40, 90.

Akhila, S., Abraham, T.K., & Jaya, D. (2008). Studies on the changes in lipid peroxidation and antioxidants in drought stress induced cowpea Vigna unguiculata (L.) varieties. Journal of Environmental Biology, 29, 89-691.

Aranjuelo, I., Molero, G., Erice, G., Christophe Avice, J., & Nogues, S. (2011). Plant physiology and proteomics reveals the leaf response to drought in alfalfa (Medicago sativa L.). Journal of Experimental Botany, 62(1), 111-123.

Arnon, A.N. (1967). Method of extraction of chlorophyll in the plants. Agronomy Journal, 23, 112-121.

Bates, L., Waldrem, R., & Teare, I. (1973). Rapid determination of free praline for water stress studies. Plant Soil, 39, 205-207.

Blokhin, O., Virolainen, E., & Fagerstedt, K. (2003). Antioxidant oxidative damage and oxygen deprivation stress. Annual Review of Botany, 91, 179-194.

Blomqvist, L.A., Ryberg, M., & Sundqvist, C. (2006). Proteomic analysis of the etioplast inner membranes of wheat (Triticum aestivum L.) by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Physiologia Plantarum, 128, 368-381.

Bohnert, H.J., & Jensen, R.G. (1996). Strategies for engineering water stress tolerance in plants. Trends in Biotechnology, 14, 89-97.

Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254.   

Bray, E.A. (2002). Classification of genes differentially expressed during water-deficit stress in Arabidopsis thaliana: An analysis using microarray and differential expression data. Annals of Botany, 89, 803 -811.

Byrt, C., Xu, B., & Krishnan, M. (2014). The Na+ transporter, TaHKT1;5-D, limits shoot Na+ accumulation in bread wheat. The Plant Journal, 80, 516-526.

Chance, B., & Maehly, A.C. (1955). Assay of catalases and peroxidases. Meth. Enzymol., 11, 764-755.    

Darvishi-Baloochi, M., Paknejad, F., Kashani, A., & Ardakani, M.R. (2010). Effect of water stress and foliar feeding of micronutrients on chlorophyll fluorescence parameters, chlorophyll content, RWC, membrane stability and grain yield of maize (SC704). Journal of Crop Science, 41, 531-543. (In Persian).   

EL-Tayeb, M.A. (2005). Response of barley grains to the interactive effect of salinity and salicylic acid. Plant Growth Regulation, 45, 215-222.

Farooq, M., Hussain, M., Nawaz, A., Lee, D., Alghamdi, S., & Siddique, H.M.K. (2017). Seed priming improves chilling tolerance in chickpea by modulating germination metabolism, trehalose accumulation and carbon assimilation. Plant Physiology and Biochemistry, 111, 274- 283.

Fischer, R.A. (2008). The importance of grain or kernel number in wheat: A reply to Sinclair and Jamieson. Field Crop Research, 105, 15-21.

Fita, A., Rodrıguez-Burruezo, A., Boscaiu, M., Prohens, J., & Vicente, O. (2015). Breeding and domesticating crops adapted to drought and salinity: A new paradigm for increasing food production. Frontiers in Plant Science, 6, 978.

Food and Agriculture Organization. (2018). World food situation, FAO cereal supply and demand brief, 6 December, Available at: http://www.fao.org/ worldfoodsituation/ csdb/en/.

Food and Agriculture Organization. (2011-2020). World food situation, Available at: http://www.fao.org/ worldfood situation/ csdb/en/.

Garaghanipur, N., Shiran, B., Khodambashie, M., & Molaie, A.R. (2014). Study of proline accumulation and gene expression of P5CS in leaves and flower buds of common bean cultivars under drought stress. Journal of Agricultural Biotechnology, 6, 129-142.

Gill, S.S., & Tuteja, N. (2010). Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48(12), 909-930.

Giri, J. (2011). Glycinebetaine and abiotic stress tolerance in plants. Plant Signaling & Behavior, 6(11), 1746-1751.

Gupta, S.D. (2011). Reactive oxygen species and antioxidants in higher plants. Science Publishers, P.O. Box 699, Enfield, NH 03748, USA. Pp, 129-145.

Gygi, S., Rochon, Y., Franza, B.R., & Aebersold, R. (1999). Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Molecular Cell Biology, 19, 1720-1730.

Hadi, H., Seyed Sharifi, R., Namour, A., & Qolipour, A. (2016). Plant protectors and abiotic stresses. First Edition. Publications of Urmia University. Pp 346.

Hashemi, H., Kavousi, H.R., & Pourseyedi, S.H. (2015). Effect of cadmium toxicity on gene expression and enzyme activity of superoxide dismutase and ascorbate peroxidas in chickpea (Cicer arietinum L.) seedlings. Journal of Agricultural Biotechnology, 16, 99-111.

Kar, R.K. (2011). Plant responses to water stress: Role of reactive oxygen species. Plant Signaling and Behavior, 6, 1741-1745.

Kar, M., & Mishra, D. (1976). Catalase, peroxidase, and polyphenoloxidase activities during rice leaf senescence. Plant Physiology, 57, 315-319.       

Kishor, P.K., Hong, Z., Miao, G.H., Hu, C.A.A., & Verma, D.P.S. (1995). Overexpression of [Δ1]-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiology, 108(4), 1387-1394.

Komatsu, S., & Tanaka, N. (2004). Rice proteome analysis: A step toward functional analysis of the rice genome. Proteomics, 4, 938-949.

Kuznetsov, W., & Shevyankova, N.L. (1997). Stress responses of tobacco cells to high temperature and salinity. Proline accumulation and phosphorylation of polypeptides. Plant Physiology, 100, 320-326. 

Livak, K.J., & Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative genc expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method. Methods, 25, 402-408.

Marček, T., Hamow, K.Á., Végh, B., Janda, T., & Darko, E. (2019). Metabolic response to drought in six winter wheat genotypes. PloS One, 14(2), e0212411.

Marian, C.O., Krebs, S.L., & Arora, R. (2003). Dehydrin variability among Rhododendron spp: A25 kDa dehydrin is highly conserved and associated with cold acclimation across wide array of species. New Phytol., 161, 773-780.

Masoomi-Aladizgeh, F., Aalami, A., Esfahani, M., Aghaei, M.J., & Mozaffari, K. (2015). Identification of CBF14 and NAC2 genes in Aegilops tauschii associated with resistance to freezing stress. Applied Biochemistry and Biotechnology, 176, 1059-1070.

Mittler, R. (2002). Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Scicnce, 7, 405-410.

Mosadeghi, M.R., Morshedizad, M., Mahboubi, A.A., Dexter, A.R., & Schulin, R. (2009). Laboratory evaluation of a model for soil crumbling for prediction of the optimum soil water content for tillage. Soil and Tillage Research, 105, 242-250 (In Persian).

Movludi, A., Ebadi, A., Jahanbakhsh, S., Davari, M., & Parmoon, G.H. (2014). The effect of water deficit and nitrogen on the antioxidant enzymes activity and quantum yield of barley (Hordeum vulgare L.). Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 42, 398-404. (In Persian).

Nikolaeva, M.K., Maevskaya, S.N., Shugaev, A.G., & Bukhov, N.G. (2010). Effect of drought on chlorophyll content and antioxidant enzyme activities in leaves of three wheat cultivars varying in productivity. Russ. Journal Plant Physiology, 57, 87-95.

Parida, A.K., & Das, A.B. (2005). Salt tolerance and salinity effects on plants. Ecotoxicol. Environ. Saf., 60, 324-349.     

Paroda, R. (2005). Scaling-up: How to reach a billion resource-poor farmers in developing countries . New directions for a diverse planet". Proceedings of 4 th International Crop Science Congress, 26 Sep -1 Oct 2004, Brisbane, Australia.

Pour-Aboughadareh, A., Ahmadi, J., Mehrabi, A.A., Etminan, A., Moghaddam, M., & Siddique, K.H.M. (2017). Physiological responses to drought stress in wild relatives of wheat: Implications for wheat improvement. Acta Physiologiae Plantarum, 39, 106.

Rampino, P., Pataleo, S., Gerardi, C., Mita, G., & Perrotta, C. (2006). Drought stress response in wheat: Physiological and molecular analysis of resistant and sensitive genotypes. Plant Cell and Environment, 29, 2143-2152.

Riccardi, F., Gazeau, P., Jacquemot, M.P., Vincent, D., & Zivy, M. (2004). Deciphering genetic variation of proteome responses to water deficit in maize leaves. Plant Physiology and Biochemistry, 42, 1003-1011.

Schutz, M., & Fangmeir, E. (2001). Growth and yield responses of spring wheat (Triticum aestivum L.) to elevated CO2 and water limitation. Environ. Pollut., 114, 187-194.

Sharma, I., Tyagi, B.S., Singh, G., Venkatesh, K., & Gupta, O.P. (2015). Enhancing wheat production-A global perspective. Indian Journal of Agricultural Sciences, 85(1), 3–13.

Sheteawi, S.A., & Tawfik, K.M. (2007). Interaction effect of some biofertilizers and irrigation water regime on mung bean (Vigna radiate) growth and yield. Journal appl. Science res., 3, 251-262.     

Sofo, A., Cicco, N., Paraggio, M., & Scopa, A. (2010). Regulation of the ascorbate-glutathione cycle in plants under drought stress, ascorbate-glutathione pathway and stress tolerance in plants, 137-189.

SPII. (2015). Report of whcat breeding program results during 2014-2015. Cereal Research Division Seed and Plant Improvement Institute, Karaj, Iran. (In Persian).

SPII. (2016) Report of wheat breeding program results during 2015-2016. Cereal Research Division Seed and Plant Improvement Institute, Karaj, Iran. (In Persian).

Svensson, J., Ismail, A.M., Palva, E.T., & Close, T.J. (2002). Dehydrins. In: K.B. Storey and J.M. storey (Eds.), Sensing Signaling and Cell Adaptation, Elsevier Science, 155-171.

Tamura, T., Hara, K., Yamaguchi, Y., Koizumi, N., & Sano, H. (2003). Osmotic stress tolerance of transgenic tobacco expressing á gene encoding a membrane-located receptor-like protein from tobacco plants. Plant Physiology, 131, 454-462.

Thipyapong, P., Melkonian, J., Wolfe, D.W., & Steffens, J.C. (2004). Suppression of polyphenol oxidases increases stress tolerance in tomato. Plant Science, 167, 693–703.

Tod, G.W., & Basler, E. (1965). Fate of various protoplasmic constituents in droughted wheat plants. Phyton, 22, 79-85.

Vendruscolo, A.C.G., Schuster, I., Pileggi, M., Scapim, C.A., Molinari, H.B.C., Marur, C.J., & Vieira, L.G.C. (2007). Stress induced synthesis of proline confers tolerance to water transgenic wheat. Journal Plant Physiology, 164, 1367-1376.

Verma, K.K., Singh, M., Gupta, R.K., & Verma, C.L. (2014). Photosynthetic gas exchange, chlorophyll fluorescence, antioxidant enzymes, and growth responses of Jatropha curcas during soil flooding. Turkish Journal of Botany, 38, 130-140.

Wang, W., Vinocur, B., Soseyov, O., & Altman, A. (2004). Role of plant heat -shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response. Trends in Plant Science, 9, 244-52.

Warschefsky, E., Penmetsa, R.V., Cook, D.R., & von-Wettberg, E.J.B. (2014). Back to the wilds: Tapping evolutionary adaptations for resilient crops through systematic hybridization with crop wild relatives. American Journal of Botany, 101, 1791-1800.

Xiong, L., & Jiang Kang, Z. (2001). Abiotic stress signal transduction in plants: Molecular and genetic perspectives. Physiologia Plantarum, 112(2), 152-166.

Yang, S., & Deng, X. (2015). Effects of drought stress on antioxidant enzymes in seedlings of different wheat genotypes. Pakistan Journal Botany, 47(1), 49–56.

Yordanov, I., Velikova, V., & Tsonev, T. (2000). Plant responses to drought, acclimation and stress tolerance. Photosynthetica, 38, 171-186.

Zang, X., & Komatsu, S. (2007). A proteomics approach for identifying osmotic-stress-related proteins in rice. Phytochemistry, 68, 426-437.