اثر تنش خشکی و آبیاری مجدد در مرحله گلدهی بر پاسخ فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی و عملکرد لاین‌های امیدبخش عدس

. مقدمه

عدس (Lens culinaris Medik) یکی از حبوباتی است که با داشتن بیش از 20 درصد پروتئین و خصوصیاتی همچون توانایی رشد در شرایط نامناسب و خاک‌های فقیر توانسته است به‌عنوان یک‌ گونه گیاهی باارزش نقش مهمی را در رژیم غذایی اقشار کم‌درآمد مردم کشورهای درحال‌ توسعه ایفا کند ( .(Srivastava & Vasishtha, 2012; Kumar et al., 2013کمبود بارندگی سالانه، نوسانات بارندگی و قطع زودهنگام بارندگی‌ها در بهار موجب بروز تنش خشکی در مراحل مختلف رشدی گیاه عدس می‌شوند که در کاهش عملکرد تأثیر قابل‌ ملاحظه‌ای دارند. از سوی دیگر، بین ژنوتیپ‌های عدس از نظر مقاومت به تنش خشکی تنوع قابل ‌توجهی وجود دارد (Reda, 2015).

در طول دهه‌های گذشته، کمبود آب و استفاده نادرست از منابع آبی در ایران به‌شدت افزایش ‌یافته است
 (Emadodin et al., 2019). از مشکلات اساسی آب در ایران مصرف بی­رویه در کشاورزی و مدیریت نامناسب آب می­باشد (Ashraf et al., 2021)؛ ازاین‌رو، عملکرد محصولات در ایران همواره توسط تنش خشکی تهدید می­شود. مراحل زایشی نسبت به مراحل رویشی بیشتر مستعد خشکسالی هستند (Barnabás et al., 2008). تنشی که در زمان گلدهی و گرده‌افشانی ظاهر می‌شوند به دلیل کاهش عملکرد گرده و تخمک‌ها و مهار رشد و عقیمی گرده منجر به شکست لقاح می‌شوند .(Sehgal et al., 2019) حساسیت به تنش خشکی با توجه به ژنوتیپ، مرحله فیزیولوژیکی و مدت‌ زمان تنش متفاوت است (Ahmed et al., 2013).

گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) پتانسیل واکنش با بسیاری از ترکیبات سلولی را داشته و سبب خسارت به غشا و سایر ماکرومولکول‌های ضروری از قبیل رنگدانه‌های فتوسنتزی، پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک و لیپیدها می‌شوند
.(Blokhina et al., 2003) آنتی‌اکسیدان‌ها مولکول‌هایی هستند که مانع از عملکرد رادیکال‌های آزاد شده و از تخریب سلول‌ها جلوگیری می‌کنند. این مواد می‌توانند با دادن الکترون به رادیکال‌های آزاد، آن‌ها را به شکل پایدار خود تبدیل و مانع از اثرات مخرب آن‌ها شوند. درجه فعالیت آنتی‌اکسیدانی و میزان افزایش آنتی‌اکسیدان‌ها در گیاهان به گونه گیاهی، مرحله نموی، شرایط متابولیک، طول مدت و شدت تنش بستگی دارد. سازوکارهای سمیت‌زدایی انواع اکسیژن فعال در گیاهان به دو دسته آنزیمی (آنزیم‌های سوپراکسیددیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات­پراکسیداز، گایاکول­‌پراکسیداز، گلوتاتیون­ردوکتاز، گلوتاتیون­پراکسیداز و ...) و غیر آنزیمی (ویتامین E، آسکوربات، گلوتاتیون، ملاتونین، ترکیبات فلاونوئیدی، کاروتنوئیدها و ...) طبقه‌بندی می‌شوند. گزارش‌ها نشان می‌دهند که ژنوتیپ‌های متحمل به تنش‌های محیطی می‌توانند از طریق فعال‌کردن سامانه‌های دفاع آنتی‌اکسیدانی با تنش‌های محیطی مقابله کنند. بنابراین، بین سامانه دفاع آنتی‌اکسیدانی و تحمل شرایط تنش ارتباط وجود دارد. برخی از محققان معتقدند که افزایش میزان آنتی‌اکسیدان‌ها تحمل گیاه به تنش‌های محیطی را افزایش می‌دهد (Demiral & Türkan, 2004; Guo et al., 2006). در این زمینه مطالعات نشان داد که در تنش‌های کمبود آب شدید، غلظت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در نخود تا دو برابر افزایش‌ یافته که نتیجه آن مقاومت بیشتر گیاه به تنش اکسیداتیو است (Abrishamchi et al., 2012; Bahadoran et al., 2015). در مطالعه روی ژنوتیپ‌های عدس مشاهده شد که تنش آبی منجر به افزایش معنی‌دار فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در مقایسه با تیمار بدون تنش شد (Ahmadi et al., 2020). همچنین در بررسی روی ارقام متحمل و حساس نخود و لوبیا به تنش خشکی دلیل افزایش شاخص کلروفیل با دستگاه Spad در ارقام متحمل فعالیت بیشتر آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان گزارش شده است
 (Rahbarian et al., 2012; Abrishamchi et al., 2012).

هدف این آزمایش بررسی اثرات خشکی در زمان تنش و آبیاری مجدد روی لاین‌‌های عدس بود. اکثر مطالعات به رابطه منفی بین پتانسیل عملکرد (عملکرد در شرایط بدون تنش) و عملکرد تحت تنش شدید اشاره می‌کنند، اما کمتر گزارشی در مورد اثرات تنش بعد از آبیاری مجدد مورد بررسی قرارگرفته است. نتایج Chen et al. (2016) نشان داد که مرحله بازیابی از اهمیت زیادی بر تحمل به تنش خشکی و بازگشت به شرایط نرمال دارد. آن‌ها مشاهده کردند که صفات فیزیولوژیک مانند کلروفیل نقش زیادی در بهبود شرایط بعد از تنش ایفا می­کنند. کلروفیل به‌عنوان رنگدانه فتوسنتزی نقش مهمی در جذب نور و فتوسنتز گیاهان دارد. محتوای کلروفیل یکی از رایج‌ترین معیارهای مورد استفاده برای ارزیابی شدت تنش خشکی است زیرا تنش می‌تواند تجزیه کلروفیل را تسریع کند (Ying et al., 2015) و با توجه به اینکه تنش خشکی یکی از مهم‌ترین عوامل محدودکننده عملکرد گیاهان زراعی به شمار می‌آید، بنابراین شناخت ویژگی‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی ایجادشده در محیط دارای تنش خشکی و بررسی تغییرات بعد از مرحله آبیاری مجدد (قابلیت ریکاوری) عدس دیدگاه‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی مناسبی را در توجیه رفتار این گیاه در مواجه با تنش خشکی و آبیاری مجدد فراهم می‌سازد. بنابراین این تحقیق باهدف بررسی اثر تنش خشکی بر فعالیت برخی از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی و خصوصیات فیزیولوژیک و عملکرد لاین‌های عدس انجام‌ شده است.

2. روش­شناسی پژوهش

2-1. طرح آزمایشی و شرایط رشد گیاه

این آزمایش به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار اجرا شد. فاکتور اول لاین‌های عدس در شش سطح (جدول 1)، فاکتور دوم تنش خشکی در سه سطح شاهد (آبیاری در 80% ظرفیت مزرعه‌ای)، تنش متوسط (آبیاری در 55% ظرفیت مزرعه‌ای) و تنش شدید (آبیاری در 30% ظرفیت مزرعه‌ای) و فاکتور سوم زمان نمونه‌برداری در سه سطح سه و شش روز پس از تنش و دو روز پس از آبیاری مجدد انجام شد. اعمال تنش خشکی با ظهور اولین گل صورت گرفت. این آزمایش در شرایط گلخانه‌ای با متوسط دمای 3 ±22 و رطوبت نسبی 60-50 درصد اجرا شد. گیاهان در گلدان­های 10 کیلوگرمی با سطح دهانه بیضی با ارتفاع 25 سانتی‌متر و قطر کوچک 25 و قطر بزرگ 45 کشت شدند. در هر گلدان 20 بذر کشت شد و پس از یک هفته 10 گیاهچه کاملاً نرمال و یکنواخت نگهداری و سایر گیاهچه­ها حذف شدند (شکل 1). برخی خصوصیات خاک استفاده­شده در این آزمایش در جدول 2 ارائه شده است.

جدول 1. معرفی اجمالی لاین‌های امیدبخش عدس.

جدول 2. برخی خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک مورد آزمایش.

pwp: رطوبت در نقطه پژمردگی دائم، bρ: جرم مخصوص ظاهری خاک.

شکل 1. مراحل اجرای آزمایش.

2-2. برنامه‌های آبیاری

تیمار تنش شامل سه سطح تنش خشکی بود. اولین تیمار که تحت عنوان تیمار شاهد بود، در این تیمار چنانچه رطوبت سهل‌الوصول خاک به 80 درصد می‌رسید (خاک 20 درصد رطوبت از صددرصد ظرفیت مزرعه را از دست می‌دهد) آبیاری انجام می شد. در تیمار دوم یا تنش متوسط تخیله رطوبتی 45 درصد و در تیمار سوم یا تنش شدید، زمان آبیاری بعد از تخلیه 70 درصدی رطوبت سهل‌الوصول در نظر گرفته شد. در این پژوهش، اعمال تنش خشکی براساس ظرفیت زراعی صورت گرفت. برای اندازه‌گیری رطوبت در ظرفیت زراعی از روش اندازه‌گیری وزنی رطوبت استفاده شد. برای این منظور ابتدا گلدان‌ها با زهکشی آزاد اشباع‌ شده و در گلدان‌ها با پلاستیک بسته شد تا از تبخیر جلوگیری شود. سپس از گلدان‌ها نمونه خاک برداشت ‌شده و رطوبت وزنی تا زمانی که در دو روز متوالی برابر شود ادامه یافت که نشان‌دهنده رطوبت وزنی در وضعیت ظرفیت زراعی بود. در گام آخر با ضرب رطوبت وزنی ظرفیت زراعی در جرم مخصوص ظاهری اندازه‌گیری­شده خاک رطوبت حجمی به­دست آمد و با استفاده از آن مدیریت آبیاری و تیمارهای تنش اعمال شد (Nasimi et al., 2019). گلدان‌های مشابه و هم­وزن انتخاب و خاک همگن‌شده به میزان 10 کیلوگرم در هر گلدان اضافه شد. آبیاری براساس رطوبت خاک در 80% ظرفیت زراعی (یا 20% تخلیه رطوبتی) در طول دوره رشد انجام شد. آغاز تنش از مرحله گلدهی شروع شد، زیرا مرحله گلدهی بیشترین حساسیت را نسبت به تنش خشکی دارد و گیاه بیشترین آسیب را در این مرحله متحمل می‌شود. علاوه‌براین، سه و شش روز پس از اعمال تنش، آبیاری با 80 درصد ظرفیت زراعی به مدت دو روز (48 ساعت) انجام شد تا ریکاوری انجام شود. نمونه‌برداری در روز سوم و ششم تنش انجام شد. نمونه­برداری سوم در مرحلۀ بازیابی انجام و صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی اندازه‌گیری شد تا مرحله برداشت آبیاری براساس رطوبت خاک در 80% ظرفیت زراعی انجام شود.

2-3. اندازه­گیری عملکرد و اجزای عملکرد

برای اندازه­گیری عملکرد دانه، وزن 100 دانه، تعداد غلاف در بوته، تعداد دانه در بوته، چهار بوته در هر گلدان در مرحله رسیدگی فیزیولوژیک برداشت شدند. سپس با ترازوی با دقت 001/0 گرم  وزن آن‌ها توزین شد.

2-4. اندازه‌گیری محتوای کلروفیل و کارتنوئید

حدود 1/0 گرم از بافت برگی تازه با استون 80 درصد سائیده شد و به حجم دو میلی‌لیتر رسانده شد. محلول حاصل به مدت 10 دقیقه در 400 دور سانتریفیوژ شد. جذب نوری در طول ‌موج‌های 645، 470 و 663 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتری اندازه‌گیری شد. مقدار کلروفیل و کارتنوئیدها طبق معادله­های زیر محاسبه شد (Arnon, 1967).

Chlorophyll a= (19.3×A₆₆₃-0.86×A₆₄₅)V/100W

Chlorophyll b= (19.3×A₆₄₅-3.6×A₆₆₃)V/100W

Chlorophyll t= chlorophyll a + chlorophyll b

Carotenoids= (1000A₄₇₀-1.82C_a-85.02C_b)/198

2-5. محتوای پرولین برگ

مقدار 1/0 گرم بافت برگی تازه در 10 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک­اسید سه درصد سائیده و با سرعت 4000 دور در دقیقه در دمای چهار درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. به دو میلی‌لیتر از عصاره حاصل، دو میلی‌لیتر معرف ناین­هیدرین و دو میلی‌لیتر اسیداستیک ‌گلاسیال خالص اضافه‌ شده و لوله‌ها به مدت یک ساعت در حمام آب 100 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. سپس چهار میلی‌لیتر تولوئن به آن‌ها اضافه و پس از تشکیل دو فاز جداگانه، جذب نوری فاز بالایی رنگی در دستگاه اسپکتروفتومتری با طول ‌موج 520 نانومتر قرائت شد(Bates et al., 1973) . 

2-6. استخراج عصاره پروتئینی

برای استخراج پروتئین، 1/0 گرم نمونه‌های برگ تازه در نیتروژن مایع پودر شد. سپس با 5/1 میلی‌لیتر بافر استخراج (فسفات پتاسیم 100 میلی‌مولار با 8/7pH=) مخلوط شد. سوسپانسیون حاصل با سرعت 15000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه در دمای چهار درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی برای اندازه‌گیری غلظت پروتئین و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان استفاده شد (Hazrati et al., 2022).

2-7. اندازه‌گیری پروتئین محلول کل

غلظت پروتئین به روش اسپکتروفتومتری با استفاده از روش برادفورد (Bradford, 1976) تعیین شد. برای این منظور،50 میکرولیتر عصاره پروتئینی به 950 میکرولیتر محلول برادفورد اضافه شد. سپس جذب نمونه‌ها در طول‌ موج 550 نانومتر اندازه‌گیری شد.

2-8. اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT)

50 میکرولیتر از عصاره‌ آنزیمی با 500 میکرولیتر H₂O₂ (10 میلی‌مولار) و 45/2 میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم (pH 7؛ 100 میلی‌مولار) مخلوط شد. جذب نوری نمونه‌ها در طول‌ موج 240 نانومتر توسط دستگاه اسپکتوفتومتری
 (SmartSpec^Plus Spectrophotometer, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) اندازه‌گیری شد  .(Aebi, 1984)

2-9. اندازه­گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز (POX)

50 میکرولیتر از عصاره آنزیمی به 5/2 میلی‌لیتر محلول واکنش (حاوی تریس 100 میلی‌مولار، پراکسید هیدروژن پنج میلی‌مولار و پیروگالل 10 میلی‌مولار) اضافه شد. سپس میزان جذب نوری در طول ‌موج 425 نانومتر قرائت شد (Kar & Mishra, 1976).

2-10. اندازه­گیری فعالیت آنزیم پلی‌فنل­اکسیداز (PPO)

برای اندازه‌گیری پلی‌فنل اکسیداز ابتدا به 5/1 میلی‌لیتر از بافر تریس (20 مولار)، 3/0 میلی‌لیتر از پیروگالل (2/. مولار) اضافه شد. سپس 100 میکرولیتر از عصاره آنزیمی به آن اضافه شد. مخلوط واکنش پس از ورتکس به مدت پنج دقیقه در حمام آبی با دمای 25 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت و سپس میزان جذب نوری نمونه‌ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری
(SmartSpec^Plus Spectrophotometer, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)  در طول ‌موج 420 نانومتر ثبت شد
 (Kar & Mishra, 1976).

2-11. اندازه‌گیری پراکسید هیدروژن(H₂O₂)

1/0گرم از بافت برگی در ازت مایع سائیده شد و در حمام یخ با 1 میلی‌لیتر تری‌‌کلرواستیک اسید (TCA) 1/0 درصد کاملاً مخلوط و با سرعت 12000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس نیم میلی‌لیتر از مایع رویی به نیم میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم 10 میلی‌مولار (pH 7.0) و یک میلی‌لیتر از یدید پتاسیم یک مولار اضافه شد. جذب نوری مخلوط در طول ‌موج 390 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد (Zaragoza-Martínez et al., 2016).

2-12. اندازه‌گیری مالون­دی­آلدئید (MDA)

2/0گرم از نمونه برگ تازه با پنج میلی‌لیتر اسیدتری‌کلرواستیک 1/0 درصد سانتریفیوژ شد. پس از مخلوط­کردن با محلول تری‌کلرواستیک­اسید 20 درصد حاوی تیوباربیتوریک­اسید نیم درصد، 15 دقیقه در حمام آب گرم دمای 95 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. سپس جذب نوری نمونه‌ها در طول ‌موج‌های 532 و 600 نانومتر ثبت شد .(Zaho et al., 1994)

2-13. تجزیه ‌و تحلیل آماری

تجزیه‌ داده­ها با استفاده از نرم‌افزار SAS 9.2 و مقایسه میانگین داده­ها با استفاده از آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد صورت گرفت. رسم نمودار همبستگی با استفاده از نرم‌افزار R انجام شد.

3. نتایج پژوهش و بحث

3-1. محتوای کلروفیل و کارتنوئید

نتایج نشان داد که اثر ژنوتیپ، تنش خشکی و زمان و همچنین برهمکنش بین آن‌ها بر میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کارتنوئید در سطح یک درصد معنی‌دار بود (جدول 3). کلروفیل a در اثر تنش متوسط (55% ظرفیت زراعی) و شدید (30% ظرفیت زراعی) در تمامی لاین‌ها کاهش یافت و در زمان آبیاری مجدد افزایش یافت؛ به‌طوری‌که لاین 6 بیشترین میزان کلروفیل a (32/5 میلی‌گرم بر گرم وزن تر) را در شرایط بدون تنش (80% ظرفیت زراعی) و اولین مرحله نمونه‌برداری نشان دادند. درحالی‌که کمترین میزان کلروفیل a در لاین 2 (49/1 میلی‌گرم بر گرم وزن تر) در شرایط تنش شدید و نمونه‌برداری دوم مشاهده شد (جدول 4).

جدول 3. تجزیه واریانس صفات فیزیولوژیکی لاین‌های عدس تحت تنش خشکی.

تنش خشکی موجب کاهش کلروفیل b و کلروفیل کل در همه لاین‌ها شد. بیشترین میزان کلروفیل b در لاین 4 در شرایط نرمال و دومین مرحله نمونه­برداری (65/0 میلی­گرم بر گرم وزن تر) مشاهده شد. درحالی‌که کمترین میزان کلروفیل b و کل در لاین 2 و در شرایط تنش شدید در دومین مرحله نمونه‌برداری (به­ترتیب 093/0 و 59/1 میلی­گرم بر گرم وزن تر) مشاهده شد. بیشترین میزان کلروفیل کل در لاین 6 (77/5 میلی­گرم بر گرم وزن تر) در شرایط نرمال (80% ظرفیت زراعی) و اولین مرحله نمونه­برداری (سه روز) مشاهده شد. بااین‌وجود میزان کلروفیل کل در مرحله بازیابی افزایش معنی­داری نشان داد.

نتایج نشان داد که تنش موجب کاهش کارتنوئید شد و این کاهش تا مرحله دوم نمونه‌برداری نیز اتفاق افتاد؛ به‌طوری‌که کمترین میزان کارتنوئید در لاین 2 (04/2 میلی­گرم بر گرم وزن تر) در شرایط تنش شدید و مرحله دوم نمونه­برداری مشاهده شد. بااین‌وجود میزان کارتنوئید نیز پس از آبیاری مجدد افزایش معنی­داری نشان داد. لاین 4 بیشترین میزان کارتنوئید  (08/6 میلی­گرم بر گرم وزن تر) را در شرایط نرمال و سومین مرحله نمونه­برداری نشان داد.

در این پژوهش مشاهده شد که محتوای کلروفیل در همه لاین‌ها تحت شرایط تنش خشکی متوسط و شدید به‌طور قابل ‌توجهی کاهش یافت و لاین 6 نسبت به سایر لاین‌ها کلروفیل و کارتنوئید بیشتری در شرایط نرمال و تنش نشان داد. میزان افزایش محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی در شرایط بازیابی بسته به نوع رقم و سطح تنش خشکی متفاوت بود. کاهش محتوای کلروفیل در شرایط تنش ممکن است به گیاهان کمک کند آسیب­های اکسیداتیو نوری را کاهش دهند که در این شرایط فتوسنتز مهار شده و انرژی تهییج نور بیش‌ازحد است (Aranjuelo et al., 2011). انرژی تهییجی که توسط رنگدانه فتوسنتزی در فتوسیستم II جذب می­شود منجر به اختلال در عملکرد فتوسنتزی و تجمع گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) می­شود که نتیجه آن ایجاد تنش اکسیداتیو است (Pintó-Marijuan & Munné-Bosch, 2014). سایر مطالعات نشان داده که فتوسنتز گیاهان به دلیل کاهش غلظت کلروفیل و اثرات مضر تنش خشکی بر چرخه کالوین مهار می­شود (Monakhova & Chemyadev, 2002).

3-2. پرولین و پروتئین

نتایج نشان داد که اثر رقم، تنش خشکی و زمان و همچنین برهمکنش بین آن‌ها بر میزان پرولین و پروتئین در سطح یک درصد معنی‌دار بود (جدول 3). بین لاین‌های مختلف از نظر پرولین نیز اختلاف معنی­داری وجود داشت؛ به‌طوری‌که پرولین در اثر تنش متوسط و شدید در تمامی لاین‌ها افزایش معنی­داری یافت. لاین 3 بیشترین میزان پرولین (63/3 میلی‌گرم بر گرم وزن تر) را در شرایط تنش شدید و دومین مرحله نمونه­برداری (تنش 30 % ظرفیت زراعی شش روز) نشان دادند. در شرایط بازیابی کاهش میزان پرولین در تمامی لاین‌ها قابل ‌مشاهده بود. همچنین کمترین میزان پرولین در تمامی لاین‌ها در شرایط شاهد (80% ظرفیت زراعی) قابل ‌مشاهده بود (جدول 4). تنش موجب کاهش پروتئین کل در لاین 1، 2، 3 و 5 شد و این کاهش در شرایط تنش شدید به‌طور معنی­داری بیشتر بود. بااین‌حال، تنش خشکی موجب افزایش میزان پروتئین در لاین 4 و 6 شد. لاین 3 بیشترین میزان پروتئین کل (09/1 میلی­گرم بر گرم وزن تر) را در شرایط بدون تنش (80% ظرفیت زراعی) و آبیاری مجدد نشان دادند. کمترین میزان پروتئین کل در لاین 5 (38/0 میلی­گرم بر گرم وزن تر) در شرایط تنش شدید و مرحله دوم نمونه­برداری مشاهده شد (جدول 4). 

در انتخاب و اصلاح لاین‌های سازگار با خشکی، داشتن ویژگی­های فیزیولوژیک مانند پرولین بیشتر، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان در شرایط تنش از قابلیت‌های سازگاری با خشکی است (Hura et al., 2007). افزایش غلظت پرولین در همه لاین‌ها تحت تنش خشکی در این آزمایش با نتایج Sinha et al. (2018) همخوانی دارد. افزایش پرولین احتمالاً به علت افزایش فعالیت آنزیم‌های درگیر در بیوسنتز پرولین یعنی اورنیتین‌آمینوترانسفراز و پرولین­کربوکسیلاز ردوکتاز و به‌علاوه به علت جلوگیری از فعالیت آنزیم پرولین‌اکسیداز و کاتابولاز است .(Valentovic et al., 2006) همچنین، نتایج Singh et al. (2019) نشان داد که ژنوتیپ‌های متحمل در مقایسه با ژنوتیپ‌های حساس، محتوای پرولین بیشتری را انباشته می‌کنند.

جدول 4. تأثیر تنش خشکی و آبیاری مجدد بر صفات فیزیولوژیکی لاین‌های عدس.

3-3. پراکسید هیدروژن (H₂O₂) و مالون­دی‌آلدهید (MDA)

نتایج این پژوهش نشان داد که برهمکنش لاین، تنش خشکی و زمان نمونه‌برداری برH₂O₂  و MDA در سطح یک درصد معنی­دار بود (جدول 5). بین لاین‌های مختلف از نظر H₂O₂ و MDA نیز اختلاف معنی­داری وجود داشت؛ به‌طوری‌که H₂O₂ و MDA در اثر تنش متوسط و تنش شدید در تمامی لاین‌ها افزایش معنی­داری یافت. لاین 6 بیشترین میزان H₂O₂ (15/18 میکرومول بر گرم وزن ‌تر) را در شرایط تنش شدید و دومین مرحله نمونه­برداری نشان دادند؛ درحالی‌که کمترین میزان H₂O₂ در لاین 1 (37/9 میکرومول بر گرم وزن تر) در شرایط شاهد و مرحله سوم نمونه­برداری مشاهده شد. همچنین مشاهده شد که در شرایط بازیابی میزان H₂O₂ به‌طور معنی­داری کاهش یافت. کمترین میزان MDA در لاین یک، شرایط بدون تنش و در اولین مرحله نمونه­برداری (01/5 میکرومول بر گرم وزن تر) مشاهده شد. همچنین لاین 2، 4 و 6 بیشترین میزان تغییر را در شرایط تنش متوسط و شدید نسبت به سایر لاین‌ها از نظر میزان MDA داشت؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان MDA در لاین 6 و در شرایط تنش شدید و نمونه­برداری شش روز (96/25 میکرومول بر گرم وزن تر) مشاهده شد.

به نظر می­رسد که سطوح بالاتر MDA در لاین‌های عدس تحت شرایط تنش به دلیل افزایش قابل‌ توجه تولید ROS (H₂O₂ و O₂^-) باشد (Tariq et al., 2018). نتایج تحقیق حاضر نشان داد که در لاین‌های عدس در هر دو سطح تنش متوسط و شدید میزان پراکسیداسیون لیپیدی به‌طور معنی­داری افزایش یافت. با این‌حال کاهش پراکسیداسیون لیپیدی در مرحله بازیابی قابل توجه بود که نشان می‌دهد پس از یک دوره تنش خشکی، گیاه قادر به بازگشت به شرایط نرمال بود. همچنین همبستگی مثبت و معنی­داری بین میزان MDA و H₂O₂ مشاهده شد (شکل 2) که نشان می­هد افزایش سطح H₂O₂ در شرایط تنش خشکی منجر به افزایش پراکسیداسیون لیپیدها غشایی و احتمالا در نهایت کاهش محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی و نرخ فتوسنتز می‌شود.

3-4. فعالیت آنتی‌اکسیدانی

تنش موجب افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پلی‌فنل­اکسیداز و پراکسیداز شد. بااین‌حال میزان تغییر در فعالیت این آنزیم‌ها بسته به سطح تنش و نوع لاین متفاوت بود. بیشترین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در لاین 3 (12/31 واحد بر میلی­گرم پروتئین) و در مرحله دوم نمونه­برداری و شرایط تنش شدید مشاهده شد. بیشترین تغییرات فعالیت کاتالاز در لاین 2 و 3 مشاهده شد. بااین‌حال کمترین میزان فعالیت کاتالاز در مرحله اول نمونه­برداری در شرایط نرمال در لاین 1 (85/9 واحد بر میلی­گرم پروتئین) مشاهده شد (جدول 6). در شرایط تنش شدید فعالیت آنزیم پلی‌فنل­اکسیداز به‌طور معنی­داری تشدید شد؛ به‌طوری‌که لاین 3 (44/8 واحد بر میلی­گرم پروتئین) بیشترین فعالیت پلی‌فنل­اکسیداز را در شرایط تنش شدید و مرحله دوم نمونه­برداری (شش روز پس از تنش) نشان دادند. بااین‌وجود میزان فعالیت پلی‌فنل­اکسیداز در مرحله بازیابی کاهش معنی­داری نشان داد. لاین 2 کمترین میزان پلی‌فنل­اکسیداز (23/2 واحد بر میلی­گرم پروتئین) را در شرایط شاهد و اولین مرحله نمونه­برداری (80% ظرفیت زراعی و سه روز پس از تنش) نشان داد. همچنین بیشترین میزان تغییر در فعالیت آنزیم پلی­فنل­اکسیداز در لاین 3 و شرایط تنش شدید و آبیاری مجدد مشاهده شد. نتایج نشان داد که تنش خشکی به‌ویژه تنش شدید موجب افزایش فعالیت بیشتر آنزیم پراکسیداز در لاین 2 و 3 عدس شد؛ ولی در لاین 4 و 6 تغییر معنی‌داری در فعالیت این آنزیم در شرایط تنش مشاهده نشد (جدول 6).

جدول 5. تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی در لاین‌های عدس در شرایط تنش خشکی.

جدول 6. تأثیر تنش خشکی و آبیاری مجدد بر صفات بیوشیمیایی لاین‌های عدس.

بیشترین میزان فعالیت پراکسیداز در لاین 2 (25/38 واحد بر میلی­گرم پروتئین) در شرایط تنش شدید و مرحله دوم نمونه­برداری (30% ظرفیت زراعی و شش روز) مشاهده شد. با این ‌وجود میزان فعالیت پراکسیداز در مرحله بازیابی کاهش معنی­داری نشان داد و این کاهش در لاین 2 بیشتر از لاین‌ها دیگر بود. همچنین لاین 2 کمترین میزان فعالیت پراکسیداز (85/17 واحد بر میلی­گرم پروتئین) را در شرایط نرمال و زمان دوم نمونه­برداری نشان داد.

تحت تنش خشکی القای فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدانی توسط گیاه یک سازوکار دفاعی است که از طریق آن بر آسیب سلولی ناشی از تنش اکسیداتیو غلبه می‌کند (Talaat et al., 2015). در این پژوهش مشاهده شد که میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان در لاین 2 و 3 بیشتر از سایر لاین‌ها در شرایط تنش متوسط و شدید بود. افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدان در شرایط تنش می­تواند از آسیب­های ناشی از تنش اکسیداتیو بکاهد. به نظر می‌رسد واکنش لاین‌ها در فعال­سازی آنزیم­های آنتی­اکسیدان در شرایط تنش خشکی و ریکاوری متفاوت باشد. بنابراین لاین‌های متحمل مانند لاین 2 فعالیت آنزیمی (کاتالاز، پراکسیداز و پلی­فنل­اکسیداز) بیشتری نسبت به سایر لاین‌ها نشان دادند. مطالعات مختلف تحت شرایط تنش تغییرات متعددی را در فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان نشان داده­اند (Talaat et al., 2015).

3-5. عملکرد و اجزای عملکرد

نتایج نشان داد که اثر لاین، تنش خشکی و همچنین برهمکنش بین آنها بر میزان عملکرد دانه، وزن 100 دانه، تعداد غلاف در بوته، تعداد دانه در بوته در سطح یک درصد معنی­دار است (جدول 7). تعداد غلاف در بوته و تعداد دانه در بوته در اثر تنش خشکی متوسط (55% ظرفیت زراعی) و شدید (30% ظرفیت زراعی) در تمامی لاین‌ها کاهش یافت؛ به‌طوری­که لاین 2 بیشترین تعداد غلاف در بوته و تعداد دانه در بوته را (به­ترتیب 94/23 و 14/7 گرم در بوته) در شرایط بدون تنش (80% ظرفیت زراعی) نشان دادند. درحالی‌که کمترین تعداد غلاف در بوته در لاین 1 و 5 (44/13 گرم در بوته) و کمترین تعداد دانه در بوته در لاین 4 (97/1 گرم در بوته) در شرایط تنش شدید (30% ظرفیت زراعی) مشاهده شد (جدول 8). وزن صد دانه و عملکرد دانه نیز در اثر تنش خشکی متوسط و شدید (به­ترتیب 55 و 30 % ظرفیت زراعی) کاهش یافت؛ به‌طوری­که بیشترین وزن صددانه در لاین 3 در شرایط نرمال (83/4 گرم در بوته) و بیشترین عملکرد دانه در لاین 2 (53/7 گرم در بوته) در شرایط نرمال و کمترین وزن صددانه در بوته در شرایط تنش خشکی شدید در لاین‌ 1 و 6 (23/2 ~ گرم در بوته) مشاهده شد همچنین کمترین میزان عملکرد دانه در لاین 1 و تنش خشکی شدید (60/0 گرم در بوته) مشاهده شد (جدول 8). 

تنش خشکی در مرحله گلدهی و پر شدن بذر باعث کاهش عملکرد و اجزای عملکرد شد. اگرچه لاین 2 در شرایط نرمال و تنش متوسط (55% ظرفیت زراعی) بیشترین عملکرد را داشتند، اما در شرایط تنش خشکی کاهش عملکرد نشان دادند. نتایج ما مطابق با گزارش‌های قبلی نشان‌دهنده تنوع قابل ‌توجه بین لاین‌ها از نظر عملکرد و اجزای عملکرد است که نشان‌دهنده وجود تنوع ژنتیکی برای این ویژگی‌ها در مواد ژنتیکی ارزیابی‌شده در شرایط تنش آبی است (Sehgal et al., 2019). در یک مطالعه روی چهار ژنوتیپ عدس تحت تنش خشکی تفاوت معنی داری بین ژنوتیپ‌ها از نظر پاسخ‌های فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی آنها گزارش شد. به نظر می‌رسد که عدم کارایی آب در این دوره حساس باعث کاهش قابل توجه عملکرد و اجزای عملکرد شده است. در مقابل، آبیاری مناسب در زمان پر شدن بذر منجر به افزایش محصول فتوسنتزی و انتقال آنها به بذر و در نتیجه افزایش وزن بذر شد (Taylor et al., 2013). همچنین عدم وجود رطوبت کافی در گلدهی به‌طور قابل توجهی تشکیل بذر و باروری آن را کاهش می­دهد و اگر کمبود آب در مرحله پرشدن دانه رخ دهد، می‌تواند به‌طور قابل توجهی تولید محصولات فتوسنتزی و انتقال آن را به بذر کاهش دهد که نتیجه آن کوچک­شدن دانه و کاهش وزن دانه می‌شود(Plaut et al., 2004)  . نتایج تحقیقات دیگر موید آن است که عملکرد دانه و اجزای عملکرد در شرایط تنش کاهش می‌یابد. تنش خشکی منجر به فتوسنتز غیر طبیعی و گرده‌های عقیم می‌شود و همچنین انتقال مواد برای ذخیره­سازی بذر را کاهش می‌دهد که می‌تواند منجر به کاهش وزن بذر شود
 (Mollasadeghi & Dadbakhsh, 2011). براساس نتایج این پژوهش، لاین‌ 2 در هر دو شرایط تنش توانایی بالایی در حفظ عملکرد نسبت به سایر لاین‌ها نشان دادند.

3-6. همبستگی

نتایج تجزیه همبستگی بین صفات نشان داد که میزان کلروفیل و کارتنوئید برگ همبستگی مثبت و معنی­داری با یکدیگر داشتند (شکل 2). فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدان همبستگی مثبت و معنی­داری با یکدیگر داشتند. علاوه بر این، میزان کلروفیل با آنزیم­های آنتی­اکسیدان همبستگی منفی و معنی­داری داشت. همچنین همبستگی مثبت و معنی­داری بین میزان MDA و میزان H₂O₂ مشاهده شد؛ درحالی‌که همبستگی H₂O₂ با پروتئین منفی و معنی­دار بود (شکل 2).

جدول 7. جدول تجزیه واریانس صفات عملکرد لاین‌های عدس.

جدول 8. تأثیر تنش خشکی بر صفات عملکرد لاین‌های عدس.

4. نتیجه‌گیری

در این پژوهش تنش خشکی باعث کاهش کلروفیل و پروتئین در همه لاین‌ها در شرایط تنش متوسط و شدید شد، اما کاهش این صفات در لاین‌های مختلف متفاوت بود. همچنین تنش خشکی به‌طور قابل ‌توجهی غلظت پرولین و فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدان را در برگ­ها تغییر داد. بااین‌حال لاین‌های عدس در مراحل اول و دوم تنش شدید، کاهش شدیدی در صفات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی نشان دادند؛ اما در مرحله بازیابی بهبود رشد و کاهش اثرات منفی تنش مانند کاهش میزان MDA و H₂O₂ قابل ‌مشاهده بود. نتایج همبستگی نشان داد که آنزیم­های آنتی­اکسیدان همبستگی مثبت و معنی­داری با پرولین داشتند. همچنین لاین 2 دارای بیشترین عملکرد در شرایط نرمال و تنش خشکی بود. این لاین‌ توانایی بالایی در تحمل به تنش خشکی نشان داد؛ در نتیجه، بر اساس نتایج این تحقیق لاین 2 لاین‌ مناسبی برای کشت در شرایط منطقه می­تواند باشد. بااین‌حال، مطالعات بیشتر روی این لاین‌ها در مورد بیان ژن مرتبط با تحمل به خشکی مورد نیاز خواهد بود.

شکل 2. ضرایب همبستگی پیرسون در بین صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی عدس در شرایط تنش و نرمال. ضرایب همبستگی با مقادیر مطلق بالاتر از 20/0 و 26/0 به­ترتیب در سطح احتمال آماری پنج و یک درصد معنی­دار بود. اشکال بیضی با رنگ‌های تیره نشان‌دهنده همبستگی بیشتر (نزدیک به 1 یا 1-) و اشکال کروی‌تر با رنگ‌های روشن نشان‌دهنده ضریب همبستگی نزدیک به صفر هستند.

5. منابع

Abrishamchi, P., Ganjeali, A., & Sakeni, H. (2012). Evaluation of morphological traits, proline content and antioxidant enzymes activity in chickpea genotypes (Cicer arietinum L.) under drought stress. Iranian Journal of Pulses Resarch, 3, 17-30. (In Persian).

Aebi, H. (1984). Catalase in vitro. Methods in Enzymology, 105, 121–126.

Ahmed, I.M., Dai, H., Zheng, W., Cao, F., Zhang, G., Sun, D., & Wu, F. (2013). Genotypic differences in physiological characteristics in the tolerance to drought and salinity combined stress between Tibetan wild and cultivated barley. Plant Physiology and Biochemistry, 63, 49–60.

Ahmadi, A., Amini Dehaghi, M., Sedghi, M., & Mansourifar, C. (2020). The effect of drought stress on antioxidant enzyme activity and chlorophyll content of some advanced genotypes of lentil (Lens culinaris Medik). Enviromental Stress in Crope Seinces, 12, 1105- 1116. https://doi.org/10.1093/aob/mcn125.

Aranjuelo, I., Molero, G., Erice, G., Avice, J.C., & Nogués, S. (2011). Plant physiology and proteomics reveals the leaf response to drought in alfalfa (Medicago sativa L.). Journal of Experimental Botany, 62, 111–123. Doi: 10.1093/jxb/erq24.

Arnon, A. (1967). Method of extraction of chlorophyll in the plants. Agronomy Journal, 23, 112–121.

Ashraf, S., Nazemi, A., & AghaKouchak, A. (2021). Anthropogenic drought dominates groundwater depletion in Iran. Scientific Reports, 11, 1–10.

Bahadoran, M., Abrishamchi, P., Ejtehadi, H., & Ghassemzadeh, F. (2015). Study on some physiological characteristics of Salsola richteri in drought conditions in the two desert regions of the South Khorasan province. Plant Biology, 7(24), 1-14. (In Persian).

Barnabás, B., Jäger, K., & Fehér, A. (2008). The effect of drought and heat stress on reproductive processes in cereals. Plant, Cell & Environment, 31, 11–38.

Bates, L., Waldren, S., & Teare, I. (1973). Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil, 39, 205–207.

Blokhina, O., Virolainen, E., & Fagerstedt, K.V. (2003). Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: A review. Annals of Botany, 91(2), 179-194.

Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Annals of Biochemistry, 72, 248–254. https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3.

Chen, D., Wang, S., Cao, B., et al. (2016). Genotypic variation in growth and physiological response to drought stress and re-watering reveals the critical role of recovery in drought adaptation in maize seedlings. Frontiers in Plant Science, 6, 1–15. https://doi.org/10.3389/fpls.2015.01241.

Demiral, T., & Türkan, I. (2004). Does exogenous glycine betaine affect antioxidative system of rice seedlings under NaCl treatment? Journal of Plant Physiology, 161, 1089-1100.

Emadodin, I., Reinsch, T., & Taube, F. (2019). Drought and desertification in Iran. Hydrology 6.

Guo, Z., Ou, W., Lu, S., & Zhong, Q. (2006). Differential responses of antioxidative system to chilling and drought in four rice cultivars differing in sensitivity. Plant Physiology and Biochemistry, 44, 828-836.

Hazrati, R., Zare, N., Asghari, R., Sheikhzadeh, P., & Johari-Ahar, M. (2022). Biologically synthesized CuO nanoparticles induce physiological, metabolic, and molecular changes in the hazel cell cultures. Applied Microbiology and Biotechnology, 106, 6017–603. https://doi.org/10.1007/s00253-022-12107-6.

Hura, T., Grzesiak, S., Hura, K., Elisabeth Thiemt, E., Tokarz, K., & Wedzony, M. (2007). Physiological and biochemical tools useful in drought-tolerance detection in genotypes of winter triticale: Accumulation of ferulic acid correlates with drought tolerance. Annals of Botany, 100, 767–775.

Kar, M., & Mishra, D. (1976). Catalase, peroxidase and polyphenol oxidase activity during rice leaf senescence. Plant Physiology, 57, 315–319.

Kumar, S., Barpete, S., Kumar, J., Gupta, P., & Sarker, A. (2013). Global lentil production: Constraints and strategies. SATSA Mukhapatra–Annu Tech, 17, 1-13.

Ministry of Agricultural Jahad (2016). Agricultural Products Statistics. p. 19. (In Persian).

Mollasadeghi, V., & Dadbakhsh, A. (2011). Evaluation of some yield components in wheat genotypes under the influence of drought stress after flowering. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 5, 1137-1142.

Monakhova, O.F., & Chemyadev II. (2002). Protective role of kartolin-4 in wheat plants exposed to soil drought. Applied Biochemistry and Biotechnology, 38, 373–380.

Nasimi, P., Karimi, A., & Motaghian, H. (2019). Effects of biochar produced from date palm’s leaves on saturated hydraulic conductivity and soil moisture coefficients of sandy clay loam soil. Iranian Water Researches Journal, 13(3), 161-171.

Pintó-Marijuan, M., & Munné-Bosch, S. (2014). Photo-oxidative stress markers as a measure of abiotic stress-induced leaf senescence: Advantages and limitations. Journal of Experimental Botany, 65, 3845–3857. Doi: 10.1093/jxb/eru086.

Plaut, Z., Butow, B.J., Blumenthal, C.S., & Wrigley, C.W. (2004). Transport of dry matter into developing wheat kernels and its contribution to grain yield under post-anthesis water deficit and elevated temperature. Field Crops Research, 86(2–3), 185–98. Doi: 10.1016/j.fcr.2003.08.005.

Rahbarian, R., Khavari-Nejad, R., Ganjeali, A., Bagheri, A.R., & Najafi, F. (2011). Drought stress effects on photosynthesis, chlorophyll fluorescence and water relations in tolerant and susceptible chickpea (Cicer arietinum L.) genotypes. Acta Biologica Cracoviensia, 53, 47-56.

Reda, A. (2015). Lentil (Lens culinaris Medikus) current status and future prospect of production in Ethiopia. Advances in Plants & Agriculture Research, 2, 00040.

Sehgal, A., Kumari, S., Kalpna, B., Shiv, K., Jitendra K., Vara Prasad, P.V., Kadambot Siddique, H., & Harsh Nayyar, M. (2019). Influence of drought and heat stress, applied independently or in combination during seed development, on qualitative and quantitative aspects of seeds of lentil (Lens culinaris Medikus) genotypes, differing in drought sensitivity. Plant Cell and Environment, 42(1), 198–211. Doi: 10.1111/pce.13328.

Singh, D., Singh, C.K., Taunk, J., Jadon, V., Pal, M., & Gailkwad, K. (2019). Genome wide transcriptome analysis reveals vital role of heat responsive genes in regulatory mechanisms of lentil (Lens culinaris Medikus). Science Reporter, 9, 1–19. https://doi.org/10.1038/s41598-019-49496-0.

Sinha, R., Kumar, A., Anil, P., & Singh, K. (2018). Physiological, biochemical and molecular responses of lentil (Lens culinaris Medik.) genotypes under drought stress. Indian Journal of Plant Physiology, 56, 47-57. https://doi.org/10.1007/s40502-018-0411-7.

Srivastava, R., & Vasishtha, H. (2012). Saponins and lectins of Indian chickpeas (Cicer arietinum) and lentils (Lens culinaris). Indian Journal of Agricultural Biochemistry, 25, 44-47.

Talaat, N.B., Shawky, B.T., & Ibrahim, A.S. (2015). Alleviation of drought-induced oxidative stress in maize (Zea mays L.) plants by dual application of 24-epibrassinolide and spermine. Enviromental and Experimental Botany, 113, 47–58.

Tariq, A., Pan, K., Olatunji, O.A., Graciano, C., Li, Z., Wu, X., Chen, W., Song, D., Huang, D., Xue, T., & Zhang, A. (2018). Phosphorous fertilization alleviates drought effects on Alnus cremastogyne by regulating its antioxidant and osmotic potential. Scientific Reports, 8, 1–11. https://doi.org/10.1038/s41598-018-24038-2.

Taylor, P., Adele, M., Maria, S., Umberto, A., Carmelo, S., Dipartimento, A., Università, M., Località, F., Reggio, C., Federico, I., & Via, U. (2013). Effect of PEG-induced drought stress on seed germination of four lentil genotypes. Journal of Plant Interactions, 110, 37–41. Doi: 10.1080/17429145.2013.835880.

Valentovic, P., Luxova, M., Kolarovic, L., & Gasparicova, O. (2006). Effect of osmotic stress on compatible solutes content, membrane stability and water relations in two maize cultivars. Plant Soil Environmental, 52, 186-191.

Ying, Y., Song, Q., Jacobs, L.L., Mei, D.F., Liu, L., Jin, S.H., et al. (2015). Physiological response to drought stress in Camptotheca acuminata seedlings from two provenances. Frontiers in Plant Science, 6, 361. Doi: 10.3389/fpls.2015.00361.

Zaho, S., Xu, C., & Zou, Q. (1994). Improvements of the method for measurement of malondialdehyde in plant tissue. Plant Physiology, 30, 207–210.

Zaragoza-Martínez, F., Lucho-Constantino, G.G., Ponce-Noyola, T., Esparza-Garcıa, F., Poggi-Varaldo, H., Cerda-Garcı´a-Rojas, C.M., Trejo-Tapia, G., & Ramous-Valdivia, C. (2016). Jasmonic acid stimulates the oxidative responses and triterpene production in Jatropha curcas cell suspension cultures through mevalonate as biosynthetic precursor. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 127, 47–56. https://doi.org/10.1007/s11240-016-1028-z.