مقدمه

در کشور ایران تولیدات دامی نقش مهمی در چرخه کشاورزی دارند. ۸۰ درصد از تولید لبنیات و گوشت گاو جهان در کشورهای در حال ‌توسعه مورد استفاده قرار می‌گیرد. این کشورها تنها ۲۱ درصد از میزان شیر و ۳۴ درصد از گوشت جهان را تولید می‌کنند؛ بنابراین افزایش تولیدات دامی در این کشورها از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. کارشناسان روش‌های متنوعی از جمله تلقیح مصنوعی را برای افزایش فرآورده‌های دامی ارائه کرده‌اند. یکی از سریع‌ترین و ساده‌ترین راه‌ها برای افزایش تولید در دام تلقیح مصنوعی است. تلقیح مصنوعی به‌عنوان یک تکنیک در اصلاح نژاد دام و برای پیشگیری از انتقال و انتشار بیماری‌ها و همچنین به لحاظ بالا بودن ارزش اقتصادی و سهولت در انجام آن در سطح وسیعی در دنیای امروز مورد استفاده قرار می‌گیرد. علی‌رغم این که تلقیح مصنوعی به‌عنوان عامل پیشگیری و کنترل از بیماری‌های عفونی محسوب می‌شود ولی خود بالقوه می‌تواند در صورت عدم رعایت ضوابط بهداشتی سبب انتشار بیماری‌ها در سطح گسترده در مقایسه با جفت‌گیری طبیعی شود.

از جمله بیماری‌هایی که طی تلقیح مصنوعی می‌تواند منتقل شود بیماری IBR است (1). بیماری IBR یک بیماری مهم برای همه گاوداران محسوب می‌شود زیرا میزان بیماریزایی آن بالا است و می‌تواند یک مانع مهم برای تجارت بین‌المللی باشد. عامل بیماری تورم عفونی بینی و نای گاو، Bovine Herpes Virus-1، یک آلفا هرپس ویروس است. هرپس ویروس عامل تضعیف‌کننده سیستم ایمنی بوده لذا زمینه را برای ایجاد عفونت‌های ثانویه فراهم می‌کند و یکی از رایج‌ترین پاتوژن‌های موجود در مایع منی گاو است (2). گاوهای نر نقش مهمی در انتشار فرم تناسلی دارند زیرا ویروس در هر دو فاز حاد و نهفته عفونت از منی دفع می‌شود. شناسایی علائم بیماری مهم است و ممکن است همیشه در هنگام شیوع BHV1 در گاوهای نر علائم عفونت مشاهده نشود (3). در کشورهایی با تولید لبنیات بالا و شرکت‌های تولیدی گوشت، شیوع بیماری در سطح گله‌ها ۷۰ تا ۸۵ درصد به ثبت رسیده است. BHV1 یک عفونت اندمیک در گله محسوب می‌شود که وقوع آن غیر قابل پیش‌بینی است (4). سقط‌جنین، ناباروری در گاو، کاهش تولید، مرگ ناشی از فرم تنفسی بیماری در تمام سنین، مرگ ناشی از فرم بسیار کشنده بیماری در گوساله‌های جوان، هزینه درمان به علت عفونت‌های ثانویه باکتریایی دستگاه تنفسی، عفونت پنهان در دام‌های مولد از اثرات زیان‌بار بیماری در دام‌های آلوده است که موجب بروز مشکلات و محدودیت در تجارت ملی، منطقه‌ای و بین‌المللی دام و اسپرم و ورود دام مولد به مراکز تلقیح مصنوعی می‌شود؛ بنابراین هر برنامه سلامت گاو باید دارای یک استراتژی کنترل باشد (5). آلودگی منی به ویروس یکی از راه‌های گسترش بیماری در بین گاوهای شیری است، ازاین‌رو در طی مطالعه حاضر سعی شده است تا حضور ویروس را در اسپرم‌های منجمد تولید داخل، مصرفی گاوداری‌های صنعتی مورد بررسی قرار داده شود.

 مواد و روش کار

مشخصات توصیفی نمونه‌ها: در مطالعه حاضر تعداد نمونه مورد نیاز بر پایه confidence level ۹۵ درصد، دقت ۵ درصد، جمعیت ۲۵۰ رأس و شیوع ۵۰ درصد حدود ۱۴۰ نمونه محاسبه ‌شد. نمونه‌ها از ۴ مرکز فروش اسپرم گاو در سطح شهرستان مشهد خریداری‌ شد که از بین آن‌ها تعداد ۳ نمونه از نژاد جرزی، ۲ نمونه نژاد براون سوئیس، ۶ نمونه مون بیلیار و بقیه هولشتاین بود. نمونه‌ها پس از خریداری درون تانک ازت قرار داده شد و به آزمایشگاه منتقل شد. پایت‌ها در آب ۳۵ درجه سانتی‌گراد ذوب و به درون میکروتیوب تخلیه شدند. مطابق مطالب درج ‌شده دفترچه راهنمای کیت (Exgene Genomic DNA Micro.GeneAll ساخت Germany)، از روش اتصال سیلیکا برای خالص‌سازی DNA استفاده شد. DNA استخراج‌ شده از مایع منی به میکروتیوب ۵/۱ میلی‌لیتری وارد و در دمای ۲۰ – درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

نحوه ارزیابی مولکولی: برای ارزیابی کیفیت نمونه ۵۰ میکرولیتر از DNA استخراج‌ شده را درون کوت مخصوص دستگاه قرار داده و جذب نوری نمونه در دستگاه بایوفتومتر اپندورف در طول موج های 230، 260، 280 و 320 خوانده شد.

نمونه‌های DNA که نسبت A280 / A260 ۷/۱ تا ۲ و نسبت A260 / A230 بیشتر از ۵/۱ و مقدار A260 باید بین ۱/۰ تا ۱ بود به عنوان نمونه با کیفیت وارد روند PCR شد در غیر این صورت مراحل استخراج مجدد تکرار گردید.

برای اطمینان از درستی روند استخراج ابتدا آزمایش PCR با پرایمر PRM1 به‌عنوان House keeping gene انجام شد تا صحت استخراج DNA محرز شود. PRM1 ژنی است که در همه اسپرم‌ها وجود دارد. اطلاعات مربوط به پرایمرها و سایز باند مورد انتظار در جدول ۱ و برنامه‌ریزی حرارتی دستگاه ترموسایکلر در جدول ۲ آورده شده است. جهت کنترل مثبت از نمونه‌های DNA  استخراج ‌شده از جنین‌های مثبت استفاده شد. در این نمونه همگی مواد و محلول‌های مورد استفاده درون لوله ریخته شد و فقط به‌جای DNA نمونه مورد بررسی، از یک نمونه مثبت استفاده شد. برای هر بار PCR علاوه بر نمونه کنترل مثبت نمونه کنترل منفی که فاقد DNA مورد آزمایش فوق بوده اما همگی شرایط آن با بقیه نمونه‌ها در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز یکسان بود، قرار داده شد. اطلاعات مربوط به پرایمرها و سایز باند مورد انتظار PCR مربوط به IBR در جدول ۱ و برنامه‌ریزی حرارتی دستگاه ترموسایکلر در جدول ۳ آورده شده است. بعد از انجام PCR، برای آشکارسازی و مشاهده محصول و نتیجه واکنش از روش الکتروفورز افقی استفاده شد.

آنالیز آماری: نمونه مثبت مورد آزمایش همراه نمونه‌ای که به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد جهت تعیین توالی دوطرفه به شرکت ژن فن‌آوران ارسال شد. خوانش دوطرفه نمونه کنترل مثبت و نمونه تحت آزمایش هر یک به طور جداگانه مورد ارزیابی قرار گرفت. در نهایت توالی به دست آمده از هر دو نمونه توسط نرم‌افزار EMBOSS Needle-Alignment باهم دیگر مورد مقایسه قرار گرفت. توالی نهایی با استفاده از نرم‌افزار nucleotide Blast با توالی‌های ثبت ‌شده در بانک جهانی ژن مقایسه شد.

نتایج

در مطالعه حاضر ۱۴۰ نمونه پایت اسپرم منجمد در سطح شهرستان مشهد جمع‌آوری شد و اطلاعات مربوط به هر پایت و شماره آن‌ها ثبت شد. توزیع نژادی نمونه‌ها شامل 3 نمونه از نژاد جرزی، 2 نمونه نژاد براون سوئیس، 6 نمونه مون بیلیار و بقیه هولشتاین بودند، پس از انجام تست کمیت و کیفیت DNA توسط بایوفوتومتر برای انجام PCR استفاده شد.

نتیجه آزمایش PCR با پرایمر PRM1 روی ژن Protamine 1 به‌عنوان house keeping gene برای هر کدام از نمونه‌ها انجام شد (تصویر 1). برای نمونه‌هایی که فاقد باند بودند دو مرتبه از مقدار نمونه اولیه که باقی ‌مانده بود، استخراج گذاشته شد و سپس مجدداً آزمایش PCR انجام شد. در PCR با پرایمر IBR روی ژن BoHV-1 tk (thymidine kinase) به‌عنوان نمونه کنترل مثبت از بافت کبد سقط‌جنینی که قبلاً IBR آن مثبت اعلام‌ شده بود به همراه نمونه‌ها در شرایط یکسان DNA استخراج شد و PCR آن به همراه نمونه‌ها گذاشته شد. نمونه کنترل مثبت در محدودهbp  ۲۰۲ باند ایجاد کرد. لدر مورد استفاده bp ۱۰۰ است. از بین ۱۴۰ نمونه یک نمونه از نژاد هولشتاین مطابق تصویر 2 در محدوده bp ۲۰۲ باند داد و مثبت در نظر گرفته شد. روی DNA استخراج ‌شده نمونه مثبت مجدد PCR صورت گرفت و همچنین استخراج مجدد از الباقی محتویات پایت انجام شد که در همگی موارد آلوده به ژنوم ویروس تشخیص داده شد. برای اطمینان بیشتر از پایت دوم همین اسپرم روند استخراج و PCR انجام شد که آن نمونه هم آلوده به ژنوم ویروس تشخیص داده شد. برای اطمینان از روند کار از ابتدا تعداد ۳ نمونه به شکل تکراری مورد ارزیابی قرار گرفتند که در همگی موارد نتایج یکسان بود. توالی نهایی با استفاده از نرم‌افزار nucleotide Blast با توالی‌های ثبت ‌شده در بانک جهانی ژن مورد مقایسه قرار گرفت. نتیجه مقایسه با بانک جهانی ژن شباهت 100 درصد با میزان هم‌پوشانی 100 درصد با جدایه‌های مختلف آلفا هرپس ویروس گاوی I بود. برخی از این جدایه‌ها شامل آلفا هرپس ویروس گاوی I جدایه لوس‌آنجلس (MF421714)، تگزاس (KM258882)، نیویورک (KM258880)، آمریکا (MG407775- MG407792)، هند (KY215944) است. همچنین با جدایه‌های استرالیا (KM258881) و چین (JN787955) دارای 99 درصد شباهت هستند.

بحث

تولیدمثل از فاکتورهای اصلی رونق اقتصادی صنعت گاوداری است. هر عاملی که به این فاکتور لطمه وارد نماید موجب اختلال در صنعت پرورش گاو شیری شده و به‌تبع آن به اقتصاد کشور صدمه وارد می‌آورد. سقط ‌جنین در گاوهای شیری عموماً به از بین رفتن جنین در بین روزهای ۴۲ تا ۲۶۰ آبستنی اطلاق می‌شود. علاوه بر این، ناباروری ناشی از سقط و افزایش فاصله تا آبستنی بعدی از دیگر زیان‌هایی هستند که به گله‌های مبتلا به سقط وارد می‌آیند (6). بر پایه گزارش‌های موجود میزان شیوع سقط در گله‌های گاو شیری کمتر از ۹/۲ درصد است که عامل بروز سقط تنها در ۸/۴۵ درصد این موارد، تشخیص داده‌ شده است (7). ۵۰ تا ۶۵ درصد سقط‌ها عامل باکتریایی، 20 تا ۲۵ درصد عامل قارچی و ۱۵ تا ۲۵ درصد علت ویروسی دارند (8).

ویروس عامل رینوتراکئیت عفونی گاو، آلفا هرپس ویروس گاوی تیپ I است که در سراسر جهان وجود داشته و باعث بیماری تنفسی حاد به همراه تورم ملتحمه چشم می‌شود، همچنین باعث بیماری در ارگان‌های تناسلی از جمله ناباروری و سقط در تلیسه‌ها و گاوها می‌شود (6). نظرات متفاوتی درباره نقش ویروس IBR در ناباروری وجود دارد. در مطالعات اولیه Parsonson و Helling در سال ۱۹۶۵ اظهار داشتند که ویروس در ناباروری تأثیری ندارد. در حالی که Kendrick و Mcentee در سال ۱۹۶۷ دریافتند که اگر منی آلوده به ویروس برای تلقیح مصنوعی استفاده شود، میزان آبستنی کاهش می‌یابد. به طور تجربی وقتی منی آلوده به ویروس به داخل رحم تلقیح می‌شود، باعث نکروز شدید و اندومتریت می‌شود اما جراحات در محل سایت ویروس باقی می‌ماند و طی ۱ تا ۲ هفته از بین می‌رود (9). Hens khars و همکاران در سال 1986 اظهار کردند که تلقیح ویروس IBR به داخل رحم باعث اندومتریت می‌شود و به ‌احتمال زیاد باعث ناباروری نیز می‌شود بنابراین تلقیح مصنوعی با منی آلوده مسلماً با مرگ رویانی در ارتباط است. عفونت ویروسی می‌تواند باعث یک نکروز دوطرفه تخمدانی شود و به نظر می‌رسد جسم زرد به عفونت حساس‌تر است، به خصوص در چند روز اول پس از تخمک‌گذاری این حساسیت بیشتر می‌شود، این آسیب ممکن است به طور مستقیم روی عملکرد جسم زرد تأثیر بگذارد و باعث کاهش تولید پروژسترن شود و در نتیجه بقای جنین به خطر ‌افتد. ویروس همچنین می‌تواند به وسیله تهاجم مستقیم به سلول‌ها باعث مرگ رویان شود (5). Oliveira و همکاران در سال ۲۰۱۱ طی مطالعه خود ژنوم BHV-1 و BHV-5 را از نمونه‌های منی گاو به‌وسیله تکنیک species-specific nested polymerase chain reactions (nPCRs) شناسایی کردند. در آن مطالعه از ۵۳ نمونه منی تازه و ۲۳ نمونه منی منجمد گاوهای پرواری استفاده شد که در همه ۷۶ نمونه مایع منی DNA ویروس شناسایی شد. همه نمونه‌ها از نظر BHV-5 و ۳۴ مورد از نظر BHV-1 مثبت بودند (1).  Dekaو همکاران در سال 2005، در 24 نمونه منی 12 گاو سرم منفی و 12 گاو سرم مثبت حضور ویروس BHV1 مورد مطالعه قرار دادند. برای شناسایی DNA ویروس BHV1 از روش PCR و پرایمر ژن gl استفاده کردند. در گاوهای سرم مثبت 50 درصد و در گاوهای سرم منفی 67/66 درصد نمونه‌ها مثبت شدند (11).

Nandi و همکاران در سال 2008، 1038 نمونه منی گاو را از مزارع مختلف هند جمع‌آوری کردند و با استفاده از PCR و پرایمر اختصاصی ژن gI ویروس BHV1 را مورد مطالعه قرار دادند؛ که از این تعداد تنها 30 نمونه برای ژنوم BHV1 مثبت شد. در این مطالعه مشخص شد که تکنیک PCR برخلاف روش جداسازی که حساسیت کمتر و زمان بیشتری نیاز دارد، بسیار حساس و سریع عمل می‌کند (12).

در مطالعه Masri و همکاران در سال1996 تست PCR برای شناسایی ژنوم BHV-1 در مایع منی گاو با ایزولاسیون ویروس مقایسه شد. این روش‌ها برای شناسایی BHV1 در مایع منی 4 گاوی که به‌صورت تجربی با ویروس آلوده ‌شده بودند، به‌کاربرده شد. در همه گاوهای آلوده، التهاب سر قضیب در روز سوم و balanoposthitis شدید در روز چهارم پس از آلودگی مشاهده شد. ویروس در منی تازه با روش PCR و جداسازی ویروس در دومین روز از آلودگی قبل از رخداد بالینی، شناسایی شد. در روش جداسازی، تا روز 7 پس از آلودگی در دو گاو و روز 9 و 11 در دو گاو دیگر، ویروس قابل شناسایی بود. در مقابل روش PCR توانست تا روز 18-14 پس از تلقیح آلودگی ژنوم ویروس را شناسایی کند. برای تشخیص انفرادی PCR، ویروس را حداقل 10-1 روز دیرتر از روش جداسازی، شناسایی می‌کند (1).

با توجه به نتایج این مطالعات حضور ویروس و متعاقب آن شناسایی ژنوم آن توسط PCR به صورت مستمر نیست و به شکل متناوب اتفاق می‌افتد، پس امکان آلودگی 139 نمونه دیگر در مطالعه حاضر منتفی نمی‌شود و با عنایت به مشاهده یک نمونه مثبت نیاز به بررسی‌های بیشتر روی خود گاوهای نر است.

در مطالعه انجام ‌شده توسط Morán1 و همکاران در سال 2013 حضور ژنوم ویروس BHV-1 BHV-4, BHV-5, در مایع منی گاوها از مبدأ آرژانتین و مراکز بین‌المللی توسط تست PCR بررسی شد. مهم‌ترین یافته این مطالعه شناسایی ژنوم BHV-1 در مایع منی 6 گاو از 70 گاو (6/8 درصد) نگهداری شده در مراکز تلقیح مصنوعی بود (2). نتایج این مطالعه نسبت به مطالعه حاضر آلودگی بیشتری را شناسایی نموده که علت آن می‌تواند بررسی بر روی انزال تازه گاوها باشد.

Isakov و همکاران در سال ۲۰۱۶، ۴۵۰ نمونه اسپرم منجمد را در مناطق مختلف اوکراین برای یک دوره بین سال‌های ۲۰۱۳ تا ۲۰۱۶ از نظر حضور گونه‌های پاتوژن کلامیدیا، مایکوپلاسما و BHV1 مورد مطالعه قرار دادند. نمونه‌ها از ۱۰ مزرعه در سراسر اوکراین جمع‌آوری ‌شده و توسط تست PCR تشخیصی با پروتکل استاندارد NSC (national scientific center) مورد آزمایش قرار گرفتند. با توجه به آنالیز محصولات حاصل از PCR ۲ مورد از بین ۵۸ نمونه (5/3 درصد) از منطقه Poltava از نظر BHV1 مثبت شدند و با توجه به نتایج به دست آمده، تست PCR دائم و منظم روی اسپرم گاوهای نر را ضروری دانستند (15). در مطالعه حاضر نیز میزان آلودگی ۷۱/۰ درصد بود که بسیار پایین‌تر از نتایج مطالعه فوق است. Vanessa Lopes و همکاران در سال 2020، به منظور ردیابی BHV1، 60 نمونه خون و ارگان‌های تناسلی از 60 گاو نر که واکسینه نشده بودند را مورد ارزیابی قرار دادند. قطعاتی از بیضه و اپی دیدیم به روش nested PCR و ایمونوفلورسانس مورد بررسی قرار گرفت. BHV1 در روش ایمونوفلورسانس در 9/95 درصد بافت بیضه و 100 درصد بافت اپی دیدیم مشاهده شد. در روش nested PCR، نوکلییک اسید ویروس در 2/59 درصد بافت بیضه و 5/75 در اپی دیدیم شناسایی شد. بر اساس این تشخیص BHV1 در بیضه‌ها و اپی دیدم گاوهای نر آلوده نشان دهنده منابع عفونت ویروسی برای مایع منی می‌باشند (16).

 Henzel و همکاران در سال 2019 با هدف مطالعه و بررسی آنتی بادی‌های خنثی کننده BHV1-5 در نمونه‌های سرم و شناسایی DNA ویروس در مایع منی گاوهای نر در مزارع، 372 نمونه سرم و منی را از 18 مزرعه جمع آوری کردند. نمونه‌های سرم به روش VN (virus neutralization) و نمونه‌های منی با روش PCR بررسی شدند. در روش VN آنتی بادی BHV1-5 در 7/66 درصد گاوهای نر شناسایی شد. 278 گاو برای BHV1 و 234 گاو برای BHV5 مثبت شدند. 43 گاو نر واکسینه شده 1/72 درصد از نظر سرولوژی منفی بودند. DNA BHV1 در منی 3 گاو نر تشخیص داده شد. تمام موارد مثبت حیواناتی بودند که هنگام نمونه‌گیری التهاب بیضه و سایر ضایعات تناسلی را نشان دادند. در حضور ضایعات بالینی مشهود در دستگاه تناسلی هر دو ویروس ممکن است در مایعات منی یافت شود. بر اساس نتایج شیوع بالای آنتی بادی‌های ویروس در گاو نر در مزارع در حال گردش می‌باشد (17).

Rania و همکاران در سال 2020 برای بررسی تأثیر عفونت ویروسی بر کیفیت مایع منی در گاوهای نر آلوده، مایع منی 40 گاو نر را به منظور جداسازی BHV1 و BVDV جمع آوری و با روش فلورسنت آنتی بادی و real time PCR مورد ارزیابی قرار دادند و 8 نمونه مثبت برای BHV1 ثبت شد. تحلیل آماری پارامترهای ارزیابی منی نشان داد که تفاوت معنی‌داری بین گروه آلوده به ویروس و گروه شاهد وجود دارد که نشان دهنده افزایش ناهنجاری‌های اسپرم و کاهش تحرک و قابلیت زنده‌مانی و غلظت اسپرم است. با توجه به این مطالعه گاوهای نر آلوده کیفیت مایع منی بسیار پایینی دارند و روش PCR یک روش آزمایشگاهی ایده‌ال برای تشخیص هر دو ویروس در مایع منی است (18).

Hammad Rehman و همکاران در سال 2020 نمونه‌های خون گاوهای نر جمع‌آوری شده از مناطق مختلف لاهور در پاکستان را مورد ارزیابی قرار دادند. از بین 100 نمونه خون، در 69 نمونه با استفاده از روش الایزا مثبت تشخیص داده شد. همچنین ژن گلیکو پروتئین g B با استفاده از روش PCR شناسایی شد. بر این اساس می‌توان گفت که BHV1  در پاکستان به شکل فعال وجود دارد (19).

نتیجه گیری نهایی: با توجه به نتایج مطالعه حاضر وجود یک نمونه مثبت در بین 140 مورد زنگ خطری برای گسترش بیماری از این طریق است و در بین 139 نمونه دیگر نیز با توجه به ورود دوره‌ای ویروس به منی باید بررسی‌های دقیق‌تری انجام شود. بهتر است از گاوهای سرم منفی در مراکز تلقیح مصنوعی استفاده شود و به منظور تست‌های سرولوژیکی بیشتر از گاوها خون گرفته شود و به توصیه OIE 21 روز بعد مایع منی جمع‌آوری شود. مطالعه حاضر نشان داد وجود یک آزمایشگاه مرجع برای کنترل و پایش مداوم اسپرم‌های منجمد تولید داخل و وارداتی و بررسی گاوهای تولید کننده اسپرم در ایران بسیار حائز اهمیت می‌باشد تا از گسترش بیماری‌ها به این طریق جلوگیری شود.

سپاسگزاری

از معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد جهت تأمین بودجه انجام این طرح با کد 43187/3 قدردانی می‌شود.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.