مقدمه

التهاب پستان یکی از زیان آورترین بیماری‌های مزارع گاو شیری است و فرم تحت بالینی این بیماری به علت پنهان ماندن از چشم دامدار سبب ضررهای اقتصادی سنگینی ناشی از کاهش تولید شیر، دور ریختن شیر، مستعد شدن دام به سایر بیماری‌ها، مشکلات تولید مثلی و حذف دام می‌شود (1). باکتری استافیلوکوکوس اورئوس از مهم‌ترین عوامل باکتریایی التهاب پستان تحت بالینی بوده که با داشتن آنزیم پنی‌سیلیناز به درمان با برخی از آنتی بیوتیک‌های خانواده بتالاکتام مقاوم است. دامپزشکان تا به امروز کوشیده‌اند تا با استفاده از آنتی‌بیوتیک‌های سنتتیک بر ورم پستان تحت بالینی ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس فائق آیند (2). با توجه به عوارض جانبی بالا، مقاومت آنتی‌بیوتیکی و باقی مانده دارویی آنتی‌بیوتیک‌های سنتتیک استفاده از ترکیبات گیاهی می‌تواند به عنوان راه حل مناسبی در جهت درمان التهاب پستان تحت بالینی ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس مطرح گردد (3). داروهای گیاهی دارای طیف متنوعی از اثرات درمانی و حداقل اثرات جانبی بوده و علاوه بر این امر می‌توان از آنان به عنوان راهکاری مناسب در مقابله با مقاومت دارویی استفاده نمود. در ضمن با توجه به تنوع پوشش گیاهی در ایران می‌توان با استفاده از این ترکیبات در جهت حمایت از تولید ملی و کاهش واردات دارویی نیز بهره جست (4). زیتون با نام علمی Olea europaea گیاهی از راسته‌ نعناسانان است. این گیاه بومی سوریه و جنوب ترکیه بوده و امروزه در تمام نقاط دنیا که دارای آب و هوای مدیترانه‌ای هستند، مورد کشت قرار می‌گیرد (5). در متون سنتی به خواصی همچون درمان تب ناشی از مالاریا به دنبال مصرف گیاه زیتون اشاره گردیده است (6). طی مطالعات علمی اثرات ضد‌میکروبی (7)، ضدالتهابی (8) و کاهندگی فشار خون (9) برگ این گیاه به اثبات رسیده و طی مطالعاتی اثر ضدباکتریایی عصاره برگ زیتون بر استافیلوکوکوس اورئوس نشان داده شده است (10،11). هدف از مطالعه حاضر تعیین حداقل غلظت مهاری یا همان MIC عصاره الکلی برگ زیتون بر استافیلوکوکوس اورئوس‌های جداسازی شده از گاوان مبتلا به التهاب پستان تحت بالینی  جهت دستیابی به داروی گیاهی مؤثر علیه التهاب پستان می‌باشد.

مواد و روش‌ کار

تهیه عصاره: پس از تهیه 2 کیلوگرم برگ زیتون در فروردین ماه سال 1396 از شهر سمنان، این گیاه به تأیید واحد پژوهش‌های گیاهی مؤسسه تحقیقات جهاد کشاورزی شهرستان سمنان رسید و پس از خشک شدن در سایه، گیاه مذکور به وسیله هاون به صورت پودر درآورده شد. پودر حاصل شده به مدت 15 دقیقه با رعایت نسبت 1 به 5 در متانول 80 درصد قرار گرفت و به مدت 5 روز بر روی شیکر قرار داده شد. سپس محلول به دست آمده با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره 1 صاف گردید و محلول عبور کرده از صافی با دستگاه تبخیر تحت خلاء (روتاری) خشک گشت. عصاره به دست آمده تا زمان استفاده در شیشه‌های تیره و دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگه داری ‌شد (12). در زمان آزمایش با مخلوط کردن 2/0 گرم از عصاره در 4 میلی لیتر محیط ‌آبگوشت BHI حاوی 5 درصد DMSO استوک اولیه با غلظت 50000 پی پی ام به دست آمد (13) و با توجه به مطالعات صورت گرفته بر اثرات ضدمیکروبی عصاره الکلی برگ زیتون (11)، از غلظت‌های 25، 31، 62، 125، 250، 500، 750، 1000، 2000، 4000، 8000، 12000، 16000، 20000 پی پی ام در مطالعه حاضر استفاده گردید.

نمونه‌گیری: حجم نمونه در مطالعه حاضر بر اساس فرمول کوکران [n= Z².P(1-P)/d²] و با توجه به مطالعه  Islamو همکاران در سال 2011 تعیین گردید (14) که مقادیر Z، P و d به ترتیب 96/1، 3/0 و 5 درصد در نظر گرفته شد و با توجه به جمعیت هدف، حجم نمونه محدود محاسبه گردید که عدد به دست آمده برابر با 301 بود. نمونه‌های شیر به صورت خوشه‌ای از گاوهای هلشتاین به ظاهر سالم از گاوداری صنعتی شهرستان سمنان تهیه شد. در هنگام نمونه هر گاو از لحاظ عدم وجود التهاب در پستان و کارتیه‌ها، عدم مشاهده لخته در شیر هر چهار کارتیه، فقدان علائم بالینی بیماری و تست کالیفرنیایی ورم پستان (CMT) مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین صورت که کارتیه به صورت کامل شسته شد و با الکل 70 درصد ریخته شده روی پنبه استریل ضدعفونی گردید. پس از خشک کردن کارتیه با حوله استریل یک بار مصرف، سه دوشش ابتدایی سرپستانک دور ریخته شد و 20 میلی‌لیتر شیر در لوله­های استریل جمع آوری گردید (15). هر نمونه شیر اخذ شده بلافاصله با رعایت شرایط دمایی 4- درجه سانتی‌گراد به آزمایشگاه دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان انتقال داده شد.

جداسازی باکتری: در آزمایشگاه هر نمونه‌ شیر مربوط به کارتیه مثبت در CMT به مدت 10 ثانیه ورتکس گردید و 10 میلی‌لیتر از آن با رعایت شرایط استریل به 90 میلی‌لیتر آبگوشت پپتون واتر افزوده گشت و مخلوط حاصله به مدت یک دقیقه بر روی شیکر گذاشته شد و سپس به مدت 24 ساعت در گرمخانه با دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. پس از این مدت نمونه‌‌ها از انکوباسیون خارج شده و از آنان در محیط‌های برد پارکر آگار کشت خطی و انکوباسیون 48 ساعته به عمل آمد. نمونه‌های مثبت شده در محیط مذکور که به صورت کلونی‌های سیاه کهربایی احاطه شده با حاله‌ای سفید بودند به عنوان استافیلوکوکوس اورئوس احتمالی در نظر گرفته شدند و برای خالص سازی تحت کشت در محیط نوترینت آگار قرار گرفتند. کشت مذکور به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرم‌خانه گذاری شد. کلنی‌های رشد کرده در این محیط با هدف تفریق باکتری استافیلوکوکوس اورئوس از سایر گونه‌های جنس استافیلوکوکوس تحت بررسی مرفولوژیک و آزمون‌های بیوشیمیایی کاتالاز، کوآگولاز. اُکسیداز، DNase، تولید استون و تخمیر D-مانیتول قرار گرفتند. در بررسی مرفولوژیک پس از تهیه گسترش بر روی اسلاید شیشه‌ای، رنگ آمیزی گرم از وجود سلول‌های باکتریایی‌ با ظاهر گرد، بنفش و خوشه‌ای حکایت داشت که نمایی شبیه به خوشه انگور را در ذهن بیننده تداعی می‌کرد (16). جهت ذخیره سازی باکتری هر نمونه، پرگنه ‌تأیید شده‌ استافیلوکوکوس اورئوس در محیط BHI براث به مدت 24 ساعت انکوبه شد، سپس 5/1 میلی‌لیتر از آن با 5/0 میلی‌‌لیتر گلیسیرین مخلوط گردید و تا زمان آزمایش در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد (17).

طراحی آزمایش: غلظت‌های مختلف عصاره الکلی برگ زیتون (25، 31، 62، 125، 250، 500، 750، 1000، 2000، 4000، 8000، 12000، 16000، 20000 پی پی ام) در محیط آزمایشگاهی برای تعیین حداقل غلظت بازدارنده (MIC) به روش میکرودایلوشن بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مورد ارزیابی قرار گرفت. هم‌چنین غلظت‌های تحت بازدارنده عصاره الکلی برگ زیتون بر منحنی رشد باکتری مذکور نیز بررسی شد.

تهیه میزان تلقیح باکتری: جهت تهیه میزان تلقیح باکتری از کشت استوک به داخل محیط آبگوشت BHI برده و در دمای 27 درجه سانتی­گراد به مدت 18 ساعت گرم‌خانه گذاری شد. سپس از کشت اول کشت مجددی داده شد و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 18 ساعت گرم‌خانه گذاری شد. از کشت دوم مقادیر مختلفی به داخل لوله کووتی که حاوی 4 میلی‌لیتر آبگوشت BHI استریل بود، منتقل شد تا جذب نوری 1/0 در طول موج 600 نانومتر به دست آید. سپس با انتقال 1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون باکتریایی داخل کووت، به لوله حاوی 9 میلی‌لیتر آب پپتونه 1/0 درصد رقت‌های متوالی تا ^6-10 تهیه شد و پس از کشت سطحی در محیط BHI آگار میزان غلظت باکتری در هر میلی‌لیتر سوسپانسیون باکتری با جذب نوری معادل 1/0 محاسبه شد. با مشخص شدن این عدد هر گاه که سوسپانسیون باکتریایی با جذب نوری 1/0 تهیه شود، تعداد باکتری در آن معادل عدد محاسبه شده بوده و می‌توان از این سوسپانسیون غلظت‌های دلخواه را تهیه نمود. البته در هر مورد تعداد دقیق باکتری تلقیح شده از طریق کشت هم‌زمان باکتری و شمارش تعداد کلونی محاسبه شد (18).

تعیین حداقل غلظت بازدارنده رشد به روش میکرودایلوشن: در مطالعه حاضر، جهت تعیین حداقل غلظت بازدارنده رشد به روش میکرودایلوشن از پلیت 96 خانه با چاهک ته گرد و با حجم 300 میکرولیتر استفاده گردید. غلظت‌های متوالی از عصاره الکلی برگ زیتون (25، 31، 62، 125، 250، 500، 750، 1000، 2000، 4000، 8000، 12000، 16000، 20000 پی پی ام) در آبگوشت BHI حاوی 5 درصد DMSO تهیه شد. سپس 200 میکرولیتر از عصاره به هر چاهک از پلیت‌های 96 خانه انتقال داده شد و تا 11 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی (با غلظت تقریبی CFU 10⁵ × 5 باکتری در هر میلی لیتر) در هر چاهک اضافه گردید (19). محتویات هر چاهک به مدت 2 دقیقه توسط Plate Reader مجهز به شیکر مخلوط شد. سپس جذب نوری با استفاده از Plate Reader در زمان صفر و با طول موج 35 درجه سانتی‌گراد گرم‌خانه‌گذاری شدند و بعد از اتمام گرم­خانه‌گذاری کدورت یا عدم کدورت در چاهک‌ها به صورت چشمی مشاهده گردید و با جذب نوری خوانده شده بعد از گرم‌خانه گذاری توسط Plate Reader تأیید شد. روش کار بدین صورت بود که افزایش جذب نوری به میزان بزرگ‌تر یا مساوی 1/0 نسبت به زمان صفر به معنی رشد باکتری و ایجاد کدورت و اولین غلظت عصاره که فاقد کدورت بود، به منزله حداقل غلظت بازدارنده رشد (MIC) در نظر گرفته شد (20).

بررسی اثر عصاره الکلی برگ زیتون بر نمودار رشد باکتری: در این مرحله اثر غلظت‌های تحت بازدارنده عصاره الکلی برگ زیتون بر رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در طی 24 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. غلظت‌های مورد استفاده شامل 1000، 4000 و 8000 پی پی ام بودند. بدین صورت که 10 میلی‌لیتر از محلول‌های تهیه شده با غلظت‌های مذکور در لوله استریل ریخته شد  و 100 میکرولیتر از سوسپانسیون حاوی 10⁵×5 cfu در هر میلی لیتر به هر لوله اضافه گردید. لوله‌ها در دمای 35 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند و در ساعات صفر، 2، 4، 6، 8، 10، 12 و 24 تحت کشت سه‌تایی در محیط BHI آگار قرار گرفتند و پس از یک گرم‌خانه‌گذاری 24 ساعته در دمای 35 درجه سانتی‌گراد، تعداد کلونی‌ها شمارش و تعداد باکتری‌ها بر حسب cfu/ml ثبت گردید (19).

تحلیل آماری: داده‌های حاصل از بررسی اثر عصاره بر نمودار رشد باکتری به روش رگرسیون خطی مدل سازی گردیدند و شیب نمودارها به روش آنالیز واریانس یک‌طرفه و تست تکمیلی توکی در سطح اطمینان 95 درصد مقایسه‌ شدند.

نتایج

نتایج مربوط به جداسازی باکتری:  در مطالعه حاضر 175 راس گاو مورد مطالعه قرار گرفت که از این تعداد 60 راس با سلامت بالینی دام، در آزمون کالیفرنیایی شیر مثبت و مشکوک به ورم پستان تحت بالینی اعلام شدند. طی بررسی آزمایشگاهی بر نمونه‌های مشکوک، از 14 نمونه عامل استافیلوکوکوس اورئوس جداسازی گردید.

نتایج مربوط به تعیین MIC عصاره: در تمام نمونه‌های مثبت از لحاظ استافیلوکوکوس اورئوس گوده حاوی 12000 پی پی ام از عصاره برگ زیتون، اولین گوده فاقد کدورت بود. همچنین نتایج حاصل از جذب نوری توسط دستگاه پلیت خوان در طول موج 600 نانومتر قبل و پس از انکوباسیون با نتایج مشاهده چشمی پلیت‌ها هم‌خوانی داشت.

نتایج مربوط به اثر عصاره بر روند رشد باکتری: غلظت‌های 4000 و 8000 پی پی ام نسبت به گروه کنترل سبب مهار معنی‌دار رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در طول 24 ساعت گردیدند (05/0P<). غلظت 1000 پی پی ام نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی‌داری نداشت (05/0P>) و فاقد اثر مهاری بر رشد باکتری در طول 24 ساعت بود (نمودار 1).

بحث

در مطالعه حاضر مشخص گردید که عصاره الکلی برگ زیتون نسبت به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس جدا سازی از شیر گاوهای مبتلا به ورم پستان تحت بالینی، دارای اثر ضدباکتریایی وابسته به دز است و حداقل غلظت مورد نیاز از عصاره الکلی این برگ برای مهار رشد باکتری مذکور 12000 پی پی ام می‌باشد. برگ زیتون سرشار از ترکیبات فنلی شامل هیدروکسی تیروزول، تیروزول،کافئیک اسید، پی-کوماریک اسید، وانیلیک اسید، وانیلین، اولئوروپین، لوتئولین، دیئوسمتین، روتین، ورباسکوزید، لوتئولین7-گلوکوزید، آپیژنین7-گلوکوزید و دیئوسمتین7-گلوکوزید بوده و بیشترین سهم ترکیبات فنلی در برگ زیتون به اولئوروپین و هیدروکسی‌تیروزول تعلق دارد که هیدروکسی‌تیروزول پیش ساز اولئوروپین است (21).

طی دو مطالعه‌ Fattouch و همکاران در سال 2007 و Estevinho و همکاران در سال 2008 مشخص گردید که ترکیبات فنولی دارای خاصیت ضد میکروبی می‌باشند (22،23). همچنین Doman و همکاران در سال 2009 نشان دادند که ترکیبات فنولی به‌وسیله اثر بر سطح غشای میکروارگانیسم‌ها اثر ضد میکروبی خود را اعمال می‌نمایند (24). پس با توجه به مطالعات مذکور می‌توان خاصیت آنتی بیوتیکی عصاره الکلی برگ زیتون را به ترکیبات فنلی موجود در آن نسبت داد.

بر اساس مطالعه‌ Acar و همکاران در سال 2010 مشخص گردید که عصاره‌های گیاهی بر باکتری‌های گرم مثبت اثر بهتری نسبت به باکتری‌های گرم منفی دارند (25). همچنین طی مطالعه‌ Kalemba و Kunicka در سال 2003 مشخص گردید که سطح هیدروفیل دیواره سلولی لیپوپلی ساکاریدی باکتری‌های گرم منفی به عنوان سدی در برابر آنتی بیوتیک­ها عمل می‌کند اما در باکتری‌های گرم مثبت، مواد ضد میکروبی به راحتی دیواره سلولی را تخریب می‌نمایند (26). بنابراین می‌توان گفت که ممکن است عصاره برگ زیتون بر باکتری‌های گرم مثبت از جمله استافیلوکوکوس اورئوس در مقایسه با عوامل باکتریایی گرم منفی ورم پستان مانند اشریشیاکلی اثربخشی بیشتری داشته باشد.

بر‌اساس مطالعه‌ Sudjana و همکاران در سال 2009 مشخص گردید که عصاره برگ زیتون دارای خاصیت ضد میکروبی است. بدین صورت که اثر ضد‌میکروبی عصاره این برگ بر 28 گونه میکروبی از جمله گونه‌های استافیلوکوکوس، لیستریا، لاکتوباسیلوس، سالمونلا و قارچ‌هایی مثل کاندیدیا به روش براث میکرودایلوشن بررسی و MIC مربوط به هر کدام ارایه گردید. علاوه بر این‌ Sudjana و همکاران در سال ۲۰۰۹ نشان دادند که عصاره برگ زیتون اثر ضدمیکروبی قوی‌تری بر باکتری‌ها نسبت به قارچ‌ها دارد و در میان باکتری‌ها هم بر باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس،  کمپیلوباکتر و هلیکوباکتر نسبت به سایر گونه‌های باکتریایی مؤثرتر است (27). طی مطالعه‌ دیگری Pereira و همکاران در سال 2007 اثر ضد میکروبی عصاره آبی برگ زیتون بر باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس، باسیلوس سوبتیلیس، اشریشیا‌کلی، سودوموناس آئروژناس، کلبسیلا پنومونیه و قارچ‌های کاندیدیا آلبیکنز و کاندیدیا نئوفورمنس بررسی گردید و مشخص شد که برگ زیتون بر این میکروارگانیسم‌ها اثر بازدارندگی رشد دارد که این اثر در باکتری‌ها نسبت به قارچ‌ها بیشتر بود. همچنین در بین باکتری‌های تحت بررسی، باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سوبتلیس، کلبسیلا پنومونیه و سودوموناس حساس‌تر بودند (28). در مطالعه‌ Rafiei و همکاران در سال 2012 اثر ضدمیکروبی عصاره‌‌های متانولی، استونی و آبی برگ گیاه زیتون به روش براث میکرودایلوشن بر باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا‌کلی، سالمونلا تیفی مورد مطالعه قرار گرفت و نشان داده شد که این گیاه ضمن داشتن اثر آنتی بیوتیکی بر این باکتری‌ها، بیشترین اثر مهاری را بر باکتری استافیلوکوکوس اورئوس داشته است و عصاره الکلی نسبت به عصاره آبی از اثربخشی بالاتری برخوردار است به طوری که حداقل غلظت بازدارندگی رشد این گیاه با عصاره الکلی نصف عصاره آبی بود (29). به همین دلیل در این مطالعه از عصاره الکلی استفاده شد. در ضمن Chirinos و همکاران در سال 2007 نشان دادند که آب به‌دلیل قطبیت بالا و استون به‌دلیل غیر قطبی بودن حلال خوبی برای انحلال ترکیبات فنولی نمی‌باشند (30). در مطالعه‌ Sudjana و همکاران در سال 2009، MIC عصاره الکلی برگ زیتون برای باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بین 8/0 تا 5/12 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و حداقل غلظت بازدارندگی رشد که بر 90 درصد نمونه‌ها اثر داشته است (MIC₉₀) 5/12 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر برآورد شد (27). در مطالعه حاضر MIC عصاره الکلی برگ زیتون بر استافیلوکوکوس‌ اورئوس جدا شده از ورم پستان تحت بالینی گاو 12 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر (12000 پی پی ام) بود که با نتایج دو مطالعه هم‌خوانی دارند و اختلافات اندکی که در میزان عصاره لازم برای تأثیر بر باکتری در مطالعات مختلف دیده می‌شود می‌تواند ناشی از تفاوت در ترکیب عصاره باشد زیرا ترکیبات یک گیاه ممکن است بسته به ناحیه جغرافیایی، سن گیاه، فصل و روش استحصال عصاره دستخوش تغییر گردد (2،16). همچنین Gerrits و همکاران در سال 2006 نشان دادند که نتایج حاصل از حساسیت باکتری‌ها در شرایط آزمایشگاهی را نباید به شرایط طبیعی و درون‌تنی (in vivo) تعمیم داد زیرا ممکن است میزان حساسیت باکتری نسبت به یک آنتی‌بیوتیک در شرایط درون‌تنی متفاوت باشد (31).

نتیجه ­گیری نهایی:  به طور کلی نتایج مطالعه حاضر نشان داد که غلظت 12000 پی پی ام عصاره الکلی برگ زیتون بر استافیلوکوکوس اورئوس‌ ایجادکننده التهاب پستان تحت بالینی اثر مهاری دارد که می‌تواند به عنوان یک ترکیب دارویی ارزان و در دسترس در درمان التهاب پستان‌های ناشی از عامل استافیلوکوکوس اورئوس مورد استفاده قرار گیرد. حال پیشنهاد می‌گردد که اثر ضدمیکروبی عصاره الکلی برگ زیتون طی یک کارآزمایی بالینی در گاوهای مبتلا به التهاب پستان تحت بالینی ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس مورد ارزیابی قرار گیرد و علاوه بر این اثر ضد میکروبی عصاره الکلی برگ زیتون بر سایر پاتوژن‌های مولد التهاب پستان گاو شیری، اجزاء مختلف مؤثره این گیاه نیز مورد مطالعه واقع شود.

سپاسگزاری

بدینوسیله از زحمات کارشناسان آزمایشگاه مرکزی و شیمی مواد غذایی دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان تشکر و قدردانی می شود.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.