مقدمه

ماهی تیلاپیا از خانواده سیکلیده ماهیان و از راسته سوف‌ماهیان است که دارای گونه‌های متفاوتی می‌باشد و در میان گونه‌های مهم تیلاپیا در دنیا تولید و پرورش تیلاپیای نیل بیشترین میزان را دارد (6). تیلاپیاها قدرت رشد خوبی را در انواع مختلف سیستم‌های پرورشی مانند استخرهای خاکی، تانک‌های بتونی و قفس از خود نشان می‌دهند و همچنین این ماهیان همه‌چیز خوار می‌باشند (4،9). به‌طور کلی در تکثیر و پرورش آبزیان تغذیه نقش مهم و اساسی در نگهداری سلامت و بازده بالای آبزی‌پروری دارد. کیفیت و کمیت جیره غذایی بین آنابولیسم برای ذخیره و کاتابولیسم برای تولید انرژی می‌‌‌تواند اثرگذار باشد. ترکیبات غذایی مورد استفاده در آبزیان را از نظر تولید انرژی می‌توان به دو دسته انرژی‌زا (پروتئین‌ها، چربی‌ها و کربوهیدرات‌ها) و غیر انرژی‌زا (پیش مخلوط ویتامین‌ها و مواد معدنی) تقسیم بندی کرد (2،11). از آنجا که پروتئین‌ها در شرایط معمول در غذای آبزیان گران‌ترین قسمت جیره غذایی می‌باشند، در عین حفظ تنظیم کیفیت جیره به حداقل رساندن استفاده از آن‌ها نکته قابل اهمیتی می‌باشد (17،20). اقلام غذایی مختلفی جهت جایگزینی مناسب در جیره غذایی آبزیان مورد مطالعه قرارگرفته است که از جمله منابع پروتئین حیوانی می‌توان به محصولات جانبی ماهی، حیوانات اهلی و خانگی مانند پودر‌ پر، پودر ‌خون، پودر ‌‌استخوان، پودر ضایعات‌ مرغ و از منابع پروتئین گیاهی می‌توان به پودر سویا، کنجد، کلزا و غیره اشاره کرد (9،13،14،20). پودر‌ ضایعات ‌مرغ به‌عنوان یک منبع پروتئینی دارای مقدار مناسبی از لیپید (15-12 درصد) و پروتئین خام (58-65 درصد) می‌باشد و بجای پودر ماهی که یکی از اقلام گران قیمت جیره است می‌تواند تا حدودی جایگزین شود (12،17).

پودر ضایعات مرغ یکی از مهم‌ترین منابع پروتئینی حیوانی است که به دلیل محتوای بالای آن در اسیدهای آمینه‌ ضروری، اسید‌های چرب، ویتامین‌ها و مواد معدنی، به طور کلی مواد خوراکی با کیفیت، تقاضای زیادی به عنوان خوراک آبزیان پیدا کرده است (12). بر اساس مطالعات انجام شده مشخص گردید که از نظر ماکروسکوپیک و میکروسکوپیک تفاوت‌های قابل ملاحظه‌ای در شکل و عملکرد بافت روده در میان گونه‌های مختلف ماهیان اعم از همه چیزخوار، زئوپلانکتون خوار و فیتوپلانکتون خوار دیده می‌شود (10،18). به‌طور کلی ساختار بافت‌شناسی روده در گونه‌های مختلف ماهیان براساس نوع غذا، رفتارهای تغذیه‌ای و شکل بدن متفاوت بوده به‌طوری که حتی در یک گونه نیز بر‌حسب محل زندگی، فصل، سن و زمان تولید‌مثل تغییراتی در آن مشاهده می‌شود (5،15،19). با‌توجه به این‌‌که تا‌کنون مطالعه‌ای در ارتباط با مطالعه تأثیر جایگزینی پودر ضایعات مرغ بجای پودر ماهی با درصد‌های ذکر شده در جیره غذایی بر ساختار بافتی روده تیلاپیای نیل صورت نگرفته است، مطالعه حاضر جهت نیل به این هدف انجام شده تا از نتایج آن بتوان در مراکز تحقیقاتی و تکثیر و پرورش تیلاپیا، برای استفاده از سایر منابع پروتئینی در جیره روزانه به‌منظور کاهش دادن هزینه و در عین حال رسیدن به بهترین بازده مورد استفاده قرار گیرد.

مواد و روش‌کار

ماهیان مورد استفاده و نحوه نگهداری: تعداد 75 قطعه ماهی تیلاپیای نیل با میانگین وزنی اولیه 14/1±22/42 گرم و طول استاندارد 13/1±28/14به‌طور تصادفی به 5 گروه با سه تکرار تقسیم‌بندی شدند. ماهیان هر تیمار در آکواریوم‌های جداگانه مجهز به سیستم هوادهی، تخلیه آب مرکزی، شیرهای تنظیم آب و هوا و همچنین سیستم گرمایشی رها‌سازی شدند (22). در مدت 8 هفته دوره آزمایش، تغذیه ماهیان 2 بار در روز در ساعات 10 صبح و 5 بعد ‌از‌‌‌ ظهر تا حد سیری انجام شد (1). در مطالعه حاضر برای ماهیان 5 جیره غذایی آزمایشی با حفظ سطح پروتئینی 45 درصد (پروتئین مورد نیاز برای رشد تیلاپیا (6)) تعریف شد و در آن جیره‌ گروه‌های آزمایشی دارای نسبت‌های مختلفی از پودر ‌ضایعات‌ مرغ بجای پودر‌ ماهی بودند. در مرحله ساخت جیره، ابتدا مقادیر مورد نیاز هر کدام از مواد برای هر گروه توسط ترازوی دیجیتال با دقت یک گرم توزین شد (جدول 1،2). اقلامی که در جیره ذرات ریزتری داشتند از جمله آرد سفید (شرکت آرد سفید جنوب، اهواز)، مکمل مواد معدنی (شرکت خوراک دام مازندران، ساری)، مکمل ویتامینی (شرکت خوراک دام مازندران، ساری)، ضد قارچ (شرکت آرین دام البرز، ایران)، نمک، اکسید کروم با یکدیگر به خوبی مخلوط شد و مخلوط حاصل با اقلام دارای ذرات درشت جیره (پودرسویا، پودرماهی، پودرضایعات مرغ) ترکیب شدند. در پایان به مخلوط حاصل به‌صورت متوالی آب و سپس کمی روغن سویا اضافه شد تا این‌که یک خمیر همگن بدست آمد، خمیرحاصل به‌وسیله چرخ گوشت چرخ و برای خشک شدن به مدت ٢٤ ساعت در معرض جریان هوا قرار داده شد تا رطوبت موجود در آن‌ به کمتر از ١٠ درصد رسید و سپس این رشته‌ها خرد و پلت شدند.

 فاکتورهای فیزیکوشیمیایی آب در دو نوبت صبح و ظهر اندازه‌گیری شد به‌طوری که در طی دوره پرورش میزان آمونیاک 1/0 (قسمت در میلیون)، نیتریت 02/0 (قسمت در میلیون)، نیترات 5 (قسمت در میلیون)، سختی‌کل 180 (میلی‌گرم در لیتر)، pH 4/8-8، شوری‌کل 2/1 (قسمت در تریلیون)، دما 24±2 (درجه ‌سانتی‌گراد) ثبت شد. در مطالعه حاضر از آب لوله‌کشی شهری کلرزدایی شده استفاده گردید و در طول مدت نگهداری آب آکواریوم‌ها به میزان 20 درصد حجم آب هر 2 روز یک بار از ناحیه کف آکواریوم سیفون و تعویض شد تا مواد دفعی آن‌ها خارج شود.

مطالعات بافت‌شناسی: پس از پایان دوره پرورش از هر تیمار 5 قطعه‌ ماهی بعد از بیهوشی به‌وسیله پودر گل‌میخک نمونه‌برداری و بیومتری آن‌ها انجام گرفت. محوطه شکمی ماهیان باز شد و نمونه‌هایی به ضخامت حداکثر 5 میلی‌متر از نواحی قدامی، میانی و خلفی روده هر یک از آن‌ها برداشت و پس از ثبوت در محلول فرمالین بافر 10 درصد (مرک، آلمان) و انجام روش معمول تهیه مقاطع ‌بافتی، رنگ‌آمیزی‌های هماتوکسیلین-ائوزین (H&E)، پریودیک اسید شیف (PAS) جهت تشخیص بهتر کربوهیدرات‌ها، سلول‌های جامی و تکنیک ایمونوهیستوشیمی (TUNEL)‌ (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End Labeling) جهت تعیین سلول‌های دچار مرگ برنامه‌ریزی شده روی آن‌ها انجام شد. در مطالعه حاضر برای تکنیک ایمونوهیستوشیمی و روش انجام تست TUNEL از کیت مخصوص تانل (Roche، آلمان) و طبق دستور کارخانه سازنده استفاده شد (16،19). سپس ساختار بافتی روده به ‌روش هیستومورفولوژی و هیستومتری به کمک میکروسکوپ نوری (Olympus، ژاپن) مجهز به دوربین داینولیت ‌(Dino-Eye، تایوان) و سیستم کامپیوتری مجهز به نرم افزار داینوکپچر مورد مطالعه قرار گرفت. به‌منظور شمارش سلول‌های آپوپتوتیک 10 میدان دید میکروسکوپی با بزرگنمایی (×400) به‌صورت کاملاً تصادفی انتخاب و در حدود 100 سلول شمارش شد. در نهایت شاخص آپوپتوز طبق فرمول ذیل برای هر گروه تعیین گردید.

100× تعداد کل سلول‌ها/ تعداد سلول‌های آپوپتوز شده = شاخص آپوپتوز

در مطالعات مورفومتری در طول 100 میکرومتر از نواحی مختلف روده ارتفاع پرز (میکرومتر)، ضخامت طبقه عضلانی (میکرومتر) و تعداد سلول‌های جامی (تعداد) در هریک از گروه‌ها ثبت و میانگین آن‌ها محاسبه شد.

تجزیه و تحلیل آماری: کلیه محاسبات آماری، پس از اندازه‌گیری فاکتورهای مورد مطالعه با استفاده از نرم‌افزار spss نسخه 21 و با آزمون آنالیز واریانس‌ یک‌طرفه (ANOVA) و سپس آزمون توکی انجام گرفت. در نهایت نتایج در سطح  معنی‌داری (05/0P≤) ارائه شد (5).

نتایج

پس از پایان دوره پرورش مشخص شد که بالاترین وزن 23/62±11/ 126 گرم و طول نهایی برابر 22/1±18/16 سانتی‌متر مربوط به گروه کنترل و کمترین وزن و طول نهایی به ترتیب برابر 41/42±11/86 گرم و 14/1±18/15 سانتی‌متر مربوط به گروه 100 درصد پودر ضایعات مرغ گزارش گردید. پس از مطالعات میکروسکوپی، روده ماهی تیلاپیا مشخص شد که دیواره روده از داخل به خارج دارای بافت پوششی، بافت همبند پارین حاوی عروق و عضله‌ مخاطی، زیرمخاط حاوی عروق خونی و اعصاب و طبقه عضلانی قرار داشت. طبقه عضلانی خود از دو لایه‌ حلقوی ضخیم درونی و لایه طولی نازک بیرونی تشکیل شده بود. خارجی‌ترین لایه در هر سه قسمت روده به‌وسیله بافت همبند ظریف سروز با پوشش سنگفرشی ساده به‌همراه بافت همبند پوشیده شده بود. در قسمت ابتدایی روده لایه‌ مخاطی دارای چین‌های بلندی بود که با سلول‌های پوششی استوانه‌ای ساده و سلول‌های جامی‌ شکل پراکنده مفروش شده بود. همچنین در مطالعات میکروسکوپی بخش میانی روده نیز این چین‌های مخاطی به نسبت کوتاه‌تر با بافت پوششی استوانه‌ای ساده و سلول‌های جامی‌شکل و لایه‌ پارین ضخیم‌تر مشاهده گردید. اما در قسمت انتهایی روده چین‌های مخاطی کوتاه و کمتر شده و حتی از ارتفاع سلول‌های پوششی استوانه‌ای ساده کاسته شده ولی در مقایسه با قسمت‌های ابتدایی و میانی بر تعداد سلول‌های جامی بین سلول‌های پوششی افزوده شده بود. همچنین در این ناحیه لایه‌ پارین نسبت به قسمت‌های ابتدایی و میانی روده نازک‌تر شده و عضله مخاطی نیز قابل تمایز نبود. در قسمت انتهایی روده لایه عضلانی نیز از ضخامت کمتری نسبت به دو ناحیه دیگر برخوردار بود. در مقایسه بین نتایج حاصل از مطالعات هیستومورفومتری تمام تیمارها در نواحی مختلف روده بیشترین ارتفاع پرز، ضخامت‌ طبقه عضلانی و تعداد ‌سلول‌های جامی مربوط به گروه کنترل بوده اما با گروه‌های 25 و 50 درصد پودر ضایعات مرغ درصد اختلاف معنی‌داری نداشت (05/0P≥).‌گروه 100 درصد پودر ضایعات مرغ دارای کمترین مقدار در کلیه فاکتورهای اندازه‌گیری شده و دارای اختلاف معنی‌داری نسبت به گروه‌های قبلی بود (05/0P≤) (تصویر 1، جدول 3).

در ارزیابی نتایج حاصل از مطالعات ایمونوهیستوشیمی مقاطع بافتی تهیه ‌شده به کمک تکنیکTUNEL  سلول‏هایی که دچار آپوپتوز شده‌ بودند، رنگ زرد تا قهوه‌ای بخود گرفتند. پس از شمارش و ثبت این سلول‌ها در تمام گروه‌ها و مقایسه آن‌ها مشخص شد که در دو گروه 75 و 100 درصد پودر ضایعات مرغ، تعداد سلول‏های آپوپتوز شده نسبت به سایر گرو‌ها بیشتر شده بود (05/0P≤) (جدول 4، تصویر 2).

بحث

بررسی پاسخ‌های بافت‌شناسی روده معیار مناسبی جهت ارزیابی ارزش‌های تغذیه‌ای یک جیره غذایی در آبزیان به شمار می‌آید (11،14). با توجه به ‌این که در حال حاضر نیازهای تغذیه‌ای بیشتر گونه‌های ماهیان پرورشی هنوز شناخته شده نیست، بنابراین مطالعه‌ تأثیر تغذیه‌های مختلف در ماهیان به‌ویژه ماهیان پرورشی بسیار ضروری به‌نظر می‌رسد (18). مطالعات نشان داده که تغییر در ارقام ریز تغذیه‌ای در جیره‌های غذایی می‌تواند توانایی ماهی را در برابر بیماری‌های عفونی تغییر دهد (19). تغذیه مناسب شامل حضور ماکرونوترینت‌ها، میکرونوترینت‌ها، آمینواسیدها، اسیدهای چرب، ویتامین‌ها و عناصر کمیاب برای بهبود سلامتی و پیشگیری از بیماری‌ها در محیط‌های پرورش آبزیان ضروری است (8). بر‌اساس نتایج به‌دست آمده از مطالعه حاضر مشخص گردید که ساختار کلی روده در ماهی تیلاپیای نیل تا حد زیادی با ساختار این بافت در سایر ماهیان استخوانی شباهت داشته و تنها تفاوت‌هایی در شکل قسمت‌های مختلف و اندازه آن‌ها وجود داشت. براساس مطالعه اخیر در تمام گروه‌ها ارتفاع پرز و ضخامت طبقه عضلانی از ابتدا به سمت انتهای روده کاهش یافته و همچنین بر تعداد ‌سلول‌های جامی به طرف قسمت انتهایی روده افزوده گردید. با توجه به تغییر نوع پروتئین جیره از پودر ماهی به پودر ضایعات ‌مرغ در تیلاپیا و نتایج بدست آمده در ساختار میکروسکوپی روده می‌توان بیان کرد که انرژی و پروتئین جیره‌غذایی برای شکل‌گیری ساختار بافت‌های زنده ضروری می‌باشد. به طور کلی پروتئین در جیره‌ غذایی آبزیان یک ماده غذایی ضروری است که برای تضمین رشد کافی و سلامتی آن‌ها باید در سطوح مناسب تأمین شود (1،8). محققین بیان کرده‌اند که آنچه حائز اهمیت می‌باشد ایجاد و حفظ نسبت مناسب پروتئین به انرژی در جیره‌ غذایی است زیرا انرژی مورد نیاز باید در اختیار ماهی باشد تا پروتئین جیره برای رشد مورد استفاده قرار گیرد. به عبارت دیگر استفاده از منابع انرژی غیر پروتئینی مانند لیپید و کربوهیدرات جهت تأمین نیاز ماهی به انرژی، موجب کاهش متابولیسم و اکسیداسیون اسیدهای آمینه و در پی آن افزایش مصرف پروتئین جیره جهت رشد می‌شود (1). از نظر مطالعات هیستوفیزیولوژی مشخص شد که آمینواسیدها، اسیدهای چرب و گلوکز به طور عمده به وسیله قسمت قدامی روده و ماکرومولکول‌ها، آب و مواد معدنی در بخش خلفی روده جذب خواهند شد (7). محققین با مطالعه بر روی گونه‌های مختلف آبزیان با جیره‌های متفاوت بیان کردند که با تغییر در نوع پروتئین جیره ارتفاع پرز، ضخامت بافت عضلانی و تعداد سلول‌های موکوسی در روده تغییر می‌یابد (11،14،18). پیش از این نیز در یک مطالعه مشابه، مشاهده شده بود که در جایگزینی دانه‌های کتان بجای پودر‌ ماهی در غلظت‌های مختلف، بیشترین تغییرات در غلظت بالاتر بدست آمده بود (14). مطالعات ایمونوهیستوشیمی مقاطع بافتی قسمت‌های سه‌گانه روده در جیره‌های مختلف در این مطالعه نشان داد که تعداد سلول‏های پوششی که دچار آپوپتوز شده‏ بودند در گروه‌های 75 و 100 پودر ضایعات مرغ که میزان بالاتری از پودرضایعات مرغ دریافت کرده بودند، به مراتب بیشتر از سه گروه دیگر بوده است. آپوپتوز یک نوع مرگ سلولی است که در شرایط طبیعی سبب حذف سلول‌های پیر، اضافی، مضر و آسیب‌دیده می‌شود (16). از طرفی آپوپتوز باعث تکامل و هومئوستازی بافت‌های بدن نیز می‌شود‌ (7). محققین بیان کردند که وجود یک تغذیه نامتعادل برای جانور می‌تواند به صورت فیزیولوژیک و یا پاتولوژیک باعث تولید رادیکال‌های آزاد و پس از آن موجب شکستگی ماده وراثتی سلول‌ها و جلوگیری از تکامل طبیعی آن‌ها و عامل شروع کننده فرآیند آپوپتوز باشد (21). بر‌اساس نتایج این مطالعات می‌توان چنین بیان کرد که جایگزینی پودر ‌ضایعات ‌مرغ تا حد 50 درصد بجای پودر ماهی در جیره غذایی تیلاپیای نیل دارای اثرات نامطلوبی از لحاظ قابلیت جذب مواد ‌غذایی و عملکرد رشد در این ماهی نبوده است و می‌توان با تغییراتی در بالانس ترکیبات جیره غذایی از ایجاد ضایعات احتمالی آن جلوگیری کرد.

سپاسگزاری

مطالعه حاضر برگرفته از طرح تحقیقاتی و حمایت مالی معاونت محترم پژوهشی و فناوری دانشگاه شهید چمران اهواز با شماره پژوهانه SCU.VB1400.103 انجام پذیرفته است که بدین وسیله نویسندگان از همکاری آن‌ها و تمام عزیزانی که در این مطالعه ما را یاری نمودند، تشکر و قدردانی می‌نمایند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.