مقدمه

نئوسپوروزیس بیماری نسبتاً جدیدی است که توسط تک‌یاخته‌ای به نام  نئوسپورا کانینوم (Neospora caninum) ایجاد می‌شود که با سقط‌جنین در گاو و فلج عصبی و عضلانی اندام‌های مختلف به‌خصوص اندام‌های خلفی سگ شناخته می‌شود. این بیماری برای اولین بار در سال 1984 در نروژ مورد شناسایی قرار گرفت. سگ تنها میزبان اصلی (و هم‌چنین میزبان واسط) تک‌یاخته می‌باشد و آلودگی در گاو، گوسفند، بز، اسب و گوزن نیز دیده می‌شود. اهمیت این بیماری در ارتباط با ایجاد سقط‌جنین در نشخوارکنندگان (مخصوصاً گاو) و خسارات اقتصادی ایجاد شده در دامداری‌های صنعتی می‌باشد (5).

در طبیعت، آلودگی در سگ، گاو، گوسفند، بز، اسب و گوزن دیده شده است و به‌طور تجربی نیز عفونت ناشی از نئوسپورا کانینوم را در موش رت، سگ، روباه، بز، گربه، گوسفند، کایوت (Coyotes)، خوک، ژربیل (Gerbils)، خرگوش و میمون ایجاد کرده ‌است. سگ می‌تواند به عنوان میزبان واسط نیز در چرخه زندگی تک‌یاخته نقش داشته باشد. پرندگان گوشت‌خوار همانند باز شکاری، کرکس و جغد می‌توانند به عنوان مخزن و منشأ انتشار نئوسپوروزیس در مزرعه باشند. انتقال بیماری عمودی است. به‌عبارت دیگر انتقال در حیوان آبستن از طریق جفت به جنین صورت می‌گیرد و انتقال بیماری در آبستنی‌های بعدی نیز تکرار می‌گردد (6).

گاو‌‌‌های شیری بیشتر از گاو‌های گوشتی به این انگل آلوده می‌شوند. خسارات اقتصادی بیماری شامل سقط جنین، مرده‌زایی و تولد گوساله‌های ضعیف (به صورت مستقیم) و هزینه‌های تشخیص، بازپروری دام و از دست دادن امکان تولید شیر (به‌طور غیرمستقیم) می‌باشد (4).

مطالعات فراوانی در ایران در مورد سرواپیدمیولوژی این بیماری در گاو‌های شیری و سگ انجام پذیرفته است (11،13،16،21). همچنین عفونت نئوسپورایی به عنوان عامل مطرح در سقط‌ جنین‌ در گاوداری‌های شیری از طریق روش‌های سرولوژیک و مولکولی بررسی شده است (9،18،21،23،24). در ایران گمان برده می‌شود که میزان انتقال از طریق جفت در گاو‌های شیری 52 درصد می‌باشد (22). اما نکته قابل توجهی که در این مطالعات مغفول مانده است، عدم توجه به نقش و دخالت سگ‌های اطراف محل پرورش گاو‌ها به عنوان عامل اصلی گسترش اووسیست‌های نئوسپورایی می‌باشد. مطالعات کمی در مورد آلودگی سگ‌های ولگرد و سگ‌های موجود در اطراف گاوداری‌ها در ایران وجود دارد. هدف از مطالعه حاضر ارزیابی میزان آلودگی مدفوع سگ‌های منطقه به اووسیست نئوسپورا کانینوم و نقش سگ‌های محیط‌های مختلف به‌عنوان میزبان نهایی این انگل در آلوده ساختن دام‌های منطقه می‌باشد.

مواد و روش‌کار

در مطالعه حاضر 5 گرم نمونه‌ مدفوع به‌صورت تصادفی از هر 100 قلاده سگ‌ شامل سگ‌های خانگی، سگ‌های ولگرد، سگ‌های پرورشگاه و سگ‌های اطراف گاوداری‌ها  جمع‌آوری گردید و در کنار یخ و در سریع‌ترین زمان ممکن به فریزر 20- درجه سانتی‌گراد آزمایشگاه انگل‌شناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تبریز منتقل گردید. مشخصات سگ‌ها از قبیل سن، جنس و محل زندگی آنان ثبت گردید.

تمام نمونه‌ها ابتدا توسط محلول فرمالین و اتر (به نسبت 3 به 7) مخلوط شد و از صافی رد گردید و در دور 2500 به مدت 3 دقیقه سانتریفوژ شد. بعد از انجام سانتریفوژ قسمت رویی لوله‌ها دور ریخته شد و عمل فلوتاسیون با شکر بر روی رسوب  لوله‌ها انجام گرفت و اووسیست‌ها در قسمت رویی محلول جمع گردید. سپس از نمونه‌ها گسترش مستقیم تهیه گردید و اووسیست‌ها زیر میکروسکوپ نوری با درشت‌نمایی400 مشاهده شدند.

جهت دسترسی به اسپوروزوئیت‌های موجود در اووسیست‌ها شکستن جداره اووسیست‌ها با سونیکاسیون و همچنین فریز - دفریز انجام گرفت. عمل سونیکاسیون با دستگاه مدل UP400S (Hielscher CO)  بر روی نمونه‌ها انجام پذیرفت. بدین منظور نمونه‌ها در سیکل 5/0 و دامنه 60 درصد به مدت 2 دقیقه سونیک شدند و به فریزر 20- درجه سانتی‌گراد منتقل شدند. سپس برای هر نمونه10 بار‌، فریز و دفریز کردن با استفاده از تانک ازت مایع (دمای 196- درجه سانتی‌گراد) به‌منظور شکستن اووسیست‌ها و خروج ‌زوئیت‌ها انجام پذیرفت.

برای اطمینان از شکسته‌شدن اووسیست‌ها و خروج ‌زوئیت‌‌‌‌‌‌‌‌ها گسترش مستقیم از هر نمونه انجام شد و رنگ‌آمیزی گیمسا به‌منظور مشاهده ‌زوئیت‌ها انجام پذیرفت.

در مطالعه حاضر استخراج  DNAبا استفاده از کیت استخراج DNPTM (شرکت سیناژن، ایران) انجام گرفت و آزمون PCR بر روی ژن NC5 انجام پذیرفت و از آنجا که این ژن فقط در نئوسپورا وجود دارد و موارد مثبت کاذب وجود ندارد، احتیاجی به کنترل مثبت نبود. با این وجود جهت اطمینان بیشتر، کنترل مثبت از آزمایشگاه موسسه رازی شعبه شیراز تهیه گردید. آزمایشPCR  با استفاده از یک زوج پرایمر NP6 و NP21 انجام گرفت که توالی نوکلئوتیدهای آن‌ها در جدول 1 و برنامه زمانی ترموسایکلر در جدول 2 آورده شده است. در صورت آلوده بودن نمونه‌ها، باندی به جرم bp 337 مشاهده می‌شود.

نتایج حاصل از مطالعه حاضر با نرم‌افزار SPSS_Ver25 مورد ارزیابی قرار گرفت و اثر تجویز داروی ضدانگل، سن و محل زندگی سگ‌ها بر میزان آلودگی به نئوسپورا از طریق آزمون آماری  Mann-Whitney-u و Kruskal-Wallis بررسی شد و مقادیر کمتر از (05/0>P) معنی‌دار در نظر گرفته شد.

نتایج

بعد از انجام فلوتاسیون بر روی تمام نمونه‌ها، گسترش مستقیم از آن‌ها تهیه شد که در مطالعه حاضر 45 مورد (45 درصد) از نظر وجود اووسیست مثبت بود. اووسیست‌های‌ مشاهده ‌شده  11-14 میکرومتر قطر داشت (تصویر 1). این موارد می‌توانست اووسیست‌های مربوط به نئوسپورا، توکسوپلاسما یا هاموندیا باشد که از نظر ظاهری کاملاً شبیه به‌هم هستند و برای تفریق باید بررسی مولکولی (PCR) صورت می‌پذیرفت.

با توجه به این‌که بعد از سونیکاسیون و فریز-دفریز، انتظار می‌رفت تا اووسیست‌ها شکسته شده و اسپوروزوئیت‌ها آزاد شوند لذا بعد از سونیکاسیون در رنگ‌آمیزی گیمسا از گسترش‌های مرطوب نمونه‌های اسپوروزوئیت‌ مشاهده شد (تصویر 2).

نهایتاً تکثیرDNA استخراج شده با استفاده از یک زوج پرایمر اختصاصی ژن (NC5) انجام شد. برای ارزیابی نتیجهPCR  از الکتروفورز بر روی ژل آگارز 5/1 درصد استفاده گردید. بر اساس نتایج حاصل 21 درصد نمونه‌ها (21 نمونه از 100 نمونه) دارای ژن (NC5) بودند که  باند مربوط به اندازه 337bp در تصویر قابل مشاهده می‌باشد (تصویر 3).

از بین 100 نمونه مدفوع اخذ شده از سگ‌ها  34 نمونه دارای سن مشخص بودند که در این میان 28 قلاده بالای 1 سال و 8 قلاده زیر 1 سال بودند. مجموعاً 2 مورد مثبت (7 درصد) در بین سگ‌های بالای 1 سال مشاهده شد و آلودگی در سگ‌های زیر 1 سال مشاهده نشد. در بررسی‌های آماری ارتباط معنی‌داری بین سن سگ‌ها و آلودگی به انگل نشان مشاهده نشد.

در ارزیابی انجام شده، نمونه‌گیری از چهار گروه سگ (سگ‌های آپارتمانی 34 قلاده، سگ‌های ولگرد 24 قلاده، سگ‌های پرورشگاه 19 قلاده و سگ‌های حیاط/روستا 23 قلاده) انجام شد که میزان آلودگی به‌ترتیب 2، 8، 6 و 5 درصد بود. مشخص شد که میزان آلودگی در سگ‌های ولگرد بیش از سگ‌های محیط‌های دیگر بود و بررسی آماری ارتباط معنی‌داری بین آلودگی و محیط زندگی سگ‌ها نشان داد.

از بین 100 نمونه اخذ شده، 34 نمونه مورد درمان ضدانگلی قرار گرفته بودند و 66 مورد، درمان ضدانگلی نداشتند. میزان آلودگی در گروه اول 2 درصد و در گروه دوم 19 درصد بود. بررسی آماری ارتباط معنی‌داری بین آلودگی و درمان ضدانگلی سگ‌ها نشان داد.

بحث

بیماری نئوسپوروزیس یکی از مهم‌ترین بیماری‌های گاو (میزبان واسط) در مناطق مختلف جهان است که باعث سقط‌جنین در گاو‌ها (شیری و گوشتی) می‌شود.

مطالعات زیادی در جهان و ایران در مورد نئوسپورا کانینوم در سگ‌ها انجام شده است که بیشتر آنان متکی به روش‌های سرواپیدمیولوژیک بوده است. این مطالعات مشخص نموده است که مثبت بودن سرم در این بیماری نشانگر برخورد حیوان با انگل در گذشته یا حال بوده است و همبستگی با دفع اووسیست توسط حیوان ندارد. به‌طوری‌که حتی بعد از آلودگی تجربی سگ و دفع اووسیست توسط چنین سگ‌هایی نتیجه آزمایشات سرولوژیک آن‌ها‌ مثبت نمی‌باشد. بنابراین جهت تشخیص آلودگی سگ احتیاج به آزمایش دفع اووسیست وجود دارد. اما شاید مشکلات نمونه‌گیری از مدفوع سگ و ریسک ناشی از برخورد با مدفوع سگ مخصوصاً سگ‌های بدون صاحب، تعداد مقالات منتشر شده در ایران و جهان را در این مورد محدود نموده است (2،14،15).

مطالعات اولیه نشان داد که جدا نمودن اووسیست‌های نئوسپورا کانینوم از اووسیست تک‌یاخته‌های مشابه از طریق روش‌های مولکولی قابل انجام است. به‌طوری‌که Slapeta و همکاران در سال2002 در جمهوری چک ارزیابی در مورد پخش اووسیست نئوسپورا کانینوم و تشخیص آن با روش مولکولی PCR روی مدفوع یک قلاده سگ انجام دادند. در این مطالعه اووسیست‌های مربوط به نئوسپورا کانینوم توسط آزمایش مولکولی PCR از هاموندیا و توکسوپلاسما تفریق داده شدند (25).

مطالعات انجام یافته در ایران برای تشخیص نئوسپوروزیس اکثراً متکی به آزمایشات سرولوژیک برای تشخیص آنتی‌بادی‌ علیه بیماری در گاو می‌باشد. Razmi و همکاران در سال 2006 با استفاده از کیت الایزای تجاری میزان آلودگی را در گاوهای منطقه مشهد 46 درصد اعلام نمودند (21) . Sadrebazzazو همکاران در سال 2004، در طی مطالعه‌ای در شهر مشهد از 806 راس گاو شیری نمونه خونی گرفتند و به بررسی سرولوژیک (IFAT) برای نئوسپورا پرداختند. آن‌ها میزان آلودگی به نئوسپورا را در گاوهای شیری مشهد 15/18 درصد  اعلام نمودند (23). نتیجه مطالعه میزان آلودگی گاوهای منطقه اهواز در ارزیابی Hajikolaei و همکاران در سال 2008 با استفاده از روش سرولوژیک 21 درصد اعلام کردند (11). Nourollahifard و همکاران در سال 2008 به مطالعه سنجش سرولوژیک نئوسپورا کانینوم در گاو‌‌های شیری در منطقه کرمان پرداختند. در این مطالعه تعداد 285 نمونه خونی از گاو‌های شیری اخذ گردید که برای آنتی‌بادی‌های ضد ‌نئوسپورا تست شدند. در این مطالعه که از روش الایزا استفاده شد، تعداد 36 نمونه (6/12 درصد) آلوده تشخیص داده شد. این ارزیابی اولین مطالعه در مورد نئوسپورا در منطقه کرمان محسوب می‌شود. نتایج این مطالعه همچنین نشان داد که سن و جنسیت حیوان هیچ نقشی در بروز آلودگی نداشت (19).Ansari-Lari  و همکاران در سال 2017 برای بررسی نئوسپورا کانینوم در گاو شیری، طی یک بررسی سرولوژیک (ELISA) که در روی 253 رأس گاو آبستن شیری انجام گرفت، نشان دادند که 4/30 درصد از گاوها سروپوزیتیو می‌باشند. در این مطالعه نتیجه‌گیری شد که آلودگی به نئوسپورا کانینوم هیچ ارتباط معنی‌داری با جنسیت گاوهای و بروز سخت‌زایی در حین زایمان ندارد (1). Gharekhani و Heidari در سال 2014 در یک بررسی جامع بر روی 2254 نمونه (گاو، گوسفند، اسب، الاغ و سگ) مطالعه سرولوژیکی راجع به نئوسپورا انجام دادند. در این مطالعه که با روش N-MAT و IFAT انجام شد، 4/17 درصد گاوهای شیری (245 نمونه از 1406)، 2/2 درصد گوسفندان (8 نمونه از 358)، 40 درصد اسب‌ها (49 نمونه از 120)، 52 درصد الاغ‌ها (52 نمونه از 100) و 27 درصد سگ‌ها (73 نمونه از 270) سروپوزیتیو (آلوده به نئوسپورا) بودند (8). در مطالعه دیگر در تهران میزان شیوع سرمی نئوسپورا در 103 سگ با استفاده از روش IFAT بر پایه سنجش IgG  4/19 درصد ذکر شده است که میزان آلودگی وابسته به جنسیت سگ نبوده اما همبستگی بالایی با سن سگ‌ها داشته است (10).

همان‌طور که ذکر شد مطالعات مربوط به آلودگی مدفوع سگ به اووسیست نئوسپورا در ایران و جهان محدود می‌باشد. Razmi  در سال 2009 بر روی 174 نمونه مدفوع از سگ‌های فارم‌های اطراف مشهد مطالعه کرد. در این مطالعه، ارزیابی مولکولی به شکل PCR بر روی نمونه‌ها انجام گرفت که 2 مورد از آن‌ها مثبت بودند (1/1 درصد) و بدین طریق اولین گزارش آلودگی به نئوسپورا کانینوم در میزبان اصلی (سگ) در اطراف مشهد ثبت گردید (22). همچنین Dalimi و همکاران در سال 2014 در سگ‌های استان لرستان فقط 9 مورد آلودگی در بین 428 (1/2 درصد) نمونه مدفوع را گزارش کردند (3).

با مقایسه میزان آلودگی در مطالعات مذکور و مطالعه حاضر مشخص شد که میزان آلودگی به نئوسپورا در سگ‌های اطراف تبریز بسیار بالاتر می‌باشد (21 درصد در تبریز، 1/1 درصد در مشهد و1/2 درصد در لرستان). شاید یکی از علل تفاوت در این میزان‌ها به حیوانات مورد ارزیابی مربوط باشد. در مطالعه Razmi در سال 2009 میزان آلودگی به نئوسپورا در سگ‌های فارم و خانگی مورد سنجش قرار گرفته است (22). همچنین در مطالعه Dalimi و همکاران در سال 2014 نمونه‌های مدفوعی از سگ‌های نگه‌داری ‌شده در گاوداری‌های شیری کوچک تهیه شده است (3). درحالی‌که در مطالعه حاضر، سگ‌های ولگرد سهم بیش‌تری از نمونه برداری و آلودگی را به خود اختصاص داده‌اند که طبیعتاً بالاتر بودن میزان آلودگی در سگ‌های ولگرد نسبت به سگ‌های فارم قابل پیش‌بینی و قابل توجیه می‌باشد. نکته دیگر، با توجه به سابقه بررسی سرولوژیک در منطقه که در آن میزان آنتی‌بادی نئوسپورا کانینوم را در گاو‌های سقط کرده 4/18 درصد ذکر شده بود و هم‌چنین آلودگی در مغز گوساله‌های سقط شده به روش PCR رقم بسیار بالایی (8/42 درصد) نشان داد، میزان بالای آلودگی در سگ‌های منطقه نیز قابل توجیه می‌باشد (17،18).  

میزان بسیار بالای آلودگی در مطالعه حاضر قابل مقایسه با مطالعه Jianhua و همکاران در سال 2014 در مدفوع سگ‌های شانگهای چین است؛ که با روش آزمایش مولکولی PCR انجام پذیرفت تعداد 212 نمونه مورد آزمایش قرار گرفت که 74 مورد (9/34 درصد) از آن‌ها از نظر آلودگی به نئوسپورا کانینوم مثبت بودند. آن‌ها اعلام کردند که آلودگی به نئوسپورا کانینوم هیچ ارتباطی به سن حیوان و جنسیت سگ‌های مورد ارزیابی ندارد (12). این مطالعات با نتایج بررسی مطالعه حاضر که نشان داد آلودگی به نئوسپورا ارتباطی با سن سگ ندارد منطبق بود.

Ghalmi و همکاران در سال 2008 حضور نئوسپورا کانینوم را در ارگان‌های سگ با روشReal time PCR ارزیابی کردند. در این مطالعه 87 قلاده سگ که هیچ‌کدام علائم نئوسپوروزیس را نداشتند به شکل تصادفی انتخاب شده و آسان‌کشی شدند. از 87 قلاده سگ، تعداد 28 قلاده (32 درصد) حداقل در یک ارگان آلوده بودند. از این 28 مورد مثبت در Real time PCR فقط 9 مورد از لحاظ سرمی مثبت بودند. با مقایسه درصد آلودگی فوق و درصد آلودگی سگ‌های مورد آزمایش در این مطالعه، می‌توان نتیجه‌گیری کرد که آلودگی به نئوسپورا کانینوم در سگ‌های اطراف تبریز تقریباً مشابه آلودگی مذکور می‌باشد (7).

اما مقایسه میزان آلودگی گزارش شده در مطالعه حاضر با مقادیر ارائه شده توسط Palavicini و همکاران در سال 2007 در کاستاریکا هم‌خوانی ندارد. در این مطالعه که 256 نمونه مدفوع از 34 قلاده سگ گرفته شده بود، تعداد 4 مورد آلودگی به نئوسپورا کانینوم به طریق آزمایش PCR یافت شد. نکته جالب توجه این بود که هیچ‌کدام از 4 نمونه مثبت علی‌رغم مثبت بودن، در زیر میکروسکوپ اووسیست نشان ندادند که گمان می‌رود علت این امر به دلیل تعداد بسیار کم دفع اووسیست نئوسپورا کانینوم باشد (20).

در طی این مطالعه مشخص شد که آلودگی‌های سگ‌های ولگرد بیش از سگ‌های دیگر به نئوسپورا می‌باشد. این یافته با نتیجه‌گیری Dalimi و همکاران در سال 2014 که نقش سگ‌های ولگرد را در اشاعه این بیماری با اهمیت می‌دانند هم‌خوانی دارد (3).

همچنین در این مطالعه مشخص شد که آلودگی در سگ‌هایی که قبلاً مورد درمان  ضدانگلی قرار گرفته‌اند به‌طور معنی‌داری کمتر از حیوانات درمان نشده است. بررسی مشابهی در ایران و جهان برای مقایسه این نتایج مشاهده نشد اما به‌طور کلی درمان ضدانگلی بر آلودگی محیط توسط تخم کرم‌ها و اووسیست‌ها مؤثر می‎باشد.

نتیجه‌گیری نهایی: با توجه به میزان بالای آلودگی با نئوسپورا کانینوم در سگ‌های منطقه تبریز و اثبات قبلی بالا بودن تیتر آنتی‌بادی در گاوهای منطقه و در گاو‌‌های سقط کرده و هم‌چنین اثبات حضور انگل نئوسپورا کانینوم در ترشحات و مقاطع بند ناف جنین‌های سقط شده در گاوداری‌های اطراف تبریز، به نظر می‌رسد که انگل نئوسپورا کانینوم را می‌توان یکی از عوامل مهم همه‌گیری‌های سقط‌جنین در گاوداری‌های شیری اطراف تبریز محسوب کرد. با در نظر گرفتن این موضوع، لزوم اعمال روش‌های پیشگیری در گاوداری‌های سنتی و صنعتی اطراف تبریز و همچنین استفاده از روش‌های تشخیص سریع بیماری در آن‌ها توصیه می‌شود.

سپاسگزاری

این مقاله از نتایج طرح مربوط به پایان‌نامه مصوب دانشگاه تبریز به شماره 4028/43/د وکد اخلاقی شماره 220-د استخراج شده است و نویسندگان از مساعدت‌های معاونت پژوهشی دانشگاه تبریز کمال تشکر را دارند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.