مقدمه

در سراسر جهان، تنش آب، علت اصلی خسارات اقتصادی در کشاورزی و جنگلداری است (Rosegrant & Cline, 2003) و انتظار می‌رود به‌دلیل تغییرات آب و هوایی و کمبود روزافزون آب، خشکی به‌طور فزاینده‌ای شدیدتر شود ( Dudley, 1996; Zirgoli & Kahrizi, 2015; Sabagh et al., 2019). خشکی یک تنش چند بعدی است که گیاهان را در سطوح مختلف تحت تأثیر قرار می‌دهد. در سطح گیاه، پاسخ به تنش خشکی پیچیده است (Blum, 1996) و به‌عنوان به‌وسیلهمهم‌ترین فاکتور کنترل‌کننده عملکرد محصولات، تقریباً روی کلیه فرآیندهای رشد گیاه تأثیرگذار است (Siddique et al., 1999). آسیب‌های ناشی از گونه‌های فعال اکسیژن (ROS[1]) به ماکرومولکول‌ها تحت تنش خشکی، مهم‌ترین عامل پیشگیری کننده رشد است (Farooq et al., 2009). یکی از مسیرهایی که تحت تاثیر تنش خشکی قرار می‌گیرد، چرخه کربس (TCA) است که در ماتریکس میتوکندری قرار دارد (Gao et al., 2018). آنزیم‌های چرخه TCA به تنش‌های اکسیداتیو بسیار حساس هستند (Fernie et al., 2004). در گیاهان، پیروات به‌وسیله کمپلکس آنزیمی پیروات دهیدروژناز (PDC) میتوکندریایی به استیل COA تبدیل می‌شود و به دنبال آن CO₂ آزاد می‌شود و NAD⁺ به NADH تبدیل می‌شود (Budde & Randall, 1990). کمپلکس پیروات دهیدروژناز میتوکندری (mtPDC)، محل ورود کربن به چرخه TCA می‌باشد (Tovar‐Méndez et al., 2003). در چرخه کربس، استیلCOA  به‌وسیله سیترات سینتاز و آکونیتاز به ایزوسیترات تبدیل می‌شود (Moeder et al., 2007). ایزوسیترات دهیدروژناز با واکنش اکسیداتیو، ایزوسیترات را به 2–اکسیدگلوتارات، تبدیل می‌کند و محصول این واکنش، CO₂ وNADP  است ( Lemaitre et al., 2007; Sienkiewicz-Porzucek et al., 2010; Sulpice et al., 2010; Foyer et al., 2011 ). ایزومرهای ایزوسیترات دهیدروژناز میتوکندری و سیتوزول، نقش مهمی در تولید NADPH برای احیای گلوتاتیون و در از بین بردن گونه‌های فعال اکسیژن در برابر تنش اکسیداتیو دارند (Abiko et al.2005). در گیاه آرابیدوپسیس، شش ایزومر برای ژن IDH گزارش شده است. فقدان ژن AtIDH II منجر به کاهش فعالیت ایزوسیترات دهیدروژناز در این گیاه شد
 (Lin et al., 2004). در مطالعه‌ای که Lemaitre & Hodges  (2006) روی ژن IDH در قسمتهای مختلف گیاه آرابیدوپسیس انجام دادند اعلام کردند که ایزومر شماره شش در برگ، دارای بیان بیشتری بود. چرخه کربس با فعالیت مالات دهیدروژناز تکمیل می‌شود که سبب اکسیداسیون برگشت‌پذیر مالات به اگزالواستات (OAA) می‌شود (Nunes-Nesi et al., 2005)). اگزالوگلوتارات توسط آنزیم‌های اگزالوگلوتارات دهیدروژناز، سوکسینات دهیدروژناز و فوماراز (فومارات دهیدروژناز) به فومارات تبدیل می‌شود (Zhang & Xie, 2014). در گوجه فرنگی، کاهش فعالیت آنزیم فوماراز، کاهش رشد گیاهان را در پی داشت (Nunes‐Nesi et al., 2007).

تیوکسی‌ردوکسین (TRX) به‌عنوان یک تنظیم کننده اصلی برای چرخه TCA میتوکندری شناخته شده است (Daloso et al., 2015). TRX نقش اساسی را در تحمل گیاهان به تنش اکسیداتیو ایفا می‌کند. آن‌ها در مقابله با آسیب اکسیداتیو و با انتقال الکترون، موجب احیا ردوکتازهای مورد نیاز برای سم‌زدایی هیدروپراکسیدهای چربی و در نتیجه ترمیم پروتئین اکسید شده می‌شوند (Dos Santos & Rey, 2006). TRX برای احیا خود از فردوکسین ([2]FTR) یا NADPH ([3]NTR) استفاده می‌کند (Reichheld et al., 2005). در بررسی که روی گیاه آرابیدوپسیس انجام شد، افزایش بیان NTR باعث افزایش تحمل به تنش‌های خشکی و فتواکسیداتیو شد. همچنین نتایج نشان داد که افزایش بیان NTR به حفظ هموستازی گونه‌های فعال اکسیژن تحت شرایط تنش کمک می‌کند (Kim et al., 2017). تیوکسی‌ردوکسین می‌تواند فوماراز و سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی را غیرفعال کند و در شرایط In vivo نیز سبب متلاشی شدن ATP سیترات لیاز سیتوزولی می‌شود (Daloso et al., 2015). TRX نقش اساسی را در تحمل گیاهان به تنش اکسیداتیو ایفا می‌کند. آن‌ها در مقابله با آسیب اکسیداتیو، با انتقال الکترون موجب احیای ردوکتازهای مورد نیاز برای سم‌زدایی هیدروپراکسیدهای چربی و در نتیجه ترمیم پروتئین اکسید شده می‌شوند (Dos Santos & Rey, 2006). مطالعه ژنومی برنج نشان داد که تحت شرایط تنش زیستی و غیرزیستی، تفاوت معنی داری در بیان ژن TRX وجود دارد (Nuruzzaman et al., 2012)؛ بنابراین نقش TRX، محافظت گیاهان در برابر آسیب اکسیداتیو می‌باشد و نشان می‌دهد که TRX در سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی درگیر است (Kapoor et al., 2015).

مسیر آلترناتیو اکسیداز، یکی از راه­های مهم کاهش تولید انواع اکسیژن فعال در اندامک­های کلروپلاست و میتوکندری است (Mittler, 2002). در این مسیر، به جای این‌که الکترون­ه،ا تک تک بر روی آن منتقل شوند، هر چهار الکترون لازم جهت احیای کامل اکسیژن به یک باره توسط آن دریافت می‌شود و آن‌را به آب تبدیل می­کند؛ این عمل توسط آنزیم آلترناتیو اکسیداز (AOX) صورت می­گیرد. فعال شدن این مسیر جایگزین همانند سایر مسیرهای ممانعت کننده، از تشکیل انواع اکسیژن فعال پیشگیری می‌کند و سبب می­شود که فشار الکترون موجود روی زنجیر انتقال الکترونی کاهش یابد (Edreva, 2005). محققین نشان داده‌اند که فقدان ژن AOX1 در گیاه، توانایی رشد یا تحمل به تنش را کاهش می دهد (Mohsenzadeh Golafazani et al., 2017). همچنین نشان داده شده است که آلترناتیواکسیداز در کاهش آسیب سلولی تحت تنش‌های محیطی مختلف نقش دارد، به‌طوری‌که تعداد زیادی از مطالعات اخیر، به نقش آن در پاسخ به تنش شوری و خشکی متمرکز شده است (Li et al., 2013). افزایش بیان AOX در پاسخ به خشکی در برگ گندم نشان داده شده است (Bartoli et al., 2005; Vassileva et al., 2009)، درحالی‌که هیچ افزایشی در پروتئین AOX برگ سویا دیده نشد (Ribas-Carbo et al., 2005)، همچنین خشکی سبب کاهش میزان بیان ژن AOX در برگ یونجه شده است (Filippou et al., 2011).

در تحقیقات انجام شده، کاربرد متانول بـه‌عنـوان یـک منبع کربن برای گیاهان زراعی رواج پیدا کرده است، زیرا گیاهان می‌توانند متانول محلول‌پاشی شده روی برگ‌ها را به‌راحتی جذب کنند و به‌عنوان منبع کربنی مورد استفاده قرار دهند و از طرفی متانول، کمبود CO₂ را برای گیاه جبران می‌کند ( Hemming et al., 1995; Fall & Benson, 1996; Bai et al., 2014 ). همچنین گزارش شده است که متانول با ریبولوز 1و5 بیس فسفات، از رقابت اکسیژن می‌کاهد. همچنین اکسیداسیون سریع به دی‌اکسیدکربن و ترکیب با محلول‌پاشی متانول، باعث تأخیر در پیری برگ‌ها از طریق اثر روی محرک‌های تولید اتیلن در گیاه می‌شود که این امر موجب دوام سطح برگ و افزایش دوره فعال فتوسنتزی می‌شود (Zbieć et al., 2003). در مطالعه‌ای دیگر گزارش شده است که متانول، القا کننده بیان ژن‌ها در گیاه آرابیدوپسیس است
 (Roslan et al., 2001). در تحقیقی، تنش خشکی سبب افزایش میزان بیان ژن گلیکولات اکسیداز (که یک آنزیم کلیدی مسیر تنفس نوری می‌باشد)، در ساعات ابتدایی در ژنوتیپ متحمل SLM046 کلزا شد و ساعات بعدی، بیان آن به شدت کاهش یافت کرد (Pasandideh Arjmand et al., 2017). محققان این تحقیق اظهار نمودند احتمالا گیاه با افزایش گلیکولات اکسیداز، سعی در تولید CO₂ برای چرخه کالوین دارد و پس از این‌که NADPH به میزان زیادی انباشته شد، برای جلوگیری از تنش اکسیداتیو، بیان ژن گلیکولات اکسیداز را در ساعات بعدی کاهش داده است. در مطالعه دیگر، تیمار متانول روی پنبه باعث کاهش میزان فعالیت آنزیم گلیکولات اکسیداز شد (Bai et al., 2014) و محققان آن گزارش کردند که یکی از راهکارهای افزایش غلظت دی‌اکسیدکربن در گیاهان، استفاده از متانول است که این امر منجر به افزایش فتوسنتز خالص در واحد سطح و بالارفتن تولید ماده‌ خشک در گیاهان زراعی سه کربنه می‌شود.

کلزا همانند بسیاری از گیاهان زراعی، نسبت به تنش خشکی آسیب‌پذیر است و خسارت ناشی از ایجاد گونه‌های فعال اکسیژن در تنش خشکی، یکی از علل عمده کاهش محصول است. بنابراین در این تحقیق تلاش شد تا با توجه به تاثیر متانول که در مطالعات قبلی به آن اشاره شده است، بیان برخی رونوشت­های ژن‌ها در شرایط تنش خشکی و بدون تنش در ژنوتیپ متحمل و حساس کلزا با استفاده از Real Time-PCR، بررسی شود تا شناخت مناسبی برای شناسایی عکس العمل گیاه کلزا به تنش خشکی و تیمار آن‌ها با متانول فراهم آورد.

مواد و روش‌ها

بذرهای دو ژنوتیپ حساس (Hayola308) و متحمل (SLM046) خشکی کلزا از موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر (SPII) تهیه شدند
 (Mirzai et al., 2013; Mohsenzadeh Golfazani et al., 2016  .(بذرها برای جوانه‌زنی به مدت چهار روز در پتری‌دیش مرطوب استریل در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشگاه گیلان قرار داده شدند و پس از جوانه‌زنی، پنج عدد بذر سالم در هر گلدان پلاستیکی با قطر دهانه 30 سانتی­متر کشت شدند. گلدان‌ها در اتاقک رشد در شرایط 16 ساعت روشنایی و هشت ساعت تاریکی، دمای2± 23 درجه سانتی­گراد و شدت نور 198 میکرومول بر متر مربع بر ثانیه (655 لوکس) منتقل شدند و تا زمان نمونه برداری به صورت مرتب و روزانه آبیاری شدند. بررسی گیاهان در سه سطح شاهد (آبیاری کامل و منظم)، تنش خشکی (قطع آبیاری) و محلول پاشی گیاهان تحت تنش انجام شد. از نظر آماری به‌صورت فاکتوریل و در پایه کاملا تصادفی در سه تکرار انجام شد که سه عامل متانول، ژنوتیپ و زمان به‌عنوان عوامل آزمایش در نظر گرفته شدند. نمونه‌های برگی از گیاهان : الف) به‌طور کامل و منظم آبیاری شده به‌عنوان شاهد، ب) گیاهانی که به مدت 72 ساعت تحت شرایط تنش خشکی به صورت قطع آبیاری قرار داشتند (بر اساس روش وزنی تعیین FC (ظرفیت زراعی) و PWP (نقطه پژمردگی دائم)، تقریباً 72 ساعت پس از قطع آبیاری گلدان­ها آب خود را از دست داده بودند و به حدود 30 درصد ظرفیت زراعی رسیده بودند که این زمان به‌عنوان زمان شروع تنش در نظر گرفته شد) و ج) گیاهان تحت تنش خشکی  که 72  ساعت پس از قطع آبیاری، با متانول 20 درصد محلول‌پاشی شدند (Armand et al., 2016) و در هشت و 24 ساعت پس از محلول پاشی، نمونه گیری انجام شد.

برگ­های سالم، سبز و کاملاً توسعه­یافته گیاه کلزا در مرحله رویشی چهار تا شش برگی (گیاهچه‌ای) برش داده شدند و در ورقه­های آلومینیومی با ضخامت متوسط قرار گرفتند. پس از نمونه­گیری و برای توقف فعالیت‌های متابولیک، ابتدا نمونه‌های برگی درون نیتروژن مایع گرفتند و تا زمان استخراج، در فریزر 80- درجه سانتی‌گراد نگه­داری شدند. استخراج RNA با استفاده از کیت دنا زیست و مراحل آن مطابق دستورالعمل مربوطه انجام شد. به‌منظور حذف DNA باقیمانده، از آنزیم DNase و سپس EDTA استفاده شد. سنجش کیفیت RNA استخراج شده با استفاده از عکس­برداری ژل آگارز یک درصد  توسط دستگاه ژل داک (مدل BIO RAD) و تحت نور UV و سنجش کمیت آن با استفاده از نانودراپ انجام شد. مشاهده باندهای مجزای 5S، 18S و28S  برای RNA ریبوزومی، نشان از کیفیت مناسب فرایند استخراج RNA دارد که در تمامی نمونه­ها، صحت استخراج تائید شد.

سنتز cDNA با استفاده از آنزیمRevert Aid Reverse Transcriptase و M-MLV کیت فرمنتاز ((Fermrntas LIFE SCIENCE # K 1621 مطابق با دستورالعمل مربوطه اجرا شد و کنترل سنتز cDNA با استفاده از آغازگر ژن اکتین انجام شد. به‌منظور بررسی وجود آلودگی در cDNA سنتزشده، از واکنش کنترل منفی که شامل همه مواد موردنیاز واکنش زنجیره­ای پلیمراز به غیر از cDNA بود، استفاده شد. برای بررسی بیان نسبی ژن­ها، از دستگاه Real time-PCR (مدلLightCycler 96) و مخلوط مادر واکنش Real time PCR شرکت BIORON Life Science استفاده شد. در این مطالعه، بیان پنج ژن در فرایند Real time PCR مورد مقایسه قرار گرفت (جدول 1) و از ژن Actin به‌عنوان ژن رفرنس جهت نرمال سازی داده‌ها استفاده شد (Yang et al., 2007; Wang et al., 2011; Aliakbari & Razi, 2013).

توالی ژن‌های مورد نظر با جستجو در بانک‌های اطلاعاتی NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) وEBI (https://www.ebi.ac.uk) و طراحی آغازگرهای اختصاصی با استفاده از برنامه‌هایTcoffee (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:mcoffee) و primer3 (http://primer3.ut.ee) صورت گرفت. پس از طراحی آغازگرها، BLAST آن‌ها انجام شد (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) تا از صحت طراحی آغازگرها اطمینان حاصل شود. جهت به دست آوردن راندمانPCR  برای ژن‌های مورد مطالعه، از یک cDNA، سه رقت یک ، 10  و 100  تهیه شد و بعد از انجام واکنش، کارایی تکثیر 99 درصد به دست آمد.

اندازه محصول PCR برای ژن‌های مختلف از  bp 150-187 متغیر بود (جدول 1) و واکنش PCR Real-Time- در حجم 5/12 میکرولیتر انجام شد. مواد مورد نیاز برای انجام واکنش Real-Time PCR با حجم نهایی 5/11 میکرولیتر با سه تکرار برای هر نمونه تهیه شد.

جدول 1- لیست توالی و خصوصیات آغازگرهای مورد استفاده در این مطالعه

Table 1. The sequence and characteristics of the primers used in this study

AOX1a :    Alternative oxidase 1a, Trx: Thioredoxin H-type , IDH: Isocitrate dehydrogenase 1, FUM: Fumarate hydratase 1, PDH: Pyruvate dehydrogenase

ابتدا در هر تیوپ 5/11 میکرولیتر مخلوط واکنش شامل 25/6 میکرولیتر Master Mix، 5/0 میکرولیتر از هرکدام آغازگرهای رفت و برگشت و 25/4 میکرولیتر ddH₂O ریخته شد و سپس با اضافه کردن یک میکرولیتر از cDNA مورد نظر، با هم مخلوط شدند. برای واکنش کنترل منفی (NTC[4])، همه مواد گفته شده بدون cDNA به کار رفت. عدم مشاهده پیک در انتها برای این واکنش نیز عدم وجود آلودگی یا تکثیر غیراختصاصی بود. چرخه حرارتی مورد استفاده شامل سه دقیقه واسرشته‌سازی اولیه در °C95، سپس 40 سیکل به‌صورت 10 ثانیه واسرشته­سازی در °C95، 20 ثانیه مرحله اتصال آغازگر در دمای Tm (بسته به آغازگر متفاوت بود، جدول 1) و 15 ثانیه مرحله بسط در دمای °C72 بود.

برای مقایسه بیان نسبی ژن‌های موردنظر درفرایند Real time-PCR، از معادله لیواک (Livak & Schmittgen, 2001) استفاده شد. نمودارها با استفاده از اکسل 2016 رسم شد و برای مقایسه ستون­ها، از خطای استاندارد (SE) استفاده شد. همچنین سطح معناداری بیولوژیکی، دو برابر بیان نسبی در نظر گرفته شد (Pasandideh Arjmand et al., 2017; Mohsenzadeh Golfazani et al., 2019; Vahedi et al., 2019).

نتایج و بحث

بررسی مورفولوژیکی گیاه کلزا ژنوتیپ Hyola308 در مقایسه با شاهد، ظهور تدریجی علائم پژمردگی پس از اعمال تنش و تداوم آن را نشان داد؛ در مقابل در ژنوتیپ SLM046 تحت تنش قطع آبیاری در مقایسه با شاهد، در ساعات ابتدایی علائم پژمردگی دیده شد و سپس در ساعات بعدی به تدریج علائم پژمردگی از بین رفت و رشد عادی گیاه از سر گرفته شد. بررسی هر دو ژنوتیپ در شرایط تنش پس از محلول پاشی نشان داد که رشد عادی گیاهان پس از محلول پاشی دوباره از سر گرفته شد و به‌نظر می‌رسد که محلول‌پاشی با متانول، سبب تحمل گیاه به تنش خشکی شده است (شکل 1- A و B).

بیان ژن PDH در ژنوتیپ  SLM046در ساعت ابتدای نمونه برداری (72 ساعت بدون آبیاری) به شدت افزایش پیدا کرد و تا سه برابر شاهد رسید و در ساعات بعدی بیان کمتری داشت (شکل 2). تنش خشکی بر افزایش بیان ژن مذکور نسبت به شاهد افزایش داشت و در هشت ساعت، بیشتر از 24 ساعت بود. همان‌طور که دیده می‌شود، محلول‌پاشی متانول در ژنوتیپ SLM046 در ساعات هشت و 24 نسبت به گیاهان تحت تنش بدون محلول‌پاشی متانول، روی افزایش بیان ژن PDH تاثیر مثبت داشت و در این رقم، موجب عدم کاهش معنی­دار بیولوژیکی بیان ژن شد. میزان بیان ژن پیروات دهیدروژناز در ژنوتیپ حساس در گیاهان تحت تنش قطع آبیاری، نسبت به شاهد تغییر معنی‌داری نداشت، اما در هشت ساعت پس از محلول‌پاشی با متانول، بیان ژن PDH در ژنوتیپ Hyola308 به بیشترین مقدار خود رسید و پس از 24 ساعت بعد از محلول‌پاشی، میزان بیان ژن مربوطه دوباره کاهش یافت و به‌نظر می‌رسد که سیگنال‌هایی که پاسخ آن، بیان ژن PDH را در پی دارد، باعث شده است که این ژن به‌طور موقت افزایش بیان داشته باشد و پس از آن نتوانسته است این بیان را در سطح بالا نگه دارد و در ساعات بعدی، دچار کاهش بیان شده است. به‌طور‌کلی در ساعات ابتدایی، هشت و 24 برای گیاهان Hyola308 که تحت تنش قطع آبیاری قرار داشتند و با متانول محلول‌پاشی نشده بودند، میزان بیان ژن PDH تغییر معنی‌داری نداشت، اما محلول‌پاشی با متانول، سبب افزایش معنی‌داری در هشت ساعت شد. نتایج کلی به‌دست آمده از مقایسه بیان ژن PDH در دو ژنوتیپ متحمل و حساس نشان داد که به‌طورکلی در ژنوتیپ متحمل، با افزایش زمان تنش، مقدار ژن PDH نیز کاهش یافت، اما بیان این ژن با محلول‌پاشی متانول افزایش یافت. به­طورکلی با افزایش زمان تنش در ژنوتیپ حساس، میزان بیان این ژن ابتدا افزایش و سپس کاهش یافت، به‌طوری‌که در رقم حساس وهشت ساعت پس بدون محلول‌پاشی، مقدار PDH بیش­ترین مقدار خود بود و با افزایش زمان تنش یعنی در 24 ساعت پس از محلول‌پاشی، به کمترین مقدار خود رسید؛ احتمالا گیاه در ساعت ابتدایی سعی در تولید استیل‌کوا برای چرخه کربس داشته اسن، اما نتواسته است که این میزان بیان را بالا نگه دارد.

بیان ژن FUM در برگ ژنوتیپ متحمل به خشکی SLM046 در 24 ساعت پس از محلول پاشی متانول به شدت افزایش پیدا کرد، به‌طوری‌که این میزان، حدود 30 برابر شاهد بود (شکل 3). همان‌طور که دیده می‌شود، در ژنوتیپ SLM046 در هشت ساعت پس از محلول‌پاشی متانول، تغییر چندانی نسب به زمان ابتدای نمونه برداری مشاهده نشد و این میزان، چهار برابر بیشتر از گیاهچه‌های محلول پاشی نشده بود. بیان ژن FUM در ژنوتیپ حساس به خشکی Hyola308 در هشت ساعت پس از محلول پاشی با متانول، دارای بیشترین مقدار و حدود پنج برابر شاهد بود و در زمان‌ دیگر، تغییری در بیان این ژن دیده نشد، به‌طوری‌که در 24 ساعت، گیاهان محلول‌پاشی شده با متانول و گیاهان بدون محلول‌پاشی، تغییر چندانی دیده نشد. در مجموع، تنش خشکی تاثیر چندانی بر افزایش میزان بیان ژن مذکور نداشت، اما با محلول‌پاشی در هشت ساعت افزایش معنی‌دار دیده شد.

شکل 3- الگوی بیان ژن FUM با روش Real time PCR تحت تنش خشکی و محلول‌پاشی با متانول در گیاهچه­های SLM046 و Hyola308.

Figure 3. Expression pattern of FUM gene using Real-time PCR under drought stress and foliar application of methanol in SLM046 and Hyola308 seedlings.

افزایش بیان ژن FUM در ژنوتیپ متحمل در ساعات ابتدایی که با ادامه چرخه کربس مواجه است، نشان‌دهنده تولید انرژی ATP برای مقابله با تنش است. محصول دیگر چرخه کربس، NAD(P)H است که  اگر از طریق مسیرهای دیگر مصرف نشود، برای گیاه خطرناک خواهد بود؛ بنابراین به‌نظر می‌رسد که ژنوتیپ حساس با یک تنش ابتدایی مواجه شده است. میزان بیان ژن FUM در ژنوتیپ حساس نسبت به ژنوتیپ متحمل، به‌مراتب کمتر بود احتمالاً گیاه سعی دارد که با سرکوب چرخه کربس، میزان NAD(P)H را کاهش دهد اما در هشت ساعت پس از محلول‌پاشی، میزان بیان FUM افزایش داشته است و گیاه در 24 ساعت، میزان بیان این ژن را مجدد کاهش دهد. همان‌طور که Palatnik et al. (1997) بیان نمودند اگر میزان NADPH تولید شده توسط سایر عوامل آنتی اکسیدان کنترل نشود، خطرات آسیب اکسیداتیو افزایش خواهد یافت؛ بنابراین تولید NADPH در زمان تنش باید کنترل شود. بیان ژن FUM در ژنوتیپ متحمل در ساعات هشت و 24 ساعت بدون محلول‌پاشی کم بود و احتمالا گیاه با کاهش بیان این ژن، میزان تولید NADPH را کاهش می‌دهد و با کاهش این نسبت، تولید گونه‌های فعال اکسیژن نیز کاهش می‌یابد. ژنوتیپ متحمل با محلول‌پاشی متانول به‌ترتیب در هشت و 24 ساعت میزان بیان ژن FUM افزایش یافت، که نشان می‌دهد احتمالا گیاه سعی دارد که چرخه کربس را راه اندازی کند و NADPH تولید شده را به مصرف برساند.

بیشترین بیان ژن IDH در ژنوتیپ SLM046 در ساعات هشت و 24 ساعت در گیاهان پس از  محلول‌پاشی متانول مشاهده شد و میزان بیان آن‌ها تقریبا یکسان و حدود 17 برابر شاهد بود (شکل 4). تنش خشکی باعث افزایش میزان بیان ژن ایزوسیترات دهیدروژناز شد و این میزان در 24 ساعت پس از شروع نمونه برداری، حدود نه برابر، در هشت ساعت، چهار برابر و در زمان شروع نمونه برداری، پنج برابر شاهد بود. در برگ گیاه Hyola308 با افزایش زمان تنش خشکی، بیان ژن IDH کاهش چشمگیری پیدا کرد، به‌طوری‌که در زمان قطع آبیاری (72 ساعت قطع آبیاری)، بالاترین میزان بیان بود، اما در ساعات هشت و 24 ساعت پس از محلول‌پاشی، بیان این ژن کاهش پیدا کرد. بیان ژن IDH در برگ Hyola308 در هشت و 24 ساعت گیاهان محلول‌پاشی شده با متانول، نسبت به گیاهان تحت شرایط تنش خشکی بدون محلول‌پاشی افزایش داشت و این میزان در هشت ساعت به مراتب خیلی بیشتر و حدود شش برابر بود.

در این پژوهش، ژن IDH در رقم حساس بدون محلول‌پاشی به مقدار بسیار کمی بیان شد و در رقم متحمل در پاسخ به تنش خشکی افزایش یافت و میزان آن در هشت و 24 ساعت پس از محلول‌پاشی، برای گیاه متحمل یکسان بود و این موضوع نشان‌دهنده این است که IDH نقش مهمی در تولید NADPH برای احیای گلوتاتیون داشته است و سپس در از بین بردن گونه‌های فعال اکسیژن در برابر تنش اکسیداتیو دخیل بوده است (Abiko et al.2005). ثبات بیان نسبی ژن IDH در هشت و 24 ساعت ممکن است سبب افزایش تحمل گیاه به تنش شود. احتمالاً گیاه متحمل با ثابت نگهداشتن میزان بیان IDH و افزایش بیان نسبی این ژن، مانع از خسارات ناشی از تنش می­شود؛ این در حالی است که محلول‌پاشی متانول، افزایش کمتری در ژنوتیپ حساس نسبت به ژنوتیپ متحمل را در پی داشت.

نتایج حاصل از بررسی بیان ژن TRX در دو ژنوتیپ SLM046 وHyola308  مورد مطالعه تحت شرایط تنش خشکی و محلول‌پاشی با متانول نشان داد که بیان این ژن در ژنوتیپ مقاوم به خشکی SLM046 در هشت ساعت و سپس 24 ساعت پس از محلول‌پاشی متانول به شدت افزایش پیدا کرد، به‌طوری‌که هشت ساعت پس از تنش، به بالاترین میزان خود رسید (شکل 5). بیان ژن مذکور در گیاهان تحت تنش قطع آبیاری بدون محلول‌پاشی، به تدریج افزایش یافت و در 24 ساعت پس از شروع نمونه برداری، بیشترین میزان را دارا بود. به‌نظر می‌رسد که بیان ژن TRX در شرایط تنش خشکی، افزایش یافته است تا بتواند به تدریج با تنش مقابله کند و با محلول‌پاشی متانول زودتر به بالاترین مقدار خود می‌رسد. بیان ژن TRX در ژنوتیپ Hyola308 در زمان‌ هشت ساعت پس از محلول‌پاشی متانول، داری بیشترین مقدار و حدود شش برابر گیاهان بدون محلول‌پاشی بود، ولی در 24 ساعت پس از محلول‌پاشی، میزان بیان ژن TRX در SLM046 به مراتب بیشتر از Hyola308 بود. همان‌طور که دیده می‌شود، محلول‌پاشی با متانول در هشت و 24 ساعت نسبت به ساعت ابتدایی در SLM046 افزایش بیان داشت اما در Hyola308 فقط در هشت ساعت افزایش بیان داشت. ژن TRX در Hyola308 در ساعت ابتدایی نمونه‌برداری دارای افزایش میزان بیان نسبت به شاهد بود و این میزان در ساعت بعدی در گیاهان بدون محلول‌پاشی کاهش یافت، اما با محلول‌پاشی متانول، تغییر معنی‌داری در افزایش میزان بیان این ژن دیده شد. به‌نظر می‌رسد که محلول‌پاشی با متانول می‌تواند باعث تاثیر مثبت بر در بیان ژن‌ TRX شود.

نقش تیوردوکسین، تنها ایفای نقش آنتی‌اکسیدانی نیست؛ مطالعات پروتئومیکس نشان می­دهد که گلوتاردوکسین و تیوردوکسین‌های نوع h در فرآیندهای متعدد سلولی دخالت دارند و ویژگی­های اکسیداسیون و احیایی مهمی را بروز می‌دهند که آن‌ها را در اجرای فعالیت­های متنوعی توانمند می­سازد. تعدادی از اعمال آن‌ها عبارتند از: تحریک جوانه زنی بذر و رشد و نمو گیاه، محافظت سلول در برابر تنش اکسیداتیو، غیرفعال‌سازی پروتئین‌های سمی و محافظت در برابر تنش‌های زیستی و غیرزیستی. همچنین بیش از 500 هدف تیوردوکسین در موجودات فتوسنتزکننده هوازی شناسایی شده است که از جمله آنزیم­های حیاتی برای واکنش­های گیاه به تنش خشکی همچون آنزیم‌های چرخه کالوین و چرخه کربس، آنزیم‌های آنتی اکسیدان (برای مثال کاتالاز، سوپراکسید دیس‌موتاز و مونودهیدروآسکوربات‌ردوکتاز) و پروتئین­های دخیل در انتقال الکترون فتوسنتزی و برداشت نور (LHCIIb و Fd) را در بر می­گیرد (Montrichard et al. 2009). نتایج نشان داد که تیوکسی‌ردوکسین می‌تواند فوماراز و سوکسینات دهیدردژناز میتوکندریای را غیرفعال کند؛ همچنین در شرایط In Vivo سبب متلاشی شدن ATP سیترات لیاز سیتوزولی می‌شود (Daloso et al., 2015). TRX نقش اساسی را در تحمل گیاهان به تنش اکسیداتیو را ایفا می‌کند. آن‌ها در مقابله با آسیب اکسیداتیو، با انتقال الکترون، موجب احیا ردوکتازهای مورد نیاز برای سم‌زدایی هیدروپراکسیدهای چربی و در نتیجه ترمیم پروتئین اکسید می‌شوند (Dos Santos & Rey, 2006). TRX برای احیا خود از فردوکسین ([5]FTR) یا NADPH ([6]NTR) استفاده می‌کند (Reichheld et al., 2005). در بررسی انجام شده روی گیاه آرابیدوپسیس گفته شد که افزایش بیان NTR باعث افزایش تحمل به تنش‌های خشکی و فتواکسیداتیو می‌شود. نتایج آن‌ها نشان داد که افزایش بیان NTR، به حفظ هموستازی گونه‌های فعال اکسیژن تحت شرایط تنش کمک می‌کند (Kim et al., 2017). با توجه به نقش مشترک گلوتاردوکسین و تیوردوکسین برای احیای پروکسی‌ردوکسین در گیاهان مختلف، که در گزارشات دیگر ارائه شده است ( Rouhier et al., 2001; Dos Santos et al., 2005; Michelet et al., 2006; Rouhier et al., 2006; Rouhier et al., 2007; Vieira et al., 2007)،  به نظر می‌رسد که در گیاه کلزا، پروکسی‌ردوکسین برای احیای خود از Trx استفاده کرده است و میزان پراکسید هیدروژن که در اثر تنش افزایش پیدا می‌کند را کاهش داده است که این عمل در هشت ساعت پس از محلول‌پاشی بیشتر بوده است.

بیشترین بیان ژن AOX در برگ گیاه مقاوم به خشکی SLM046 در ابتدای زمان نمونه برداری و حدود 14 برابر شاهد بود (شکل 6). به‌طور‌کلی میزان بیان ژن AOX در گیاهان بدون محلول‌پاشی در ساعت بعدی نسبت به ساعت ابتدایی کاهش و به یک میزان و حدود چهار برابر شاهد بود. ژنوتییپ SLM046 در هشت ساعت پس از محلول‌پاشی متانول با گیاهان بدون محلولپاشی، تفاوت چندانی نداشت و به نظر می رسد که محلول‌پاشی متانول تاثیر چندانی روی افزایش بیان ژن AOX در ژنوتیپ SLM046 در این ساعت نداشته است، ولی در 24 ساعت پس از نمونه برداری، میزان بیان ژن AOX در گیاه بدون محلول‌پاشی بالا بود. کاهش میزان بیان ژن AOX در برگ گیاه حساس به خشکی Hyola308 در هشت ساعت پس از محلول‌پاشی با متانول نسبت به گیاهان بدون محلول‌پاشی بالا بود و در 24 ساعت، محلول‌پاشی با متانول در این ژنوتیپ تغییر معنی داری نداشت. میزان بیان ژن AOX در ژنوتیپ Hyola308 در گیاهان بدون محلول‌پاشی به تدریج افزایش یافت اما در 24 ساعت، دوباره کاهش یافت و محلول‌پاشی با متانول باعث شد که در هشت ساعت، افزایش میان بیان ژن AOX دیده شود. به‌نظر می‌رسد که ژنوتیپ Hyola308 با کم شدن میزان متانول سطح برگ نتواند بیان ژن AOX را حفظ کند. مسیر آلترناتیو اکسیداز، یکی از راه‌های مهم کاهش میزان تولید انواع اکسیژن فعال در اندامک‌های کلروپلاست و میتوکندری است ( Mittler, 2002; Mittler et al., 2004; Edreva, 2005). افزایش بیان ژن AOX1 برای جلوگیری از آسیب رسیدن به فرایند فتوسنتز و تعدیل تولید ROS ضروری است (Fu et al., 2012). شواهد دیگر نشان داد که بیان بیش از حد AOX1 می‌تواند با تولید ROS کمتر، توانایی تحمل به تنش را افزایش دهد (Vanlerberghe et al., 2009).

شکل 6- الگوی بیان ژن AOX با روش Real time PCR تحت تنش خشکی و محلولپاشی با متانول در گیاهچه‌های SLM046 و Hyola308.

Figure 6. Expression pattern of AOX gene using Real-time PCR under drought stress and foliar application of methanol in SLM046 and Hyola308 seedling.

میزان بیان ژن AOX در ژنوتیپ مقاوم SLM046 در ساعات صفر و 24 ساعت پس از نمونه برداری نسبت به ژنوتیپ حساس بیشتر بود و این میزان برای ژنوتیپ SLM046 در هشت ساعت کم بود. کاهش رونوشت AOX در تنش خشکی در مطالعه Filippou et al.  (2011) در نه روز پس از تنش خشکی دیده شد. اجتناب از تولید ROS می‌تواند به اندازه از بین بردن آن مهم باشد. از آن‌جا که بسیاری از تنش‌های محیطی از جمله خشکی، با سرعت زیاد تولید ROS همراه هستند، اجتناب یا کاهش اثرات تنش‌هایی مانند درجه حرارت پایین و یا خشکی، خطر تولید ROS را کاهش خواهد داد. یکی از مکانیزم‌هایی که می‌توانند تولید ROS را در سلول‌های گیاهی کاهش دهند، سیستم‌های جایگزین در زنجیره انتقال الکترون کلروپلاست و میتوکندری است که توسط گروهی از آنزیم‌ها به نام آلترناتیواکسیداز فعال می‌شوند و می‌توانند تولید ROS را کاهش دهند، زیرا همان‌طور که گفته شد، این آنزیم‌ها می‌توانند با برگرداندن جریان الکترون از طریق زنجیره‌های انتقال الکترون، از جریان الکترون‌ها برای احیایO₂  بهH₂O  استفاده نمایند. این آنزیم‌ها تولید ROS را به‌وسیله دو مکانیسم کاهش می‌دهند: الف) آن‌ها از احیای O₂ به  O₂^- توسط الکترون‌ها جلوگیری می‌کنند و ب)  تمامی سطوح اکسیژن را که سوبسترای تولید ROS در اندامک‌ها می‌باشد را احیا می‌کنند. با افزایش بیان ژن AOX در ژنوتیپ SLM046 می‌توان مسیر آلترناتیو اکسیداز را به‌عنوان یکی از مسیرهای ایجاد مقاومت در تنش اکسیداتیو دانست که گیاه با افزایش بیان آن، در برابر تنش اکسیداتیو القا شده توسط تنش اسمزی مقابله می‌کند.

میزان بیان ژنAOX  در ژنوتیپ حساس بسیار کم بود و کاهش میزان AOX میتوکندریایی، حساسیت گیاهان به تنش‌های اکسیداتیو را افزایش می‌دهد (Maxwell et al., 1999; Desikan et al., 2001). هر چند که افزایش بیان در ژنوتیپ Hyola308 در هشت ساعت دیده شد، ولی گیاه نتوانست این افزایش بیان را حفظ کند و دوباره در 24 ساعت دچار کاهش بیان در ژن AOX شد. کاهش در میزان بیان AOX می‌تواند سبب انباشته شدن اکسیژن در میتوکندری شود، زیرا این آنزیم با استفاده از زنجیره انتقال الکترون، سبب احیا اکسیژن در عرض غشا درونی میتوکندری می‌شود و آن‌را به آب تبدیل می‌کند (Edreva, 2005). بنابراین کاهش AOX در زمان بروز تنش در ژنوتیپ حساس Hyola308، تولید گونه‌های فعال اکسیژن و متعاقب آسیب سلولی را در پیش دارد. فعال شدن این ژن در ژنوتیپ مقاوم کلزا می‌تواند از تشکیل انواع اکسیژن فعال پیشگیری کند و سبب شود که فشار الکترون موجود روی زنجیره انتقال الکترونی کاهش یابد. با ارزیابی فعالیت اجزای سازنده مکانیسم‌هایی که NADPH اضافه را بدون تولید ATP (برای جلوگیری از احیای بیش از حد زنجیر تنفسی) اکسید می‌کنند، می‌توان نقاط ضعف و قوت گیاهان را از نظر بیان این ژن‌ها ارزیابی کرد. به‌طور‌کلی نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که میزان بیان ژن‌ AOX در ژنوتیپ متحمل به خشکی کلزا در مقایسه با ژنوتیپ حساس افزایش معنی داری داشت. به نظر می‌رسد افزایش فعالیت این ژن‌های میتوکندریای به تنهایی یا با هم‌دیگر می‌تواند عامل مهمی در بالا بردن میزان تحمل گیاه کلزا به تنش خشکی از طریق خنثی سازی تاثیرات مضر گونه‌های ‌فعال اکسیژن باشد (Mohsenzadeh Golafazani et al., 2017).

نتیجه‌گیری کلی

بررسی مورفولوژی هر دو ژنوتیپ حساس و متحمل کلزا در شرایط محلول‌پاشی متانول پس از تنش قطع آبیاری نشان داد که گیاهان کلزا پس از محلول‌پاشی، رشد عادی خود را از سر گرفت. تنش خشکی با تغییر در میزان فتوسنتز گیاه و وضعیت آب برگ، باعث کاهش رشد گیاه می­شود. از طرفی سلول نیز سعی می‌کند تا با اجرای تدابیر خاص (از جمله تغییر بیان ژن‌ها)، از بروز تنش اکسیداتیو پیشگیری نماید. با توجه به اهمیت ژن‌های PDH، FUM، IDH، TRX و AOX در کاهش تنش اکسیداتیو حاصل از تنش خشکی، کاهش فعالیت ژن‌های فوق باعث تشدید تنش اکسیداتیو و افزایش فعالیت این ژن‌ها، باعث کاهش تنش اکسیداتیو خواهد شد و می‌توان اظهار داشت تحمل گیاه به شرایط دشوار افزایش می‌یابد. همچنین از آن‌جا که IDH، FUM و PDH از ژن‌های کلیدی چرخه کربس می‌باشند و افزایش فعالیت این ژن‌ها به تنهایی یا با همدیگر می‌تواند عامل مهم در بالا بردن میزان تحمل گیاهان به تنش خشکی باشد، از این ژن‌ها می‌توان برای افزایش تحمل به تنش خشکی استفاده نمود. به‌طور‌کلی نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که میزان بیان ژن‌های IDH، FUM و PDH در ژنوتیپ متحمل به خشکی کلزا (SLM046) در مقایسه با ژنوتیپ حساس (Hyola308)، پس از محلول‌پاشی با متانول در میتوکندری افزایش معنی‌داری داشت که به‌نظر می‌رسد متانول باعث افزایش تحمل در ژنوتیپ SLM046 شده است. در ژنوتیپ حساس نیز در ساعات ابتدای تنش، میزان بیان ژن‌های گفته پس از تیمار متانول در مقایسه با گیاهان بدون محلول‌پاشی افزایش داشت، اما در ساعت بعدی، میزان آن کاهش یافته است. افزایش بیان ژن TRX در ژنوتیپ Hyola308 در هشت ساعت و در ژنوتیپ SLM046 در هشت و 24 ساعت پس از محلول‌پاشی متانول دیده شد که احتمالا نشان دهنده کاهش H₂O₂ در مقابله با تنش خشکی در این ساعات باشد؛ بنابراین هرچه مقدار بیان این ژن‌ها در شرایط تنش خشکی بیشتر باشد، می‌توان اظهار داشت که تحمل گیاه به شرایط تنش افزایش می‌یابد. افزایش میزان بیان ژن AOX پس از محلول‌پاشی متانول فقط در ژنوتیپ Hyola308 در هشت ساعت دیده شد و به‌نظر می‌رسد که گیاه کلزا برای مقابله با تنش و راه‌اندازی مسیر آلترناتیواکسیداز، نیازی به متانول نداشته است. با توجه به نقش AOX در کاهش ROS در میتوکندری، نتایج حاصل از بررسی بیان این ژن نشان می‌دهد که بیان ژن‌های AOX تحت تنش خشکی در ژنوتیپ متحمل در مقایسه با ژنوتیپ حساس افزایش می‌یابد؛ بنابراین ژنوتیپ SLM046 با کنترل تنظیم بیان این ژن‌ها می‌تواند اثرات ناشی از تنش اکسیداتیو را مدیریت نماید؛ این امر حاکی از نقش مهم AOX در سم زدایی ROS است

با توجه به اثر متانول در شرایط تنش خشکی بر میزان بیان ژن‌های مورد بررسی در این مطالعه، به‌نظر می رسد که متانول، کارایی مثبتی در شرایط تنش خشکی داشته است و احتمالا با کاربرد متانول، تثبیت دی اکسیدکربن صورت گرفته است و تولید پراکسید هیدروژن کاهش یافته است. به‌طور‌کلی تحمل تنش خشکی تنها مربوط به بیان ژن‌ها، پروتئین‌ها و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان خاص نیست، بلکه پاسخ کلی گیاه به خشکی، نتیجه تغییر در میزان بیان مجموعه‌ای از ژن‌ها، پروتئین‌ها و آنزیم‌هایی با عملکردهای متفاوت و تنظیم دقیق شبکه پروتئین‌های هم بیان و برهم‌کنش پروتئین-پروتئین است. بدیهی است انجام مطالعات بیشتر بر روی کلزا می‌تواند الگوهای مولکولی مناسبی را برای شناخت مقاومت به خشکی فراهم کند.

REFERENCES

1. Aliakbari, M. & Razi, H. (2013). Isolation of Brassica napus MYC2 gene and analysis of its expression in response to water deficit stress. Molecular Biology Research Communications, 2, 63-71.
2. Armand, N., Amiri, H. & Ismaili, A. (2016). The effect of methanol on photosynthetic parameters of bean (Phaseolus vulgaris ) under water deficit. Photosynthetica 54, 288-294.
3. Bai, Y., Yang, P., Su, Y.Y., He, Z.L. & Ti, X. N. (2014). Effect of exogenous methanol on glycolate oxidase and photorespiratory intermediates in cotton. Journal of Experimental Botany 65, 5331-5338.
4. Bartoli, C., Facundo Gomez, G., Gergoff, G., Guiamét, J. J. & Puntarulo, S. (2005). Up-regulation of the mitochondrial alternative oxidase pathway enhances photosynthetic electron transport under drought conditions. Journal of Experimental Botany 56, 1269-1276.
5. Blum, A. (1996). Crop responses to drought and the interpretation of adaptation. Plant Growth Regulation 2, 135-148.
6. Budde, R.J. & Randall, D. D. (1990). Pea leaf mitochondrial pyruvate dehydrogenase complex is inactivated in vivo in a light-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences, 87, 673-676.
7. Daloso, D. M., Müller, K., Obata, T., Florian, A., Tohge, T., Bottcher, A., Riondet, C., Bariat, L., Carrari, F. & Nunes Nesi, A. (2015). Thioredoxin, a master regulator of the tricarboxylic acid cycle in plant mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences, 112, 1392-1400.
8. Desikan, R., Soheila, A-H., Hancock, J. T. & Neill, S.J. (2001). Regulation of the Arabidopsis transcriptome by oxidative stress. Plant Physiology, 127, 159-172.
9. Dos, S., Vieira, C., Cuiné, S., Rouhier, N. & Rey, P. (2005). The Arabidopsis plastidic methionine sulfoxide reductase B proteins. Sequence and activity characteristics, comparison of the expression with plastidic methionine sulfoxide reductase A, and induction by photooxidative stress. Plant Physiology, 138, 909-922.
10. Dos S., Vieira, C. & Rey, P. (2006). Plant thioredoxins are key actors in the oxidative stress response. Trends in Plant Science, 11, 329-334.
11. Dudley, S. A. (1996). Differing selection on plant physiological traits in response to environmental water availability: a test of adaptive hypotheses. Evolution,50, 92-102.
12. Edreva, A. (2005). Generation and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts: a submolecular approach. Agriculture, Ecosystems and Environment, 106, 119-133.
13. Fall, R. & Benson, A. A. (1996). Leaf methanol the simplest natural product from plants. Trends in Plant Science 1, 296-301.
14. Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D. & Basra, S.M.A. (2009). Plant drought stress: effects, mechanisms and management. In Sustainable Agriculture, 29, 153-188.
15. Fernie, A., Fernando Carrari, R, & Sweetlove, L. J. (2004). Respiratory metabolism: glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Current Opinion in Plant Biology, 7, 254-261.
16. Filippou, P., Antoniou, C. & Fotopoulos, V., (2011). Effect of drought and rewatering on the cellular status and antioxidant response of Medicago truncatula plants. Plant Signaling and Behavior, 6, 270-277.
17. Foyer,, Noctor, G. & Hodges, M. (2011). Respiration and nitrogen assimilation: targeting mitochondria-associated metabolism as a means to enhance nitrogen use efficiency. Journal of Experimental Botany, 62, 1467-1482.
18. Fu, A., Liu, H., Yu, F., Kambakam, S., Luan S. & Rodermel, S. (2012). Alternative oxidases (AOX1a and AOX2) can functionally substitute for plastid terminal oxidase in Arabidopsis chloroplasts. The Plant Cell, 24, 1579-1595.
19. Hemming, D.J.B., Criddle, R. S. & Hansen, L. D. (1995). Effects of methanol on plant respiration. Journal of Plant Physiology, 146, 193-198.
20. Kapoor, D., Sharma, R., Handa, N., Kaur, H., Rattan, A., Yadav, P., Gautam, V., Kaur, R., & Bhardwaj, R., (2015). Redox homeostasis in plants under abiotic stress: role of electron carriers, energy metabolism mediators and proteinaceous thiols. Frontiers in Environmental Science, 3, 13.
21. Kim, M. R., Khaleda, L., Jung, I. J., Kim, J. Y., Yeol Lee, S., Cha J. & Kim, W. (2017). Overexpression of chloroplast-localized NADPH-dependent thioredoxin reductase C (NTRC) enhances tolerance to photo-oxidative and drought stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Biology, 60, 175-180.
22. Lemaitre, T. & Hodges, M. (2006). Expression analysis of Arabidopsis thaliana NAD-dependent isocitrate dehydrogenase genes shows the presence of a functional subunit that is mainly expressed in the pollen and absent from vegetative organs. Plant and Cell Physiology, 47, 634-
23. Lemaitre, T., Urbanczyk-Wochniak, E., Flesch, V., Bismuth, E., Fernie, A. R. & Hodges, M. (2007). NAD-dependent isocitrate dehydrogenase mutants of Arabidopsis suggest the enzyme is not limiting for nitrogen assimilation. Plant Physiology, 144, 1546-1558.
24. Li, C.R., Liang, D.D., Xu, R.F., Li, H., Zhang, Y.P., Qin, R.Y., Li, L., Wei, P.C. & Yang, J.B. (2013). Overexpression of an alternative oxidase gene, OsAOX1a, improves cold tolerance in Oryza sativa Genetics and Molecular Research, 12, 5424-5432.
25. Lin, M., Behal, R. H. & Oliver, D. J. (2004). Characterization of a mutation in the IDH-II subunit of the NAD⁺ dependent isocitrate dehydrogenase from Arabidopsis thaliana. Plant Science, 166, 983-988.
26. Livak, K.J. & Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^{− ΔΔCT} Methods, 25, 402-408.
27. Maxwell, D., Yong, W. P. & McIntosh, L. (1999). The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen production in plant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 96, 8271-8276.
28. Michelet, L., Zaffagnini, M., Massot, V., Keryer, E., Vanacker, H., Miginiac-Maslow, M., Issakidis-Bourguet, E. & Lemaire, S. D. (2006). Thioredoxins, glutaredoxins, and glutathionylation: New crosstalks to explore. Photosynthesis Research, 89, 225-245.
29. Mirzai, M., Moeini, A. & Ghanati, F. (2013). Effects of drought stress on the lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in two canola (Brassica napus ) cultivars. Journal of Agriculture, Science and Technology, 15, 593-602.
30. Mittler, R. (2002). Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science, 7, 405-410.
31. Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M. & Breusegem, F. V. (2004). Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science, 9, 490-498.
32. Moeder, W., Pozo, O. D., Navarre, D. A., Martin, G. B. & Klessig, D. F. (2007). Aconitase plays a role in regulating resistance to oxidative stress and cell death in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana. Plant Molecular Biology, 63, 273-287.
33. Mohsenzadeh Golafazani, M., Samizadeh Lahiji, H., & Hassani Kumleh, H. (2017). Patterns of mitochondrial gene expression in rapeseed leaves (Brassica napus) at early growth stage in response to drought stress. Iranian Journal of Field Crop Science, 48, 67-77.
34. Mohsenzadeh Golfazani, M., Pasandideh Arjmand, M., Hassani Kumleh, H., Samizadeh Lahiji, H., Vahedi, R. & Ramezanzadeh Bishegahi, S. (2019). The effect of iron toxicity on some of morphological traits, relative gene expression of G6PDH and peroxidase enzyme activity in resistant and susceptible genotypes of Rice (Oryza sativa). Cereal Research, 9, 207-220.  (In Persian)
35. Mohsenzadeh Golfazani, M., Mohammad, F., Hasani Kumleh, H. & Samizadeh Lahiji, H. (2016). Grouping of some canola genotypes in various drought stress treatment in Germination Stages based on multivariate statistical methods. Iranian Journal of Seed Sciences and Research, 3: 53-65. (In Persian)
36. Nunes-Nesi, A., Carrari, F., Lytovchenko, A., Smith, A., O., Loureiro, M. E., Ratcliffe, R. G., Sweetlove, L. J. & Fernie, A. R. (2005). Enhanced photosynthetic performance and growth as a consequence of decreasing mitochondrial malate dehydrogenase activity in transgenic tomato plants. Plant Physiology, 137, 611-622.
37. Nunes‐Nesi, A., Carrari, F., Gibon, Y., Sulpice, R., Lytovchenko, A., Fisahn, J., Graham, J., Ratcliffe, R. G., Sweetlove, L. J. & Fernie, A. R. (2007). Deficiency of mitochondrial fumarase activity in tomato plants impairs photosynthesis via an effect on stomatal function. The Plant Journal, 50, 1093-1106.
38. Nuruzzaman, M., Sharoni, A. M., Satoh, K., Moumeni, A., Venuprasad, R., Serraj, R., Kumar, A., Leung, H., Attia, K. & Kikuchi, S. (2012). Comprehensive gene expression analysis of the NAC gene family under normal growth conditions, hormone treatment, and drought stress conditions in rice using near-isogenic lines (NILs) generated from crossing Aday Selection (drought tolerant) and IR64. Molecular Genetics and Genomics, 287, 389-410.
39. Palatnik, J. F., Valle E. M. & Carrillo, N. (1997). Oxidative stress causes ferredoxin-NADP+ reductase solubilization from the thylakoid membranes in methyl viologen-treated plants. Plant Physiology, 115, 1721-1727.
40. Pasandideh Arjmand, M., Samizadeh Lahiji, H. & Mohsenzadeh Golfazani, M. (2017). The investigation of some photorespiration genes relative expression in response to drought stress in canola (Brassica napus). Crop Biotech. 7: 31-42. (In Persian)
41. Reichheld, J.P., Meyer, E., Khafif, M., Bonnard, G. & Meyer, Y. (2005). AtNTRB is the major mitochondrial thioredoxin reductase in Arabidopsis thaliana. FEBS letters, 579, 337-342.
42. Ribas-Carbo, M., Taylor, N.L., Giles, L., Busquets, S., Finnegan, P. M., Day, D.A., Lambers, H., Medrano, H., Berry, J. A. & Flexas, J. (2005). Effects of water stress on respiration in soybean leaves. Plant Physiology, 139, 466-473.
43. Rosegrant, M. W. & Cline, S. A. (2003). Global food security: challenges and policies. Science, 302, 1917-1919.
44. Roslan, H. A., Salter, M. G., Wood, C. , White, M. R. H., Croft, K. P., Robson, F., Coupland, G., Doonan, J., Laufs, P. & Tomsett, A. B. (2001). Characterization of the ethanol‐inducible alc gene‐expression system in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 28, 225-235.
45. Rouhier, N., Santos, C. V. D., Tarrago, L. & Rey, P. (2006). Plant methionine sulfoxide reductase A and B multigenic families. Photosynthesis Research, 89, 247-262.
46. Rouhier, N., Gelhaye, E., Sautiere, P.E., Brun, A., Laurent, P., Tagu, D., Gerard, J., Faÿ, E., Meyer, Y. & Jacquot, J. P. (2001). Isolation and characterization of a new peroxiredoxin from poplar sieve tubes that uses either glutaredoxin or thioredoxin as a proton donor. Plant Physiology, 127, 1299-1309.
47. Rouhier, N., Kauffmann, B., Tete-Favier, F., Palladino, P., Gans, P., Branlant, G., Jacquot, J.P. & Boschi Muller, S. (2007). Functional and structural aspects of poplar cytosolic and plastidial type a methionine sulfoxide reductases. Journal of Biological Chemistry, 282, 3367-3378.
48. Sabagh, A., Akbar Hossain, E.L., Barutçular, C., Islam, M. S., Ratnasekera, D., Kumar, N., Swaroop Meena, R., Sobhy Gharib, H., Saneoka, H., & Silva, J. (2019). Drought and salinity stress management for higher and sustainable canola (Brassica napus) production: A critical review. Australian Journal of Crop Science, 13, 88-97.
49. Siddique, M.R.B., Hamid, A. & Islam, M.S. (1999). Drought stress effects on photosynthetic rate and leaf gas exchange of wheat. Botanical Bulletin of Academia Sinica, 40, 141-145.
50. Sienkiewicz-Porzucek, A., Sulpice, R., Osorio, S., Krahnert, I., Leisse, A., Urbanczyk-Wochniak, E., Hodges, M., Fernie, A., & Nunes-Nesi, A. (2010). Mild reductions in mitochondrial NAD-dependent isocitrate dehydrogenase activity result in altered nitrate assimilation and pigmentation but do not impact growth. Molecular Plant, 3, 156-173.
51. Sulpice, R., Sienkiewicz-Porzucek, A., Osorio, S., Krahnert, I., Stitt, M., Fernie, A. R. & Nunes-Nesi, A. (2010). Mild reductions in cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase activity result in lower amino acid contents and pigmentation without impacting growth. Amino Acids, 39, 1055-1066.
52. Tovar‐Méndez, A., Miernyk, J. A. & Randall, D. D. (2003). Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity in plant cells. The FEBS Journal, 270, 1043-1049.
53. Vahedi, R., Mohsenzadeh Golfazani, M., Pasandideh Arjmand, M., & Samizadeh Lahiji, H. (2019). Investigation of relative expression of some genes related to iron-induced toxicity in two varieties of Rice (Oryza sativa). Crop Biotech, 9, 15-28. (In Persian)
54. Vanlerberghe, C., Cvetkovska, M., & Wang, J. (2009). Is the maintenance of homeostatic mitochondrial signaling during stress a physiological role for alternative oxidase? Physiologia Plantarum, 137, 392-406.
55. Vassileva, V., Simova-Stoilova, L., Demirevska, K., & Feller, U., (2009). Variety-specific response of wheat (Triticum aestivum) leaf mitochondria to drought stress. Journal of PLANT Research, 122, 445-454.
56. Vieira, D., Santos, C., Laugier, E., Tarrago, L., Massot, V., Issakidis-Bourguet, E., Rouhier, & Rey, P. (2007). Specificity of thioredoxins and glutaredoxins as electron donors to two distinct classes of Arabidopsis plastidial methionine sulfoxide reductases B. Febs Letters, 581, 4371-4376.
57. Zbieć, I., Karczmarczyk, S. & Podsiadło, (2003). Response of some cultivated plants to methanol as compared to supplemental irrigation. Electronic Journal of Polish Agricultural Universities, 6, 1-7.
58. Zhang, G. & Xie, S. (2014). Influence of water stress on the citric acid metabolism related gene expression in the ponkan fruits. Agricultural Sciences, 5, 1513-1518.
59. Zirgoli, M. H & Kahrizi, D. (2015). Effects of end-season drought stress on yield and yield components of rapeseed (Brassica napus) in warm regions of Kermanshah Province. Biharean Biologist, 9, 133-140

[1] - Reactive Oxygen Species

[2] - Ferredoxin-dependent heterodimeric thioredoxin reductase

[3] - NADPH-dependent thioredoxin reductases

[4] . No template negative control

[5] - Ferredoxin-dependent heterodimeric thioredoxin reductase

[6] - NADPH-dependent thioredoxin reductases