مقدمه

سگ‌ها می‌توانند میزبان اصلی و در برخی موارد میزبان اتفاقی انواع زئونوز‌ها باشند. از بیماری‌های مهمی که می‌توانند از سگ‌ها به انسان انتقال یابند، انواع آلودگی‌ها و بیماری‌های انگلی را می‌توان نام برد. یک دسته مهم از آلودگی‌ها، انگل‌های خارجی هستند. سگ سانان نقش مهمی در نگه‌داری و انتقال این بندپایان ایفا می‌کنند. لذا شناسایی این عوامل بر روی میزبانان مختلف و به خصوص سگ‌ها که در مجاورت انسان زندگی می‌کنند می‌تواند ما را در جهت آگاهی از احتمال وقوع و انتشار بیماری‌های منتقله از سگ‌ها و نیز کنترل آن‌ها مساعدت بیشتری نماید. در این راستا یکی از راسته‌های مهم حشرات که روی پوست زندگی انگلی دارند راسته Siphonapera یا کک‌ها می‌باشند. کک‌ها از متداول‌ترین انگل‌های خارجی هستند که سگ‌ها و گربه‌ها را در سرتاسر جهان آلوده می‌کنند و از لحاظ بیماریزایی بسیار مهم می‌باشند (3‌). کک‌ها علاوه بر ایجاد آزار و اذیت در سگ‌ها و حتی انسان می‌توانند سبب انتقال انواع بیماری‌های باکتریایی، قارچی و ویروسی شوند. به علاوه می‌توانند میزبان واسط کرم‌های پهنی چون Dipylidium caninum و Hymenolepis diminuta شوند. خونخواری کک‌ها می‌تواند دامنه‌ای از اثرات وسیع مخرب مانند التهاب، کم خونی و خارش در حیوان میزبان داشته باشد (13). از کک‌های غالبی که روی میزبان سگ یافت می‌شوند می‌توان به سه گونه Ctenocephalides canis و Ctenocephalides felis و Pulex irritans اشاره کرد (2).

از آنجایی که دو گونه کک سگ و کک گربه متعلق به جنس کتنوسفالیدس هستند لذا دارای شباهت بسیاری با هم می‌باشند. برای شناسایی این دو گونه تاکنون از روش‌های متفاوتی از جمله مطالعه مورفولوژیک و مطالعه مولکولی استفاده شده است. در مطالعات مورفولوژیک ویژگی‌هایی همچون شیب سر، نحوه قرارگیری و اندازه خارهای شانه‌ای و تعداد خار روی ساق پا قابل بررسی می‌باشند. در مطالعه مولکولی نیز تا کنون در جهان از ژن‌های مختلفی همچون ITS2, ITS1 و COX2 استفاده شده است. به عنوان مثال Vobis و همکاران در سال 2004 اقدام به شناسایی ایزوله‌های felis Ctenocephalides و گونه‌های مرتبط با آن را براساس آنالیز توالی‌های ژن‌های 16S rDNA، ITS2, ITS1 شناسایی کردند ‌(12).

معمولاً مطالعات مولکولی اختلاف بین گونه‌ای را دقیق‌تر از مطالعات مورفولوژیک نشان می‌دهند. به همین جهت امروزه بیشتر مطالعات فیلوژنی بر مبنای روش مولکولی است. در تشخیص مولکولی این دو گونه کک، بین محققین اختلاف نظر وجود دارد بدین ترتیب که برخی محققین با استفاده از ژن‌های COX1 و ITS1 این دو گونه را از هم متمایز دانسته‌اند ‌(8،10). ولی برخی دیگر تفاوتی مشاهده نکرده‌اند‌ (1). لذا هدف از انجام مطالعه حاضر، بررسی صحت و سقم این تفاوت با روش‌های مورفولوژیکی و مولکولی بوده است.

مواد و روش کار

ابتدا با مراجعه به بیمارستان دام‌های کوچک دانشکده دامپزشکی تهران، دانشگاه تهران در سال 1394 حدود 50 سگ ولگرد ارجاع شده به بیمارستان دامپزشکی از لحاظ آلودگی به کک مورد بررسی قرار گرفتند، که در این میان تنها 20 قلاده سگ به کک آلوده بودند. سپس نمونه‌ها در شیشه‌های حاوی الکل 70 درصد منتقل شدند. آنگاه به منظور مطالعه مورفولوژیک، نمونه‌‌ها با استفاده از لاکتوفنول، شفاف و روی لام مونت موقت گردیدند. در مرحله بعد با استفاده از کلید تشخیصی معتبر شناسایی مورفولوژیک، نمونه‌ها با توجه به کاراکترهای مربوطه، تشخیص داده شدند.

به منظور استخراج DNA کک‌های جنس کتنوسفالیدس، روش استخراج Ish-horwiz به کار گرفته شد (5). از هر گونه تعداد 20 کک نر و ماده به نسبت مساوی انتخاب و نسبت به استخراج DNA آن‌ها اقدام شد. بدین نحو که هر کک جداگانه درون میکروتیوب استریل انتقال یافت و با استفاده از پستل استریل خرد شد. سپس DNA ژنومی استخراج گردید و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگه‌داری شد.

در مطالعه حاضر، از پرایمرهای به کار گرفته شده در مطالعه Lawrencea و همکاران در سال 2015 (8) برای تکثیر قطعه 552 جفت بازی ناحیه COX1استفاده شد. بدین صورت که برایPCR1 به ترتیب پرایمر‌های بالا دست و پایین دست زیر استفاده شد.

LCO1490: 5'- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG  و

HCO2198: 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

 برای PCR2 به ترتیب پرایمرهای زیر مورد استفاده قرار گرفتند.

Cff-F [S0367]: 5'- AGAATTAGGTCAACCAGGA  و

Cff-R[S0368]: 5'-GAAGGGTCAAAGAATGATG

 واکنشPCR Nested- با حجم کل 15 میکرولیتر از Master mix (آمپلیکون دانمارک) برای هر دو مرحله انجام شد. در PCR1 5/5 میکرولیتر از DNA استخراج شده و در PCR2  1 میکرولیتر از محصول PCR1 به عنوان Templete DNA استفاده شد.

مراحل برنامه تکثیر ژن COX1 در دستگاه ترموسایکلر تنظیم و ثبت گردید. واسرشت اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد، پس از آن 35 چرخه شامل سه مرحله انکوباسیون در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت‌30 ثانیه، اتصال پرایمر در دمای 5/61 درجه سانتی‌گراد برای  PCR1‌و 5/53 درجه سانتی‌گراد برای PCR2 به‌ مدت‌30 ثانیه و بسط (extension) در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه انجام شد. در نهایت مرحله بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه صورت گرفت. پس از طی سیکل‌های ذکر شده در دستگاه ترموسایکلر، 5 میکرولیتر از هر نمونه تکثیر یافته، در ژل آگاروز 1 درصد حاوی 1 میکرولیتر Safestain در بافرTAE به مدت ۴۰ دقیقه با ولتاژ ۸۰ الکتروفورز شدند. تعیین هویت باند‌های حاصل، به کمک مقایسه با مارکر وزن مولکولی100 جفت باز انجام شد. تهیه عکس از ژل، با استفاده از دستگاه ترانس لامیناتور در مجاورت نور ماورای بنفش صورت گرفت. در انتها محصول PCR توسط کیت PCR Purification Kit (Bioneer, Korea) خالص و برای توالی یابی به شرکت پیشگام فرستاده شد.

با توجه به حصول باندهای مشابه 552 جفت بازی برای هر دو گونه Ct. felis وCt. canis در آزمایش فوق، تصمیم به انجام آزمایش RFLP‌–‌PCR گردید. در RFLP از آنزیم ‌Taq1 به منظور شناسایی دو گونه Ct. felis و Ct. canis استفاده گردید.

 برای RFLP طبق دستورالعمل شرکت سازنده آنزیم، مقدار 10 میکرولیتر از محصول PCR ، 2 میکرولیتر از بافرX 10 آنزیم، 1 میکرولیتر آنزیم Taq1 و 17 میکرولیتر آب مقطر استریل اضافه شد تا حجم نهایی واکنش به 30 میکرولیتر برسد. در مرحله بعد ژل آگارز 2 درصد حاوی رنگ Safestain تهیه شد. سپس محصول PCR نمونه‌ها، به صورت بدون آنزیم و دارای آنزیم در چاهک‌ها کنار هم در سمت کاتد لود و به مدت 60 دقیقه با ولتاژ 80 ولت الکتروفورز شدند. سپس از باندها عکس برداری شد و باند‌ها مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفتند.

جهت تعیین ترادف بازی، تعداد دو محصول PCR از ایزوله‌ها به صورت تصادفی انتخاب و به شرکت پیشگام ارسال گردید. برای ارزیابی تنوع ژنتیکی در میان ایزوله‌های کک این مطالعه با ایزوله‌هایی که در بانک اطلاعات ژن (GenBank) قبلاً ثبت شده بود، Multiple alignment انجام شد و با نرم افزار MEGA6 با الگوریتم Maximum Likelihood درخت فیلوژنی ترسیم گردید.

نتایج

در مطالعه حاضر از 20 قلاده سگ آلوده به کک، 9 قلاده (45 درصد) به جنس نر و 11 قلاده دیگر (55 درصد) به جنس ماده تعلق داشتند. مطالعات مورفولوژیک کک‌های جدا شده از سگ‌های ولگرد تهران بر اساس کلید تشخیص معتبر Rothschild و Schlein در سال 1986 (11) نشان داد که همه کک‌های صید شده در این مطالعه به خانواده Pulicidae تعلق دارند.

از 605 کک جمع آوری شده 374 نمونه به گونه P. irritans، 222 نمونه به گونه Ct. canis و 9 نمونه به گونه Ct. felis تعلق داشتند. پس از انجام محاسبات آماری مشخص گردید که گونه P. irritans با فراوانی 8/61 درصد فراوان‌ترین گونه، گونه Ct. canis با فراوانی 6/36 درصد در مرتبه دوم و گونه Ct. felis با فراوانی 84/1 درصد در مرتبه سوم بود.

در مطالعه مورفولوژیکی دو گونه Ct felis و Ct. canis، ابتدا از ویژگی‌های متعددی چون مقدار خمیدگی سر، تعداد خار بین Apical setae و Postmidian setae، تصویر کلاسپر در گونه‌های نر و سایر ویژگی‌های دیگر استفاده شد. سر در کک Ct. canis در قسمت بالایی و قدامی خمیدگی تندتری دارد ولی در گونه Ct. felis این خمیدگی شیب کندتری دارد (تصویر 1 الف و ب). خصوصیات مهم دیگری که می‌تواند این دو گونه را از هم جدا کند تعداد خارهای بین خارهای Apical setae و Postmidian setae روی ساق پای عقب است. در گونه کتنوسفالیدس کنیس بین جفت خار انتهای ساق پای عقب دو خار کوچک‌تر مشاهده می‌شود ولی در گونه فلیس بین دو جفت خار ذکر شده تنها یک خار کوچک مشاهده می‌شود (تصویر 1 ج و د).

در خصوص مطالعه مولکولی، نتایج بدست آمده از الکتروفورز محصول PCR قطعه ژن COX1 تکثیر شده در هر دو گونه Ct. felis و Ct. canis نشان داد که دو گونه مذکور دارای باند مشابه 552 جفت بازی بوده‌اند (تصویر 2).

نتایج حاصل از RFLP با استفاده از آنزیم Taq1 نشان داد، که این دو گونه تفاوتی با هم ندارند. بدین ترتیب که آنزیم فوق جایگاه 252 از قطعه ژن تکثیر شده COX1 را برش میزند و سبب ایجاد باند‌های 252، 169، 131جفت بازی در Ct. felis  و Ct. canis می‌شود (تصویر3).

درخت فیلوژنی حاصل از الگوریتم Maximum Likelihood ژن Cox1 کک‌های Ct.cani و Ct.felis در تصویر 4 نشان داده شده است (تصویر4).

بحث

مطالعه حاضر نشان داد که کک‌ها از متداول‌ترین انگل‌های خارجی سگ‌ها به شمار می‌روند. تقریباً در تمام مطالعات انجام شده روی انگل‌های خارجی سگ، کک‌ها گزارش شده‌اند. برای مثال Jafari و همکاران در سال 2008 در شیراز مطالعه‌ای جهت بررسی انگل‌های خارجی قلاده سگ انجام دادند. این مطالعه بر روی 160 قلاده سگ انجام شد و طی آن دو گونه کک شامل  Pulex irrtans, C. canisو تعدادی مایت تشخیص داده شد (6). در مطالعه‌ای دیگر که توسط Jamshidi و همکاران در سال ۲۰۱۲ بر روی انگل‌های خارجی سگ‌های شهر تهران انجام شد، کک‌های گونه Ct. felis، Ct. canis و کنه Rhipicephalus bursa شناسایی شدند (7). در مطالعه حاضر، بر اساس نتایج مورفولوژیک کک‌های جمع‌آوری شده، 3 گونه Ct. felis، Ct. canis و P. irritans تشخیص داده شدند، که گونه P. irritans با درصد فراوانی 8/61 درصد نسبت به دوگونه Ct. felis وCt. canis فراوانی بیشتر و گونه Ct. felis دارای کمترین فراوانی بود.

با این حال در مطالعات مختلف، آمار متفاوتی از مقایسه درصد فراوانی سه گونه Ct. felis، Ct. canis و P. irritans جدا شده از سگ‌ها بدست آمده است. برای مثال در مطالعه‌ای که توسط Azarm و همکاران در سال 2016 بر روی کک‌های جمع آوری شده از سگ‌های شهرستان مشکین شهر انجام شد، گونه‌های Ct. canis، Ct. felis و P. irritans به ترتیب با فراوانی 48/95 درصد، 23/1 درصد و 28/3 درصد گزارش شده‌اند (1).

در طی سال‌های گذشته مطالعات مورفولوژیک زیادی بر روی کک‌های سگ در مناطق مختلف ایران و همچنین کشورهای مختلف دنیا انجام گرفته است. برای مثال مطالعه‌ای توسط Linardi و همکاران در سال 2012 بر روی تمایز مورفولوژیکی دو گونه کک سگ و گربه با استفاده از کاراکتر‌های مورفولوژیک انجام شد (9). در این خصوص مطالعه Linardi و همکاران در سال 2012 نشان داد در برخی موارد بعضی خصوصیات مورفولوژیک همچون کتوتاکسی ساق پای عقب از کلید تشخیصی مربوط به گونه مورد نظر تبعیت نمی‌کند و در نهایت این نتیجه حاصل شد که در تشخیص مورفولوژیک با در نظر گرفتن تمام کاراکترهای تشخیصی (از جمله تصویر سر، ‌اندازه خار اول ودوم شانه گونه‌ای، تعداد خار رویLMA ، تعداد گره در ساق پا، کتوتاکسی پا، تعداد خار در ناحیه پشتی پای عقبی، تصویر قبضه کلاسپر و...) می‌توان تصمیم‌گیری مطمئن و صحیح داشت (9).

در مطالعه مولکولی با استفاده از ژن COX1، کک‌های جنس کتنوسفالیدس شناسایی شدند، با این حال علیرغم مطالعه‌ای که توسط Lawrencea و همکاران در سال 2015 مبنی بر تفکیک دو گونه Ct. felis و Ct. canis با استفاده از ژن مذکور انجام شد (8)، در مطالعه حاضر بین گونه‌های این جنس تفکیکی حاصل نشد و توالی‌های به دست آمده نشان داد توالی گونه Ct. felis در این جایگاه ژنی به احتمال 99 درصد مشابه گونه Ct. canis است.

در مطالعه Hornok و همکاران در سال 2018 که بر روی کک‌های گوشتخواران اهلی و وحشی، جوندگان، انسان و محیطی جمع‌آوری شده از پنج کشور جهان انجام شد، شباهت زیادی در ژن‌های مختلف در هر دو گونه بر اساس آزمایش‌های PCR و ترادف بازی مشاهده شد ‌(4). Marrugal و همکاران در سال 2013 مطالعه‌ای برای بررسی و جدا سازی گونه‌ها و زیرگونه‌های کک‌های سگ و گربه با روش‌های مورفولوژیک و مولکولی انجام دادند. در این مطالعه کک‌های مورد ارزیابی از سه کشور ایران، آفریقای‌جنوبی و اسپانیا بود. گونه‌های تشخیص داده شده در این مطالعه شامل Ct. canis و Ct. felis  بودند که به روش RFLP با استفاده از ژنITS1 و آنزیم HaeIII از همدیگر تفکیک شدند و سپس زیر گونه‌های آن‌ها مشخص گردید (10). با این حال در مطالعه‌ای که توسط Azarm و همکاران در سال 2016 برای تفکیک دو گونه Ct. canis و Ct. felis با استفاده از ژن ITS1 و آنزیم HaeIII انجام شد. بر خلاف مطالعه Marrugal و همکاران در سال 2013 این دو گونه با استفاده از این ژن قابل تفکیک از هم نبودند، به علاوه نتایج حاصل از تعیین توالی در مطالعه Azarm و همکاران در سال 2016 نشان دادند دو گونه Ct. canis و Ct. felis به لحاظ ژنتیکی 99 درصد مشابه هم بودند (1،10). بزرگ‌ترین و کامل‌ترین مطالعه مولکولی بر روی کک‌ها توسط Whiting و همکاران در سال 2008 انجام گرفت (14). آن‌ها به بررسی ارتباطات فیلوژنتیکی در میان کک‌ها پرداختند و پس از جمع‌آوری 128 گونه کک از سراسر جهان با استفاده از ژن‌های 28SrDNA و 18SrDNA آن‌ها را شناسایی مولکولی کرده و در 16 خانواده قرار دادند.

نتیجه گیری: به طور کلی با توجه به نتایج مطالعه حاضر و مطالعه Azarm و همکاران در سال 2016، گرچه این دو گونه کک سگ از لحاظ مورفولوژی قابل تفکیک هستند ولی تشخیص مولکولی آن‌‌ها با استفاده از ژن‌های ITS1 و COX1 در ایران موفقیت آمیز نبوده است. شاید این دو ژن کارایی لازم برای تفکیک این دو گونه را نداشته باشند و لازم است که از ژن‌های دیگری در این خصوص استفاده شود.

سپاسگزاری

این مقاله بخشی از پایان نامه کارشناسی ارشد حشره‌شناسی پزشکی است که کلیه اعتبار آن توسط دانشگاه تربیت مدرس پرداخت شده است. نویسندگان مقاله از زحمات آقای دکتر مجید پیرستانی و خانم باغخانی بخاطر کمک‌ها و محبت‌های بی شائبه آن‌‌ها نهایت تشکر و قدردانی را دارند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.