کشف، تعیین و ژنوتیپ‌سنجی نشانگرهای SNP و گروه بندی لاین‌های پیشرفته گندم نان به روش ddRAD-Seq

مقدمه

گندم یک محصول زراعی مهم، اصلی و عمده است که در بیشتر قسمت­های جهان رشد می­کند (Kristensen et al, 2018). دو حالت اصلی از آلوپلی­پوئیدی گندم یعنی هگزاپلوئید (Triticum aestivum ssp. aestivum) با اندازه ژنوم حدود Gb 17 و تتراپلوئید (Triticum turgidum ssp. durum) با اندازه ژنوم Gb 12 وجود دارد (Borrill et al., 2015). بیش از 95 الی 99 درصد از نواحی کد­کننده در کروموزوم‌های همیولوگ­های گندم مشابه هستند (Krasileva et al., 2013). اندازه عظیم ژنوم گندم، درجه شباهت زیاد توالی­ها و محتوای DNA تکراری آن، مانع جدی در تولید نسخه اولیه توالی ژنوم گندم بود. در نتیجه پژوهشگران در ابتدا روی توالی­های کد کننده (CDS) و مجموعه­های بزرگ توالی­های نشانمند ترجمه شده (ESTs) فعالیت نمودند و یک نقشه مونتاج شده از این توالی­ها تولید کردند. از طرفی، ظهور فن­آوری NGS رویکرد جدیدی برای غلبه بر مشکلات توالی­یابی ژنوم گندم فراهم نمود. فن­آوری نسل جدید دوم و سوم NGS، باعث دگرگونی اساسی در آنالیز ژنوم و دررنتیجه افزایش فهم ما از رابطه ژنوتیپ - فنوتیپ شده است (Mochida et al., 2009). توالی­یابی DNA یک فرآیند دقیق است که ترتیب صحیح نوکلئوتیدها در یک مولکول DNA را تعیین می­کند (El-Metwally et al., 2014). ظهور فن­آوری­های توالی­یابی، نقش مهمی در تجزیه و تحلیل توالی­های ژنومی ارگانیسم­ها بازی کرده است (Shendure & Ji, 2018 ). اولین فن­آوری توالی­یابی در سال 1977 به‌وسیله Sanger و Maxam - Gilbert ایجاد شد. فن­آورهای نسل جدید تحت عنوان فن­آوری توالی­یابی NGS یا فن­آوری های توالی­یابی­خودکار با مقیاس بالا، در سال 2005 با فن آوری Roche’s 454 معرفی شدند. فن­آورهای NGS آنالیز حجیم موازی بصورت خودکار از چندین نمونه با هزینه خیلی کم تولید می­کنند و قادر به توالی­یابی میلیون­ها تا میلیاردها خوانش به‌صورت موازی و همزمان در یک مرحله اجرا هستند و زمان مورد نیاز برای تولید خوانش‌های با اندازه گیگابایت اطلاعات، تنها چند روز یا ساعت است (Mardis, 2011). در زمینه تحقیقات گیاهی، فن­آوری­های NGS یکی از ابزارهای مهم برای تشکیل اسمبلی ژنوم‌های مرجع گیاهان زراعی، توالی­یابی ترانسکریپتوم برای تحقیقات بیان ژن، توسعه نشانگرهای مولکولی در سطح ژنوم و شناسائی نشانگرها در ژن­های با عملکرد معین شد
 (Vlk & Repkova, 2016). پلاتفرم Roche/454 در سال 2005، Illumina/Solexa در سال 2006 و ABI/SOLiD در سال 2007 ایجاد شده­اند
 (Kchouk et al., 2017). اولین توالی گندم با استفاده از فن آوری 454 و بر اساس توالی­یابی شات­گان (WGS) یا شکستن کل ژنوم در سال 2012 منتشر شد (Brenchley et al., 2012). تولید توالی­های مرجع CSS (IWGSC, 2014) با ابعاد نقشه 10.2 Gb  و W7984 (Chapman et al., 2015) با 9.1 Gb   اولین قدم مهم نسبت به کشف تنوع در بین گونه­های گندم بود (Borrill et al., 2015). آخرین ژنوم مرجع معرفی شده از سوی کنسورتیوم بین المللی توالی­یابی گندم به نام IWGSC RefSeq v1.0 reference  با اندازه نقشه 14.5 Gb و عمق 94 درصد بود که از داده­ های POPSEQ و نقشه HiC  برای تهیه آن استفاده شده است (IWGSC, 2018). از طرفی، اندازه بزرگ و پیچیدگی ژنوم گندم، امکان توالی­یابی مجدد کل ژنوم واریته گندم جدید با توجه به فن­آوری­های جاری، از نظر اقتصادی میسر نیست. بنابراین، روش­های کاهش اندازه ژنوم برای دسترسی به تنوع درون گونه­ها که تقریبا بر SNP ها متمرکز شده به‌طور گسترده در گندم استفاده شده است (Borrill et al., 2015). دو رویکردGBS  
(Poland & Rife, 2012) و ddRAD (Shirasawa et al., 2016) برای کشف و ژنوتیپ­سنجی همزمان SNP با استفاده از آنزیم­های برشی و کاهش اندازه ژنوم بوجود آمده است (Vlk & Repkova, 2016). ژنوتیپ‌سنجی SNP بوسیله NGS به صورت GBS ، RAD-Seq و ddRAD-Seq به خاطر انعطاف پذیری و هزینه پایین متداول شده­اند (Shirasawa et al., 2016). روش­هایGBS  و RAD-Seq تولید خوانش از یک انتها (single-end) نموده، در صورتیکه روش ddRAD-Seq تولید خوانش از دو انتها (paired-end) می­نماید، و در نقشه­یابی خوانش‌ها نسبت به ژنوم مرجع به ویژه درگیاهان که اغلب دارای ژنوم پلی­پلوئیدی بزرگ و پیچیده بوده، صحیح­تر است. در روش ddRAD-Seq از دو آنزیم برشی، که آنزیم دوم به منظور کاهش هزینه و زمان آماده سازی کتابخانه و توالی­یابی دو طرفه از ژن­های همسان­ برای تمام نمونه­ها، استفاده می­شود. بنابراین از نقطه نظر صحت بالاتر در نقشه­یابی خوانش‌ها، حتی در ژنوم­های گیاهی پیچیده، فن­آوری ddRAD-Seq سودمندی آن نسبت به GBS و RAD-Seq مناسب­تر است (Shirasawa et al., 2016). روش ddRAD-Seq به‌وسیله Shirasawa et al. (2016) در گوجه فرنگی بررسی و شیوه تحلیل داده­های تجربی و in silico را معرفی کردند. Arafa et al. (2017) از روش ddRAD-Seq برای شناسائی ژن­های کاندید مقاومت به بیماری بادزدگی در جمعیت نسل دوم گوجه فرنگی استفاده نمودند. DaCosta & Sorenson  (2016) نتیجه گرفتند که روش ddRAD-Seq یک روش مقرون به صرفه  برای تولید داده­های فیلوژنی قوی، به‌ویژه برای تجزیه و تحلیل گونه و جنس نزدیک، است. تنوع ژنتیکی کلید اصلی برای موفقیت در به­نژادی و مبنای اساسی برای به­نژادگران برای انتخاب مداوم ارقام با عملکرد اصلاح شده است. از طرفی انتخاب شدید در دوره اهلی­سازی و به­نژادی، باعث حذف تنوع ژنتیکی قابل ملاحضه­ای در خزانه­های اصلاحی گیاهان اصلی شده است و فرسایش پتانسیل ژنتیکی برای سازگاری در برابر تغییرات مانند آب و هوا را در پی داشته است. فناوری­های با توان بالا ژنومی، از طریق ارائه دانش دقیق نسبت به توصیف و پرکردن تنوع ژنتیکی در برنامه­های به­نژادی، قادر به حل این معضل هستند. اطلاع از گروه­بندی جمعیت و روابط ژنتیکی مبنائی برای ایجاد گروه­های هتروزیس غیر متقارب برای افزایش میزان هتروزیس در رویکردهای به­نژادی گندم هیبرید مهم است (Melchinger, 1999). از طرفی، مبادله شدید واریته­های الیت درون برنامه­های به­نژادی گندم که به‌طور سنتی روی راهبردهای اینبریدینگ به جای تشکیل خزانه هیبرید تکیه کرده‌اند، باعث کاهش شدید تمایز بین مواد الیت شده است (Voss-Fels et al., 2015). Wang et al (2017)، در بررسی یک پنل 105 عددی از واریته­های گندم و لاین­های پیشرفته با استفاده از آرایه K90، چهار زیر جمعیت براساس هشت مولفه اصلی PC  و آنالیز شباهت ژنتیکی به‌وسیله نشانگر SNP با روش هیت­مپ، گروه­بندی نمودند. بنابراین هدف این تحقیق، تعیین ژنوتیپ­، تعداد، پراکنش و چگالی نشانگر SNP و گروه­بندی و تفکیک زیر جمعیت­ها بر اساس فاصله ژنتیکی نشانگر SNP برای یک جمعیت پیشرفته اصلاحی است.

مواد و روش­ها

مواد ژنتیکی

در این پژوهش، از 50 ژنوتیپ و رقم زراعی حاصل از انتخاب لاین­های برتر از یک آزمایش مشترک مقدماتی تحت عنوان PRBWYT از ایستگاه­های گرگان، گنبد، ساری و مغان برای اقلیم گرم و مرطوب شمال موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال، استفاده شده است (جدول 1 ضمیمه).

استخراج، تعیین سلامت و رقیق سازی DNA

به‌منظور استخراج DNA، از بافت برگ گیاهچه­های با سن چهارده روز نمونه­برداری شد و نمونه‌ها سریعا به آزمایشگاه موسسه تحقیقات DNA کازوسا (www.kazusa.or.jp/en/) انتقال یافتند و در فریزر 80- درجه ذخیره شدند. از دستگاه Tissuelyser II  (Qiagen Inc., Hilden, Germany) برای آسیاب و از پروتکل شرکت کیاژن (The DNeasy Plant Mini kit) برای استخراج DNA  نمونه­هااستفاده شد. غلظت اولیه DNAبا دستگاه Nano drop ND-1000 تعیین شد. برای تعیین سلامت DNA از ژل آگارز 7/0 درصد، بافر 1X BPB و دو نشانگر لاندا (λ) یک باندی و |HinIII  λ چند باندی استفاده شد (Liljeroth & Bryngelsson, 2002). کمیت دقیق­تر DNAبه‌وسیله کیت­های Qubit® dsDNA BR Assay Kits (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA ) و با دستگاهQubit® 30 Fluorometer تعیین شد (شکل 1).

شکل 1- تعیین سلامت DNA استخراج شده نمونه­ها.

Figure1. Health determination of DNA extracted from samples.

پروتکل ddRAD-Seq

پس از استخراج DNA ژنومیک با کیفیت مناسب و برای کاهش اندازه و برش ژنوم، از دو آنزیم برشی FastDiges PstI و FastDiges MspI و بافر 10X FastDigest Buffer استفاده شد (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) و پلیت DNA  ژنومیک به مدت دو دقیقه با سرعت rpm 100 × 100 سانتریفیوژ و در زمان 16 ساعت با دمای 37 درجه سانتیگراد در دستگاه PCR  انکوبات شد. پس از مرحله هضم، آداپتورهای ,RAD-ad1-PstI Adaptor(50μm) RAD-ad2-PstI Adaptor(50μm)، RAD-ad1-MspI Adaptor(50μm) وRAD-ad2-MspI Adaptor(50 μm)، آنزیم­های FastDiges PstI و FastDiges MspI، آنزیم T4 DNA ligase (Promega, Madison, WI, USA) و بافر 2x Rapid ligation buffer به DNA ژنومیک اضافه، و سپس پلیت نمونه­ها در دستگاه PCR برای شرایط 16 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه و 37 درجه به مدت 10 دقیقه و برای 25 سیکل انکوبات شد. برای حذف قطعات با طول کمتر از bp 350 از محلول گوی­های مغناطیسی AMPure beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) استفاده شد. پس از رقیق سازی DNA ژنومیک به نسبت یک به 100 و قبل از تشکیل کتابخانه مشترک، اندیکس  Read1_N5**/Read2_N7**(0.5uM) و مخلوط ترکیبات 10x KOD buf -plus-، dNTP، MgSO4،KOD –plus– ver.2  (Toyobo, Osaka, Japan) اضافه شد. برنامه ddRAD-Seq برای دستگاه PCR و تکثیر قطعات به صورت؛ آغاز عمل واسرشت‌سازی در دمای °C 95 به مدت سه دقیقه، 20 سیکل بصورت عمل واسرشت: دمای °C 94 در 30 ثانیه، اتصال: دمای °C 55  در 30 ثانیه، تکثیر: دمای °C 72 در یک دقیقه و سه دقیقه انتهایی بعد از اتمام دوره سیکل عمل تکثیر در دمای °C 72 ، انتخاب شد. برای تعیین غلظت DNA  ژنومیک از بافر (Qubit® dsDNA HR Buffer)  و محلول واکنشگر (Qubit® dsDNA HS Reagent) با حساسیت بالا و دو استاندارد یک (Qubit™ ds DNA HS) و دو (Qubit™ ds DNA HS) استفاده شد. پس از PCR، از هر نمونه حدود چهار میکرولیتر برداشته و در هشت تا نه میکروسانتریفیوژ 200 میکرولیتر جمع­آوری شد و سپس همه مقادیر در یک میکروسانتریفیوژ 5/1 میلی­لیتری جمع­ شدند و کتابخانه (Pooling) تشکیل شد که به‌وسیله دستگاه کیوبیت، غلظت آن سنجیده شد. با استفاده از دستگاه BluePippin قطعاتDNA  ژنومیک در رنج  500~800bp انتخاب و خالص­سازی شدند و کتابخانه آزمایشگاهی برای انجام توالی­یابی آماده شد.  تعیین کمیت و کیفیت DNA ژنومیک کتابخانه به‌وسیله دستگاه­های Qubit (ds DNA HS) و Tape Station Hs D1000 صورت گرفت. برای تعیین غلظت دقیق DNA ژنومیک برحسب پیکومولار، از کیتKapa Library Quantification Kit(KAPA Kit)  استفاده و غلظت با دستگاه 7900HT Fast Real-Time PCR system شرکت Life Technologies تعیین شد. پس از تصحیح رقت کتابخانه به یک nM، عمل واسرشت و رقیق سازی بوسیله محلول 0.2N NaOH، بافر HT1 و PhiX control انجام گرفت. عملیات بارگذاری کتابخانه در کاتریج واکنشگر آماده سازی و با  دستگاه500 Sequencer   NextSeq ^TM   توالی­یابی انجام گرفت.

فرآیند محاسبات روش ddRAD-Seq تجربی

پس از خاتمه عمل توالی­یابی کتابخانه،  اطلاعات در قالب فایل qseq file format(qSEQ) آماده و ارائه شد و بر حسب نوع فن­آوری هر دستگاه، یک فایل تعیین کیفیت توالی به نام fastQC تهیه شد که معمولا بر مبنای نمره فرد (Phred) تولید می­شود. نمره کیفیت فرد شاخصی است که کیفیت شناسائی بازهای نوکلئوتیدی که به‌وسیله سکونسرها به صورت خودکار تولید شده است را بررسی می­کند. پس از این مرحله، برای استخراج توالی­های صحیح، از پاپلاین­های بیوانفورماتیک استفاد شد (Shirasawa et al., 2016). ابتدا توالی­های با کیفیت پایین (خوانش یا رید) به‌وسیله نرم افزار PRINSEQ و سپس آداپتورها به‌وسیله fastx_clipper حذف شدند. پس از آن، خوانش‌های فیلتر شده نسبت به توالی­های مرجع از جمله IWGSC RefSeq v1.0 ، CSS، W7984 و IWGSC-WGA v0.4 (IWGSC, 2018) با استفاده از نرم افزار bowtie2 نقشه­یابی شدند. فایل فرمت نتیجه همردیف/ نقشه SAM (Sequence Alignment Map) به فایل فرمت همردیف/ نقشه باینری تبدیل شد و سپس برای قرائت SNP استفاده شد و در نهایت، فایل VCF
 (variant call format) تولید شد. برای مشاهده موقعیت توالی­های SNP برای هر ژنوم و کروموزوم و تعداد آن‌ها، از نرم‌افزار TASSEL ورژن 5.2.33 (Bradbury et al., 2007)، استفاده شد. روش تجزیه به مولفه­های اصلی (PCA) بر اساس روش گروه بندی k – means و مقادیر حساب شده بر اساس فاصله تعدیل شده Roger (MRD) برای 3342 نشانگر پلی­مرفیسم SNP و 50 لاین و رقم زراعی اجرا شد. هیت­مپ خویشاوندی بین 50 لاین که در آن دندروگرم­ها با استفاده از روش میانگین جفتی عدم وزنی (UPGMA) بر حسب فاصله اقلیدسی برای 3342 نشانگرها پلی­مرفیسم SNP ترسیم شد و درجه ارتباط به‌وسیله رنگ (قرمز = ارتباط قوی) نشان داده شد. برای اجرای PCA از دستورات k-means)) و هیت­مپ؛ heatmap)) در محیط نرم­افزار R ورژن 3.3.2 R Core Team, 2016) ) استفاده شده است.

نتایج و بحث

کیفیت باندی حاصل از ازوش استخراج شرکت کیاژن مناسب بود (شکل1). این قدم اولیه در تهیه کتابخانه مناسب و تامین شرایط برای توالی­یابی پلاتفرم Illumina® است (Karaaslan et al., 2014). طول خوانش‌های تولید شده از پروتکل ddRAD-Seq معادل bp 93 که پس از پیراش به bp 76 رسید. متوسط نمره کیفیت توالی­یابی برای هر دو طرف (Paired-end) برای کتابخانه 30 فرد بود (شکل 2).

از مجموع 178811846 خوانش توالی قرائت شده، 150108678 خوانش صحیح یعنی معادل 84 درصد و  به‌طور متوسط به ازای هر لاین 2207480 خوانش تولید شد. لاین C13 با 1109856 خوانش، کمترین و C40 با 2673418 خوانش، بیشترین توالی صحیح تولید نمودند (جدول 1). با توجه به نرخ همردیفی و کیفیت نقشه، تعداد خوانش‌های صحیح نقشه­یابی شده به ازای هر ژنوم در توالی­های مرجع IWGSC Ref Seq v1.0، CSS، W7984 و  IWGSC-WGAV0.4 متفاوت، که توالی مرجع IWGSC Ref Seq v1.0 نسبت به بقیه مطلوب­تر بود (داده­ها منتشر نشده است). در نقشه­یابی خوانش‌های صحیح نسبت به ژنوم رفرنس IWGSC RefSeq v1.0 گندم، بالاترین نرخ همردیفی مربوط به ژنوم B و کمترین مربوط به ژنوم D بود. این یافته­ها نشان می­دهد که تعداد خوانش‌های صحیح در روش ddRAD-Seq  به علت قرائت از دو انتها
(paired-end) بیش از دو برابر نسبت به روش GBS گزارش شده توسط Alipour et al.  (2017) بود. در فیلتر اولیه با عمق توالی مساوی و بیشتر از پنج (DP≥5) و نمره کیفیت مساوی­ و بیشتر از 999 (Quality score=≥999) برای حذف چند آللی و نواحی حذف و اضافه (Indels)، تعداد 1032760 نشانگر SNP قرائت شد. با انجام فیلتر دوم برای فراوانی آلل­های نادر کمتر از پنج درصد (MAF>5%) و میزان هتروزیگوت بالاتر از 10 درصد (Het<10%) برای داده­های گم­شده 20 %، 30 %، 40 % و 50 % انجام شد. که بیشترین SNP قرائت شده برای داده­های 50 درصد گم­شده بدست آمد (جدول 2). تعداد کل SNP های صحیح فراخونی شده برای 50 درصد داده گم­شده برابر با 3342 عدد، که تعداد 1322 معادل 56/39 درصد روی ژنوم B، 1253 معادل 49/37 درصد روی ژنوم A و 767 معادل 95/22 درصد روی ژنوم D شناسائی شد (شکل 3). این یافته ها با نتایج قبلی مشابه بود (;  ؛ Berkman et al., 2013; Lai et al., 2015; Alipour et al., 2017). همچنین تعداد نشانگر SNP در ژنوم A و B حدود 4/3 برابر ژنوم D بود که با یافته Alipour et al.  (2017) مطابقت داشت، اما با نتایج تحقیق  Cavanagh et al. (2013) وAllen et al.  (2013) که بیش از پنج برابر گزارش نموده­­اند، تفاوت داشت.

شکل 2- میانگین نمره کیفیت فرد کتابخانه.

Figure2. The average of Pherd's score of the pooling.

جدول 1- تعداد خوانش‌های قرائت شده

Table 1. The number of reads calling

بر اساس تاریخچه تکاملی گندم، ژنوم D پس از سال­های طولانی به ژنوم گندم نان اضافه شده است و بنابراین میزان موتاسیون، مضاعف­شدن ژن و چند شکلی در ژنوم­های قدیمی یعنی A و B  که در اولین رویداد هیبریداسیون حدود نیم الی 3 میلیون سال پیش بین گونه­های اجدادی دیپلوئید حاصل شده بود، بیشتر است (Alipour et al., 2017). پراکنش توزیع ژنجای SNPها در روی کرموزوم ژنوم­ها یکنواخت نبود. بیشترین SNP روی کروموزوم دوم از ژنوم B (2B) و  سوم از ژنوم B (3B) و کمترین آن روی کروموزوم چهارم از ژنوم D (4D) شناسائی شد (شکل 4). این دستاورد با یافته‌های Alipour et al.  (2017) و  Edae et al. (2015) مشابه بود. بنابراین منطقی است که با افزایش اندازه کروموزوم و توالی­ بازهای نوکلئوتیدی روی آن، احتمال موتاسیون و تولید SNP جدید، روی دو ژنوم A و B زیاد شود.

جدول 2-  مقایسه و پراکنش نشانگر SNP تولید شده بر اساس داده‌های گم شده 20، 30، 40 و 50 درصد در سطح ژنوم و کروموزوم

Table 2. The SNP markers Comparison and distribution based on 20, 30, 40, and 50% missing data on genome and chromosome

شکل 3- میزان پراکنش SNP در  ژنوم های A، B و D در 50 درصد داده گم شده.

Figure3. The SNP markers distribution on A, B and D genomes in 50% missing data.

شکل 4. میزان پراکنش SNP بر روی هر یک از کروموزوم‌های همیولوگ

Figure 4. The SNP markers distribution on homoeologue chromosomes.

بیشترین چگالی نشانگری روی کروموزوم­های دوم و پنجم ژنوم B (2B و 5B) و کمترین روی کروموزوم چهارم از ژنوم D (4D) مشاهده شد. همچنین این چگالی در ژنوم B بسیار بیشتر از ژنوم D بود (جدول 3). برونداد این تحقیق با نتایج Alipour et al.  (2017) همسان بود. با حذف تاثیر اندازه کروموزوم بر تعداد SNP، در حقیقت علاوه بر اندازه کروموزوم، عوامل دیگری مانند طول دوره تکامل نیز در تعدادSNP  روی کروموزوم‌ها دخالت دارند. رابطه خطی بسیار معنی­دار بین چگالی (تراکم) نشانگری و اندازه کروموزوم در سه ژنوم مشاهد شد (شکل 5). این به این معناست که با افزایش اندازه و تراکم نشانگری، تعداد نشانگر SNP افزایش می­یابد که این مشاهدات با اطلاعات
 Alipour et al.  (2017) یکسان بود.

جدول  3- میزان چگالی نشانگری (SNP/Mbp) روی هر ژنوم و کروموزوم با داده‌های 50 درصد گم شده

Table 3. Marker density (SNP / Mbp) on each genome and chromosome with 50% missing data

شکل 5- رابطه خطی بین میزان چگالی (SNP/Mbp) و اندازه کروموزوم هر یک از ژنوم‌های A، B و D

Graph 5. The linear regression between marker density (SNP/Mbp) and chromosome size in each of A, B, and D wheat genomes.

تجزیه به مولفه­های اصلی نشان داد که بر حسب تعداد و رنگ­های متفاوت، پنج گروه مختلف بر اساس شش مولفه اول (PC1-PC6) قابل شناسائی است که سهم هر مولفه از تغییرات واریانس کل در اسکری پلات به صورت هیستوگرام نمایان است. بر اساس این یافته، پنج زیر جمعیت به‌صورت SP1 (n=2)، SP2 (n=9)، SP3 (n=8)، SP4 (n=16) و SP5 (n=15) قابل شناسائی بود (شکل6). این برونداد مطابق با یافته­های Voss-Fels و همکاران (2015) که از 460 ژنوتیپ و آرایه K90 نشانگر SNP برای گروه­بندی جمعیت استفاده کردند، بود.

علاوه بر آن، نمودار هیت­مپ همزمان بر اساس ماتریس فاصله ژنتیکی نشانگر  SNP و گروه بندی لاین/رقم صورت گرفت که ارتباطی قوی بین ژنوتیپ­ها برای هر کلاستر جداگانه آشکار کرد، اما تمایز شدید برای گروه­بندی منفرد و متمایز نشان نداد (شکل7). این دستاورد با یافته Wang et al.  (2017)  مطابقت داشت. گروه بندی بر اساس تجزیه مولفه­های اصلی و ماتریس تشابه بر اساس نشانگر ژنومیک یعنی SNP، صحت تفکیک زیر جمعیت را تایید می­کنند، اما همان‌طور که ملاحضه می­شود، با مقایسه گروه بندی بر اساس تجزیه به مولفه­ها و ماتریس شباهت ژنومی، جمعیت به سه گروه اصلی قابل تفکیک است.

شکل 6- گروه‌بندی جامعه پیشرفته اصلاحی بر اساس نشانگر SNP.

Figure 6. The advanced breeding population classification based on SNP markers.

شکل 7- توپولوژی حاصل از ماتریس شباهت بر اساس نشانگر SNP و گروه‌بندی لاین­ها.

Figure 7. Topology derived from a similarity matrix based on the SNP markers and lines grouping.

نتیجه گیری کلی

متوسط نمره کیفیت فرد برابر با 30 بود که نشان دهنده مناسب بودن استفاده از فن آوری NGS با پلاتفرم Illumina®برای توالی­یابی گندم است. تعداد خوانش‌های تولید شده در روش ddRAD-Seq به ازای هر لاین برابر با 2207480 بود که 8/1 برابر روش GBS که توسط  Alipour et al. (2017) در جمعیت بسیار بزرگ گندم و هشت بار توالی­یابی بود. بیشترین SNP قرائت شده برای داده­های 50 درصد گم­شده به‌دست آمد. تعداد کل SNP های صحیح فراخونی شده برای 50 درصد داده گم­شده برابر با 3342 عدد SNP بود که بیشترین آن در ژنوم B شناسائی شد. هم میزان پراکنش و هم تراکم SNP به ازای هر کروموزوم در ژنوم متفاوت بود. بین چگالی و اندازه کروموزوم رابطه خطی معنی­دار مشاهده شد. تجزیه به مولفه­های اصلی و ماتریس تشابه و گروه­بندی همزمان با استفاده از اطلاعات نشانگر SNP، قادر به شناسائی زیر جمعیت­ها از یک جمعیت اصلی شد، اما ساختار جمعیت بسیار ضعیف بود و بنابراین تاثیری در برآورد ارزش­های اصلاحی ژنومی (GS) از طریق برازش مدل­ها و انتخاب بهترین لاین و مطالعات ارتباط نشانگر به صفت (MTA) و استفاده در MAS در برنامه­های به­نژادی برای این جمعیت ندارد.