فلورفنیکل یکی از ترکیبات ضد باکتری کاربردی در زمینه دامپزشکی است که دارای طیف اثر گسترده بوده و در درمان بیماری‎ تنفسی گاوی، خوکی و همچنین عفونت­های مزمن تنفسی و گوارشی در طیور کاربرد دارد (28). برای نخستین بار در آبزی­پروری، برای درمان و جلوگیری از گسترش عوارض بیماری­های ناشی از Vibrio anguillarum، Edwardsiella tarda وPhotobacterium damselae piscicidaاستفاده شد و مشخص گردید که کارایی بهتری نسبت به کلرامفنیکل دارد (10). همچنین در درمان فرونکولوزیس در آزاد ماهی اقیانوس اطلس به صورت خوراکی بکار گرفته شده و تجویز مقدار 10 میلی­گرم بر کیلوگرم در روز و درمان به مدت 10 روز سبب کاهش تلفات و بهبود علائم درمانگاهی گردید (14). این دارو سبب کنترل تلفات ناشی از سندرم بچه­ماهی نورس قزل­آلای رنگین کمان (RTFS) و بیماری باکتریایی آب­های سرد شده است (6،23). حتی برخی پاتوژن­های درون سلولی نظیر Piscirickettsia salmonis که قادر به ایجاد بیماری و عفونت در آزاد ماهیان هستند نیز، در آزمایشگاه و در مزرعه به فلورفنیکل پاسخ می­دهند (39). هم اکنون، فلورفنیکل خوراکی با برند تجاری Aquaflor^® و در دامنه دوزاژ مصرفی تشریح شده در دستورالعمل سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) برای درمان بیماری‌های باکتریایی در ماهیان گرمابی نظیر سپتی سمی ادواردزیلایی و کولومناریس و همچنین کنترل مرگ و میر ناشی از فرونکولوزیس و بیماری باکتریایی کلیه در ماهیان سردابی پرورشی مورد تأیید این سازمان است (8،28).

این آنتی بیوتیک دارای خاصیت باکتریواستات وابسته به دوز بوده و با پیوستن به زیرواحد S50 ریبوزوم­های باکتری­های حساس موجب مهار آنزیم پپتیدیل ترانسفراز گشته، در نتیجه باعث توقف انتقال اسید آمینه­ به زنجیره­های پپتیدی در حال شکل­گیری می­گردد. بنابراین جزء گروه آنتی بیوتیک­های مهارکننده سنتز پروتئین به شمار می­رود (31). با توجه به اینکه، اثرات دارو به طور مستقیم به غلظت آن در محل ایجاد عفونت بستگی دارد و با توجه به نفوذ قابل قبول این آنتی بیوتیک به بافت­های هدف و در نتیجه رسیدن به دوز اثر گذار این دارو در محل آسیب به‌وسیله گردش خون، عملکرد بسیار مناسبی دارد (38). ماهیت شیمیایی دارو به صورت محلول در چربی و دارای pH اسیدی است. زیست فراهمی آن نظیر کلرامفنیکل بسیار بالا و معادل 5/96 درصد تعیین شده است. بنابراین برای رسیدن به اهداف بالینی، انتشار دارو رضایت بخش بوده و با توجه به حجم انتشار قابل توجه، مقدار بافتی آن با مقدار پلاسمایی­اش برابر است. نیمه عمر حذفی برابر با 2/12 ساعت حاکی از این است که نیاز به تجویز روزانه دارد (7،36). با توجه به اینکه فلورفنیکل و تیامفنیکل در مقایسه با آنالوگ بنیادین خود به نام کلرامفنیکل، در ساختمان ملکولی به جای نیترو (NO₂) دارای متیل سولفانات (SO₂-CH₃) هستند، این برتری را دارند که خطراتی مانند نارسایی مغز استخوان (Myelosuppresion) و آنمی آپلاستیک در انسان ناشی از باقیمانده دارویی را ایجاد نکنند. مورد اخیر به عنوان جدی­ترین عارضه مصرف کلرامفنیکل مطرح بوده و ضمن نادر بودن رخداد آن، با توقف مصرف دارو کاملاً برگشت پذیر است (7،18). گفته شده که این آنتی بیوتیک دارای اثر ضد میکروبی نیرومندی بوده و فاقد مهارکنندگی تولید یاخته­های خونی برخلاف همتایان خود است (38).

با اینکه دلایل زیادی برای مصرف کلینیکی فلورفنیکل وجود دارد، تاکنون اثرات سرکوب­گر/ القایی آن بر یاخته­های سلولی در خون پستانداران (12،21)، طیور (13،15) و ماهیان (22،26) گزارش شده است. برای نمونه درصد تیموسیت­های CD4^{- و} CD8^- و تعداد مطلق CD4⁺و CD8⁺ خون موش در پی مصرف فلورفنیکل طی 7 روز مصرف خوراکی این آنتی بیوتیک افزایش و همچنین درصد لنفوسیت‌های B کاهش یافتند (21). به نظر می­رسد سطح سرکوب شدگی فراسنجه­های ایمنی سلولی در موش­های آزمایشگاهی وابسته به دوز مصرفی این آنتی بیوتیک باشد (12). علی رغم اینکه فلورفنیکل اثرات مثبتی بر پاسخ­های سلولی ایمنی طیور از خود نشان داده است (15). در خصوص مدیریت بهداشتی بیماری­های عفونی در آبزی پروری، آنتی بیوتیک­های مصرفی می­توانند سبب نوتروپنی و حذف آلبومین در خون ماهیان شوند (22). در تیلاپیای تحت درمان با فلورفنیکل نسبت به گروه کنترل، کاهش معنی­دار مقدار هموگلوبین، درصد هماتوکریت، تعداد گلبول­های قرمز و همچنین لوکوسیتوز (نوتروفیلی) به وجود آمده است (4). سطوح کاهش یافته فعالیت فاگوسیتوزی در این گونه ماهی تحت درمان با همین آنتی بیوتیک مشاهده شد، که البته معنی­دار نبوده است (26). با توجه به اطلاعات ناقص و ناسازگار تحقیقات پیشین، بر آن شدیم تا اطلاعات کامل­تری را در مورد درصد هماتوکریت، هموگلوبین، فراوانی یاخته­های خونی به همراه شمارش افتراقی گویچه­های سفید ماهیان قزل­آلای رنگین کمان تحت چالش عفونی با باکتری­های Streptococcus iniae وLactococcus garvieae تحت دوره درمانی 10 روزه با دوز 15 میلی­گرم فلورفنیکل خوراکی بر کیلوگرم (وزن بدن) ارائه دهیم.

مواد و روش­ کار

 ماهیان و شرایط سازگاری: تعداد 300 قطعه قزل­آلای رنگین کمان با میانگین وزن 5/7 ± 55 گرم از مزارع پرورشی در استان فارس (شهرستان سپیدان) خریداری شده و در تانک­های ونیرو 500 لیتری موجود در بخش بهداشت و بیماری­های آبزیان دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز برای 2 هفته دوره سازگاری نگهداری شدند. تعویض آب روزانه در طی این دوره به مقدار 20 درصد حجم هر تانک صورت می‌گرفت و هوا دهی از طریق یک هواده مرکزی انجام می­شد. خوراک‌دهی با پلت­های تجاری شرکتی بایومار (دانمارک) دو بار در روز و به مقدار 2 درصد وزن بدن آن‌ها بوده است. منبع آب یک حلقه چاه با دبی 3-1 لیتر در ثانیه بوده که سختی کل آن معادل 55/344 میلی‌گرم کربنات کلیسم در لیتر سنجیده شد. به علاوه، دمای آب و اکسیژن محلول در طول دوره آزمایش به ترتیب بر روی مقادیر (5/0±)5/16 درجه سانتی­گراد و 57/5 میلی­گرم بر لیتر تنظیم شدند.

طرح آزمایشی: آزمایش در یک بلوک کاملاً تصادفی طراحی شده و دارای 6 تیمار (با 3 تکرار) به شرح: 1) بدون چالش عفونی/ بدون دارودرمانی (C-/T-)، 2) بدون چالش عفونی/ تحت دارودرمانی (C-/T+)، 3) چالش داده شده با L. garvieae/ بدون دارودرمانی (L. g C+/T-)، 4) چالش داده شده با S. iniae/ بدون دارودرمانی (S. i C+/T-)، 5) چالش داده شده با L. garvieae/ تحت دارودرمانی     (L. g C+/T+)، 6) چالش داده شده با S. iniae/ تحت دارودرمانی (S. i C+/T+) بودند. چالش عفونی از طریق تزریق صفاقی (IP) نسبتی از دوز­های LD50 پاتوژن­ها به صورت جداگانه که پیش­تر توسط یک پایلوت مشخص شده بود، صورت گرفت. دوره درمانی در گروه­های چالش داده شده، با استفاده از خوراک آغشته به فلورفنیکل (به مقدار 5/2 درصد وزن بدن و یک بار در روز) با نام تجاری آکوافلور (Aquaflor^® 50%, Rooyan Darou, Iran) صورت گرفت. دوز مصرفی 15 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن برای 10 روز متوالی تعیین شد که در دامنه مجاز FDA قرار دارد (9).

پاتوژن­ها و تعیین LD50: دوزهای مورد استفاده در چالش عفونی از طریق تعیین میانه دوز کشنده (LD50) باکتری­ها بدست آمدند. بدین منظور، از منبع باکتری­های S. iniae و L. garvieae که پیش­تر از ماهیان پرورشی بیمار ارسال شده به بخش بهداشت و بیماری­های آبزیان دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز جداسازی و شناسایی شده بودند (2،29) برداشت شده و در محیط BHA به مدت 48 ساعت در دمای 25 درجه سانتی­گراد کشت داده شدند و سپس باکتری­های رقیق شده در محلول PBS استریل، از طریق لام نئوبار (هموسایتومتر) زیر میکروسکوپ نوری (40×) شمرده شدند و رقت­های متوالی از 10²الی 10⁹ واحد تشکیل پرگنه بر میلی­لیتر تهیه گردید (2). تلقیح ماهیان از طریق تزریق صفاقی به حجم 200 میکرولیتر از رقت‌های مختلف باکتری­ها و 200 میکرولیتر PBS استریل (گروه شاهد) و بعد از اعمال بیهوشی به روش غوطه وری، با استفاده از غلظت 30 قسمت در میلیون تریکائین متان سولفونات (MS-222) انجام شد. در طی دوره آزمایش پایلوت میزان تلفات ماهیان در 4 روز متوالی ثبت شدند و محاسبه LD50 هر یک از پاتوژن­ها از طریق رگرسیون پروبیت انجام شد. بر اساس نتایج این پایلوت، دوزهای تزریقی مناسب پاتوژن­ها در آزمایش اصلی برای گروه­های چالش داده شده با باکتری­های لاکتوکوکوس گارویه (L. g C+) و استرپتوکوکوس اینیایی (S. i C+) معادل 30 درصد میزان LD50 96 ساعته به ترتیب 10⁵×8/6 و 10⁷×87/2 واحد تشکیل پرگنه بر میلی­لیتر در نظر گرفته شدند. همچنین زمان آغاز دوره درمانی، در پی مشاهده علائم بالینی و همچنین تشخیص باکتری از کلیه ماهیان چالش داده شده، در پایان روز سوم برای تیمارهای C+/T+ مقرر گردید.

نمونه­برداری: پس از پایان دوره آزمایش، ماهیان با استفاده از دوز 100 قسمت در میلیون از ماده MS-222 بیهوش شده و خون‌گیری با استفاده از سرنگ­های 2 میلی­لیتر از سیاهرگ ساقه دمی آن‌ها انجام شد. بخشی از نمونه خونی توسط لوله­های مویینه برداشت شده که با استفاده از خمیر هماتوکریت (Labteron) ته لوله­ها بسته شد و بلافاصله برای اندازه گیری هماتوکریت بکار رفتند. بخش عمده نمونه خونی در تیوب­های محتوی EDTA ریخته شده و برای اندازه‌گیری سایر شاخص­های خونی مورد استفاده قرار گرفت.

سنجش شاخص­های خونی: به‌منظور اندازه­گیری میزان هماتوکریت (PVC) ﻟﻮﻟﻪﻫـﺎی ﻣﻮﻳﻴﻨـﻪ ﻣﺤﺘـﻮی خون به مدت 10 دقیقه در 4000 گرم (30) با ﻣﻴﻜﺮوﻫﻤﺎﺗﻮﻛﺮیت ﺳﺎﻧﺘﺮﻳﻔﻴﻮژ ﺷﺪﻧﺪ، سپس این شاخص ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از صفحه مدرج اﻧـﺪازه ﮔﻴـﺮی گردیده و به صورت درصد بیان گردید (19). اندازه گیری هموگلوبین به روش Cyanmethemoglobin (5) و با استفاده از یک کیت تجاری (پارس آزمون، ایران) انجام شد. به طور خلاصه، مقدار 20 میکرولیتر خون دارای ضد انعقاد با 50 میلی­لیتر محلول درابکین مخلوط شده و به مدت 10 دقیقه در شرایطی که از برخورد نور محافظت می­شد، قرار داده شد. در نهایت مقادیر تراکم نوری (OD) در طول موج 540 نانومتر با استفاده از یک دستگاه اسپکتروفتومتر UV/VIS (مدل 704، شرکت Hitachi، ساخت ژاپن) خوانده شد. شمارش یاخته­های خونی پس از تهیه گسترش خونی با بکارگیری روش هماتوسایتومتر نئوبار بر مبنای روش استاندارد آسیب شناسی درمانگاهی (34) انجام شد. سایر شاخص­های گویچه­های سرخ نظیر هموگلوبین متوسط آن‌ها (MCH)، حجم متوسط گلبولی (MCV) و غلظت متوسط هموگلوبین (MCHC) نیز بر اساس معادلات ارائه شده توسط Grant در سال 2015 بدست آمدند (11):

(معادله 1) MCH (pg) = [Hb/RBC (per million)] × 10

(معادله 2)  MCV (fl) = [PVC/ RBC (per million)] × 10

(معادله 3)  MCHC (%) = (MCH/MCV) × 100

آنالیز آماری داده­ها: جهت آنالیز آماری نتایج بدست آمده از سنجش پارامترهای هماتولوژیک ماهی قزل آلای رنگین کمان در پی عفونت تجربی و دارودرمانی، از نرم افزار SPSS (نسخه 20) بهره گرفته شد. برای پی بردن به وجود اختلاف آماری بین گروه­های آزمایشی از تجزیه واریانس استفاده شده و برای یافتن تفاوت­های موجود بین میانگین­های هر یک از پارامترهای خونی در تیمار­ها، تست تعقیبی دانکن بکار گرفته شد.

نتایج

نتایج بدست آمده از این مطالعه نشان داد که درصد هماتوکریت و میزان هموگلوبین خون ماهیان در گروه­های دریافت کننده دارو نسبت به گروه شاهد به طور معنی­داری کاهش یافته است (05/0P<). از سوی دیگر، هیچ تفاوت آماری بین گروه­های چالش­داده شده با پاتوژن­های مختلف وجود نداشت (05/0P>). از نظر تعداد گویچه­های سرخ مشاهده شده، مصرف خوراکی فلورفنیکل سبب شده تا میزان این شاخص نسبت به کنترل به طور معنی­داری کمتر باشد. عفونت ناشی از عوامل استرپتوکوکوسی و لاکتوکوکوسی نیز سبب کاهش معنی­دار تعداد این گویچه­ها شده و یک اثر هم افزایی نیز در اثر مصرف دارو در ماهیان تحت چالش عفونی دیده شد (05/0P<). این در حالی است که نتایج مربوط به نسبت­های مبتنی بر گویچه­های سرخ حاکی از این بودند که شاخص­های MCH و MCV در گروه­های مصرف‌کننده آنتی بیوتیک به طور معنی­داری نسبت به سایر گروه­ها افزایش یافته است (05/0P<). در مورد شاخص MCHC هیچ تفاوت آماری بین گروه­های مختلف آزمایشی مشاهده نگردید (05/0P>) (جدول 1).

یافته­های مربوط به شمارش کلی و افتراقی گویچه­های سفید نشانگر این بود که تعداد کل این گویچه­ها به ازای یک میلی­لیتر خون جانوران آزمایشی تحت چالش عفونی افزایش یافته است (05/0P<). اثر سرکوبی آنتی بیوتیک در تولید یاخته­های ایمنی در مقایسه آماری گروه­های بیمار شده تجربی که دارودرمانی شدند با آن‌هایی که فلورفنیکل دریافت نکردند، قابل مشاهده است (05/0P<)، ولی در تیمارهای ماهیان سالم تفاوتی بین دریافت‌کنندگان دارو با شاهد وجود نداشت (05/0P>). از منظر شمارش افتراقی این یاخته­ها، این نکته قابل دریافت است که مصرف روزانه فلورفنیکل به مدت 10 روز متوالی در دوز اشاره شده، توانسته سبب کاهش معنی­دار تعداد لنفوسیت­های خون شود (05/0P<). بررسی یاخته­های نارس آن‌ها (لنفوبلاست­ها) سبب تائید این فرضیه شده است. از سوی دیگر به نظر می­رسد که تعداد مونوسیت‌ها، نوتروفیل­ها و سایر یاخته­های مربوط به ایمنی ذاتی در پی دریافت دوزاژ دارویی به طور معنی­داری افزایش یافتند (05/0P<) (جدول 2).