بیماری آبله پرندگان، یک بیماری ویروسی شایع در گونه‌های مختلف پرندگان اهلی و وحشی می‌باشد به طوری که 232 گونه از 23 شاخه پرندگان شناخته‌شده در جهان تا به امروز به صورت طبیعی به این ویروس مبتلا شده‌اند (2). ویروس آبله پرندگان تنها جنسی از ویروس خانواده آبله است که گونه‌ای غیر از پستانداران را مبتلا می‌کند. بیماری آبله پرندگان به دو فرم اصلی بروز می‌کند، فرم جلدی و فرم دیفتریک. فرم جلدی سبب ضایعات جلدی بر روی پوست و نقاط بدون پر بدن مانند منقار، پلک‌ها، گوشه چشم و پاها می‌شود و فرم دیفتریک آن نیز با ضایعاتی در غشاهای موکوسی بدن مانند دهان، حلق، مری و نای همراه است. همچنین هر دو فرم جلدی و دیفتریک ممکن است در یک پرنده رخ دهد. فرم سیستمیک بیماری نیز در قناری‌ها به دلیل آسیب‌های شدید ریوی با تلفات بالا رخ می‌دهد (21). بیماری آبله در طیور صنعتی موجب خسارات اقتصادی زیادی مانند کاهش رشد و وزن‌گیری، کاهش تولید تخم مرغ، کوری و افزایش مرگ و میر می‌شود. واکسیناسیون با واکسن‌های زنده از دیرباز برای کنترل بیماری و کاهش خسارات ناشی از بیماری به کار رفته است اما در سال‌های اخیر گزارش‌های متعددی از درگیری مجدد گله‌های واکسینه‌شده با بیماری آبله ارائه شده است (5).

عامل ویروسی بیماری آبله می‌تواند با تماس مستقیم و یا تماس غیرمستقیم از طریق حاملانی مانند جرب و مگس نیز انتقال یابد (16). جرب قرمز طیور، درمانیسوس گالینه یک خطر جدی برای طیور تخم‌گذار در بسیاری از نقاط جهان از جمله ایالات متحده آمریکا، اروپا، ژاپن و چین محسوب می‌شود. ضررهای اقتصادی ناشی از کاهش تولید و کنترل این جرب در صنعت تخم مرغ اتحادیه اروپا سالانه حدود 130 میلیون یورو تخمین زده شده است و این رقم در بسیاری از نقاط جهان نیز بیش از این برآورد می‌شود (19). در سال‌های اخیر مطالعاتی در خصوص بیماری آبله پرندگان در ایران و شیوع و خسارات اقتصادی ناشی از جرب قرمز طیور در فارم‌های تخم‌گذار ایران و طیور بومی صورت گرفته است. به طوری که ادعا شده است بیش از 80 درصد فارم‌های تخم‌گذار ایران به این جرب آلوده هستند (17،20). در خصوص طیور بومی،Gholami Ahangaran و همکاران در سال 2014، تعداد 328 قطعه مرغ بومی در نواحی غرب ایران که علائم آبله (شامل ضایعات جلدی و مخاطی) را نشان می‌دادند بررسی نمودند و 1/66 و 7/80 درصد از موارد مشکوک به آبله را به ترتیب با روش هیستوپاتولوژی و PCR مثبت گزارش کردند و همچنین PCR را به عنوان روش مناسبی برای تشخیص آبله پرندگان مورد تأیید قرار دادند (6). Norouzian و همکاران در سال 2017، نیز همه‌گیری آبله پرندگان در مرغان بومی حومه خرم‌آباد با میزان ابتلای 50 درصد و تلفات 5 تا 20 درصد را مورد بررسی آسیب‌شناسی و مولکولی قرار دادند (14).

آلودگی با جرب درمانیسوس گالینه می‌تواند منجر به استرس شدید مرغان تخم‌گذار، مشکلات پوستی شدید و به دنبال آن موجب کاهش وزن پرنده و کاهش کمی و کیفی تولید تخم مرغ در پرندگان شود. علاوه بر این درمانیسوس گالینه به عنوان ناقل و مخزن چندین عامل بیماریزای باکتریایی و ویروسی مطرح است و می‌تواند موجب انتقال بسیاری از عوامل بیماریزا شود (1).

مطالعه حاضر با هدف تعیین هویت دو جدایه ویروس آبله بدست آمده از نمونه‌ی بافتی دارای جراحات تیپیک آبله مرغان و از نمونه جرب درمانیسوس گالینه از همان گله آلوده به آبله صورت گرفت.

مواد و روش‌کار

نمونه برداری: ضایعات پوستی و ندول­های روی پوست سه قطعه مرغ تخم‌گذار تلف شده از بیماری با علائم کالبدگشایی آبله مرغان و حدود 50 جرب موجود در فارم نمونه­برداری شدند. نمونه­ها از یک گله تخم‌گذار تجاری 60 هفته نژاد LSL در اطراف تهران با تلفات روزانه 30 الی 50 قطعه در روز و مشکوک به بیماری آبله مرغان تهیه شدند. گله مذکور علیه بیماری آبله واکسینه شده بود ولی نشانه­های ضایعات جلدی مشابه آبله به صورت ندول­های پرولیفراتیو پوستی در تمام سطح بدن مرغان مشاهده شد. از دیگر نکات قابل توجه آلودگی شدید این گله به جرب درمانیسوس گالینه بود.

تلقیح لایه کوریوآلانتوئیک و جداسازی ویروس: هر نمونه بافتی و هر نمونه جرب جداگانه بعد از هموژنیزه شدن توسط PBS شامل پنیسیلین (50 واحد در میلی لیتر) و استرپتومایسین (50 میکروگرم در میلی لیتر) در دور 4000 در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس 200 میکرولیتر از مایع رویی هر نمونه داخل لایه کوریوآلانتوئیک تخم مرغ­های جنین دار 11-9 روزه تلقیح شد. تخم مرغ­ها به مدت 7-5 روز در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شدند و سپس برای دیدن ضایعات Pock مورد بررسی قرار گرفتند (11،12).

استخراج DNA: برای استخراجDNA ویروس از کیت شرکت MBST ایران (Rapid Genomic DNA Isolation Kit) و بر اساس پروتکل شرکت سازنده استفاده شد. هر نمونه با PBS مخلوط و هموژنیزه  و به مدت 15 دقیقه با دور 3000 در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس مقدار 200 میکرولیتر از مایع رویی با 20 میکرولیتر پروتئیناز K و 200 میکرولیتر بافر لیزه­کننده مخلوط شد و به میزان 10 دقیقه در دمای 55 درجه سانتی‌گراد و سپس 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شدند. بعد به محلول فوق 360 میکرولیتر بافر متصل شونده و 270 میکرولیتر اتانول اضافه شد. محلول حاصل به Spin column اضافه گردید و در دور 8000 به مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس500 میکرولیتر بافر شستشودهنده به Spin column اضافه شد و مجدداً طبق دستور قبلی سانتریفیوژ شد. در پایان DNA ویروس با اضافه­نمودن70 میکرولیتر Elution buffer و گرم‌خانه‌گذاری به مدت 3 دقیقه و سانتریفیوژ با دور 8000 به مدت 1 دقیقه استخراج شد.

واکنش Polymerase Chain Reaction (PCR): واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر با استفاده از یک جفت پرایمر با توالی Forward: 5’-CAGCAGGTGCTAAACAACAA-3’  وReverse: 5’-CGGTAGCTTAACGCCGAATA-3’ برای تکثیر قطعه‌ای از ژن 4b به اندازه 578 جفت باز انجام شد (9). مخلوط واکنش PCR برای هر نمونه بدین ترتیب تهیه شد: 5/2 میکرولیتر از بافر PCRbuffer 10x، 5/0 میکرولیتر از مخلوط 10mM dNTPs، 25/1 میکرولیتر از هر پرایمر (10 میکرولیتر در پیکومول)، 75/0 میکرولیتر از 50mMMgCl₂، 25/0 میکرولیتر از آنزیم TaqDNA polymerase (U/ml5)، و 5/2 میکرولیتر از DNA استخراج­شده از نمونه مربوطه و سپس 16 میکرولیتر آب دیونیزه استریل تا حجم 25 میکرولیتر اضافه گردید. در کلیه واکنش­ها، برای کنترل مثبت از واکسن آبله موسسه سرم و واکسن­سازی رازی و برای کنترل منفی از آب دیونیزه به جای DNA الگو استفاده شد. میکروتیوب‌ها در دستگاه ترموسایکلر (Labcycler 48, SensoQuest, Goettingen, Germany) قرار داده شدند و برنامه تکثیر بر اساس جداسازی اولیه به مدت 2 دقیقه در 94 درجه سانتی‌گراد؛ و سپس 35 سیکل شامل جداسازی به مدت 1 دقیقه در 94 درجه سانتی‌گراد، اتصال به مدت یک دقیقه در 60  درجه سانتی‌گراد ، گسترش یا طویل شدن به مدت 1 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد و در خاتمه مرحله طویل شدن نهایی به مدت 2 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد تنظیم شد (15). محصولات PCR برای شناسایی قطعه 578 جفت باز ژن 4b برروی ژل آگارز 1 درصد با ولتاژ 70 به مدت یک ساعت الکتروفورز شدند. پس از اتمام الکتروفورز، ژل با ترکیبDNA Safe Stain  (سیناکلون، تهران، ایران) رنگ‌آمیزی شدند. درانتها ژل با دستگاه ترانس ‌ایلومیناتور با نور UV مورد بررسی قرار گرفت و عکس‌برداری انجام شد. از مارکر تجاری Gene Ruler 100bp DNA Ladder Plus ساخت شرکت Fermentas به عنوان استاندارد وزن ملکولی نیز در هر ژل استفاده شد. تعیین وزن مولکولی باندهای مشاهده شده با استفاده از نرم افزار (ver. 3.5, Kansas State University, US) SEQAID II انجام شد. کلیه مواد مصرفی واکنش PCR از شرکت سیناکلون تهیه شدند.

تعیین توالی و آنالیز فیلوژنتیک: فرآورده PCR با وزن 578 جفت باز ژن 4b مربوط به دو جدایه یکی از نمونه بافتی جراحات تیپیک آبله مرغان و دیگری از نمونه جرب با استفاده از کیت تجاریAccuPrep^® DNA Gel Purification Kit   شرکت Bioneer کره جنوبی خالص­سازی شدند و برای تعیین توالی از دو جهت به شیوه اتوماتیک و با استفاده از پرایمر‌های مشابه واکنش PCR به  شرکت Bioneer ارسال شدند. هم‌ردیف‌سازی توالی‌های حاصل به کمک نرم افزارهای مربوطه در کنار توالی‌های انتخاب شده از بانک ژن از جمله توالی‌های مربوط به ویروس­های آبله موجود در بانک ژن انجام گرفت. درخت‌های شجره‌شناسی بر اساس توالی‌های نوکلئوتیدی ژن 4b با استفاده از روش Neighbor joining در نرم افزار CLC Main Workbench 8 ترسیم شدند. توالی‌های مربوط به جدایه‌های تعیین هویت شده FPVIR1 و FPVIR8 در مطالعة حاضر در بانک ژن موجود هستند و شماره‌های دسترسی آن‌ها به ترتیب MG787211 و MG787218 می­باشند.

نتایج

کلیه نمونه­ها در آزمون PCR برای قطعه 578 جفت باز ژن 4b مثبت بودند، بنابراین آلودگی نمونه­ها به ویروس عامل بیماری آبله مورد تأیید قرار گرفت. همین‌طور هر دو جدایه در لایه کوریوآلانتوئیک تخم مرغ جنین­دار ضایعه پوک ایجاد کردند. درخت شجره­شناسی دو جدایه این مطالعه که یکی از نمونه بافتی جراحات تیپیک آبله مرغان و دیگری از نمونه جرب قرمز طیور بود بر اساس توالی­های نوکلئوتیدی ژن4b  با 12 جدایه دیگر ثبت شده در بانک ژنی مقایسه شدند. دو جدایه ویروس آبله با سایر جدایه­های انتخاب‌شده از بانک ژنی شباهت حدود 73 تا 100 درصد را از خود نشان دادند. هر دو جدایه مورد مطالعه با یکدیگر و با دو جدایه دیگر مرغی و یک جدایه بوقلمون 100 درصد شباهت داشتند (جدول 1). بررسی شجره­شناسی این دو جدایه و مقایسه آن‌ها با 12 جدایه دیگر از بانک ژنی هفت دسته­ی متفاوت را نشان داد. با توجه به شباهت 100 درصد سکانس نوکلئوتیدی نمونه جداشده از نمونه بافتی جراحات تیپیک آبله مرغان (FPVIR1)، نمونه جرب درمانیسوس گالینه (FPVIR8)، دو جدایه دیگر مرغی و یک جدایه بوقلمون همگی در کنار هم در یک شاخه درخت فیلوژنتیک قرار گرفتند (تصویر 1).

بحث

بیماری آبله از جمله بیماری‌های ویروسی مهم در پرندگان اهلی و وحشی می‌باشد. این بیماری در طیور صنعتی موجب خسارات اقتصادی فراوان می­شود. عامل بیماری آبله می­تواند از طریق حاملانی مانند جرب و مگس نیز انتقال یابد. در مورد نقش انگل­های خارجی در انتقال بیماری‌ها تحقیقات زیادی صورت گرفته است با این حال نقش آن‌ها در انتقال سیکل­های مختلف عوامل بیماری‌زا به درستی شناخته نشده است. جرب درمانیسوس گالینه مهم‌ترین انگل خارجی طیور محسوب می‌شود که از خون پرندگان تغذیه می‌نماید. از معایب آلودگی با جرب درمانیسوس گالینه می‌توان  به استرس شدید مرغان، مشکلات پوستی، کاهش وزن پرنده، کاهش کمی و کیفی تولید تخم مرغ در پرندگان اشاره نمود. جرب درمانیسوس گالینه علاوه بر نقش حامل بودن در انتقال عوامل بیماریزا، می­تواند میکروارگانیسم را برای مدت طولانی به صورت ناقل مکانیکی حمل کند (3،4).

روش‌های تشخیص بیماری آبله شامل هیستوپاتولوژی از طریق تکثیر سلول‌های اپیتلیال و تشکیل اجسام ائوزینوفیلی تیپ A داخل سیتوپلاسم (اجسام بولینجر)، میکروسکوپ الکترونی، جداسازی ویروس در کشت سلول و یا تزریق داخل لایه کوریوآلانتوئیک تخم مرغ‌های جنین‌دار بوده است. در سال‌های اخیر تشخیص قطعی بیماری آبله از طریق آزمایش PCR و شناسایی ژن 4b صورت گرفته است. Jarmin و همکاران در سال 2006، مطالعه شجره­شناسی ژن 4b را برای ویروس آبله پرندگان انجام دادند که بر اساس مطالعه آن‌ها، ویروس‌های آبله جدا شده از پرندگان عمدتاً در دو  Clade اصلی A و B قرار می‌گیرند. درClade A ، عمدتاً ویروس‌های آبله جدا شده از ماکیان و بوقلمون قرار دارند و این Clade خود به سه زیر دسته A1، A2، A3 تقسیم می‌شود. در حالی که Clade B عمدتاً مربوط به ویروس‌های آبله‌ای می­باشد که از قناری‌ها و خانواده گنجشک‌سانان جدا شده است. Clade B نیز به دو زیر دسته B1 و B2 تقسیم می­شود. دسته سوم Clade C نام دارد. جدایه‌های اندک داخل این دسته از خانواده طوطی‌سانان جدا شده‌اند (8).

در این مطالعه یک فارم تخم‌گذار تجاری با جراحات تیپیک جلدی و همینطور آلودگی شدید با جرب قرمز طیور (درمانیسوس گالینه) مورد نمونه­گیری قرار گرفت. نمونه­ها در آزمون PCR برای ژن 4b مثبت شده و همچنین در تلقیح به CAM تخم‌مرغ جنین‌دار نیز جراحات پوک نشان دادند. پس از تأیید اولیه بیماری آبله، دو جدایه از نمونه بافتی جراحات تیپیک آبله مرغان و نمونه جرب درمانیسوس گالینه برای سکانس و بررسی آنالیز شجره­شناسی مورد مطالعه قرار گرفتند و با سایر جدایه­های آبله موجود در بانک ژنی مقایسه شدند. سکانس این دو جدایه و مقایسه آن‌ها با سایر جدایه­های موجود در بانک ژنی، شباهت 100 درصد آن دو و قرار گرفتن این دو جدایه در یک شاخه را نشان داد. گله تخم‌گذار مورد آزمایش در این مطالعه قبل از وقوع بیماری، بر علیه بیماری آبله واکسینه شده بود. در سال­های اخیر گزارش­هایی از وقوع آبله پرندگان در فارم­های تخم‌گذار تجاری واکسینه شده علیه این بیماری گزارش شده است. در آنالیز فیلوژنتیک مشخص شد که سویه جدا شده از این گله با سویه واکسن کاملاً مطابقت داشته است (اطلاعات منتشر نشده) و لذا شاید ضعف در واکسیناسیون علت درگیری این گله با ویروس آبله پرندگان بوده است.

به دلیل اینکه ویروس آبله دارای DNA دو رشته­ای است بنابراین میزان موتاسیون در خانواده Poxviridae ناچیز می­باشد. در کاری که Luschow و همکاران در سال 2004 انجام دادند، سکانس نوکلئوتیدی ژن 4b تفاوت 72 تا 100 درصدی بین جدایه­ها از خود نشان داد که با نتایج این تحقیق هم‌خوانی دارد (11). در مطالعه‌ای که Manarolla و همکاران در سال 2010 انجام دادند از 15 نمونه مشکوک به بیماری آبله پرندگان، تمامی موارد در آزمون PCR بر روی ژن 4b مثبت شدند. سکانس جدایه­ها نشان داد که اکثر جدایه­ها در دسته­ی A (آبله ماکیان) و یا دسته B (آبله قناری) قرار داشتند (12). Literak و همکاران در سال 2010 در بررسی سکانس ژن 4b در 6 مورد از گونه­ای خاص از پرنده وحشی (Great tit) که یک مورد از نمونه­ها از اتریش، دو مورد از مجارستان و دو مورد نیز از جمهوری چک بودند، سکانس بسیار مشابهی را گزارش نمودند (10). Nakamura و همکاران در سال 2006، گزارشی از وقوع آبله جلدی در یک گله تخم‌گذار تجاری در ژاپن ارائه کردند. گله مذکور نیز واکسن علیه بیماری آبله را دریافت کرده بود. در سکانس فیلوژنی ژن 4b ویروس جدا شده از این فارم و ویروس واکسن در یک دسته قرار گرفتند. همچنین در این گزارش، آلودگی شدید فارم به جرب درمانیسوس گالینه نیز ذکر شده بود (13). مطالعات زیادی از نقش وکتوری درمانیسوس گالینه و اهمیت این جرب در انتقال عوامل بیماریزا موجود نیست. در برخی از آن­ها فقط به جداسازی آن ارگانیسم از جرب درمانیسوس گالینه موجود در فیلد اکتفا شده است. Shirinov و همکاران نیز در سال 1972 بیان داشتند که نمونه­های جرب درمانیسوس گالینه جمع­آوری شده از فارمی که مبتلا به آبله پرندگان بوده است، حامل ویروس آبله پرندگان بوده­اند (18). همین طور زمانی که جرب­ها به صورت طبیعی در آزمایشگاه نگهداری شدند ویروس تا 300 روز داخل آن‌ها زنده ماند. همچنین ویروس با گزش جرب به پرندگان سالم نیز انتقال یافت. Houng و همکاران در سال 2014، تحقیقی انجام دادند و در آن با استفاده از PCR نقش جرب درمانیسوس گالینه را در انتقال 7 عامل بیماریزا شامل ویروس آبله پرندگان، ویروس آدنو­ویروس، مارک، باکتری اریزیوپلاتریکس روزیوپاتیه، سالمونلا انتریکا، مایکوپلاسما سینویه و مایکوپلاسما گالی سپتیکوم بررسی کردند. تعداد 159 عدد جرب قرمز طیور بین سال­های 2004 تا 2012 از 142 فارم طیور در 38 منطقه جغرافیایی ژاپن مورد بررسی قرار گرفت. از مجموع 32 نمونه مثبت، 25 نمونه از آن­ها برای یک پاتوژن مثبت بوده و 7 مورد از آن­ها برای چند پاتوژن مثبت بوده­اند. همینطور 8/13 درصد از موارد برای ویروس آبله مثبت شد، 4/9 درصد برای مایکوپلاسما سینویه و 3/1 درصد نیز برای مایکوپلاسما گالی سپتیکوم مثبت شدند. بنابراین جرب درمانیسوس گالینه می­تواند در انتقال عوامل پاتوژن نقش داشته باشد (7).

نتیجه گیری: در این مطالعه، نمونه­های جرب درمانیسوس گالینه جدا شده از فارم مبتلا به بیماری آبله در تست­های تشخیصی بیماری آبله مثبت شدند. نتایج تست PCR و تلقیح داخل CAM تخم مرغ جنین­دار نشان داد که جرب درمانیسوس گالینه می­تواند به عنوان وکتوری مهم در انتقال بیماری آبله پرندگان نقش داشته باشد. طبیعت خونخوار جرب درمانیسوس گالینه عامل مهمی در انتقال عوامل پاتوژن محسوب می­شود. نتایج این تحقیق نشان می‌دهد که ریشه کنی مشکل جرب قرمز طیور در فارم­ها نه تنها مشکلاتی همچون خونخواری، کاهش تولید، کاهش رشد را مهار می‌کند بلکه می­تواند باعث کاهش انتقال بیماری­ها و عوامل پاتوژن در فارم­ها نیز شود.

سپاسگزاری

این پژوهش با استفاده از اعتبار تحقیقاتی شماره 26-6-7508007  شورای پژوهشی دانشگاه تهران انجام شد. 

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

جدول 1. درصد تشابه بین توالی اسید نوکلئیک ژن 4b ویروس آبله در دو جدایه این مطالعه با تعدادی دیگر از جدایه­ها.

تصویر 1. درخت فیلوژنی بر اساس توالی اسید نوکلئیک ژن 4b ویروس آبله در دو جدایه این مطالعه با تعدادی دیگر از جدایه ­ها.