بررسی آلودگی با ویروس تورم سرخرگی اسبان به روش الایزا در اسب‎های با سابقه یا نشانه‎های بالینی بیماری از چهار استان ایران

ویروس تورم سرخرگی اسبان، عامل ایجاد کننده بیماری تورم سرخرگی اسبان در اسب، الاغ، گورخر و قاطر است. امروزه تردیدهایی در مورد آن‌که شترسانان دنیای جدید نیز می‌توانند به این بیماری مبتلا گردند، وجود دارد. ویروس تورم سرخرگی اسبان دارای پوشش خارجی کوچکی است و RNA ویروس تک رشته‌ای سنس مثبت، متعلق به جنس آرتری ویروس از خانواده‌ آرتری ویریده و راسته‌ نیدوویرالس است (5).

امروزه حرفه پرورش و نگهداری اسب درایران به شکل روز افزون درحال پیشرفت است و افزایش رخداد بیماری‌های مختلف اسب‌ها دراین بخش دور از انتظار نیست. تورم سرخرگی اسبان یک بیماری نسبتاً جدید در گونه اسب در جهان است که توجهات بسیاری را به جهت اختلال در حمل و نقل و صادرات اسبان، به سوی خود جلب کرده است تا حدی که آزمایش­های سرولوژی این ویروس به بخش جدایی ناپذیری از صدور مجوز کشش سیلمی‌ها و نیز قراردادهای خرید و فروش اسبان تبدیل شده است (5).

ضرر اقتصادی این بیماری شامل سقط، هزینه­های درمان و پیشگیری از بیماری­های تنفسی، اختلال در تولیدمثل سیلمی‌ها و نیز هزینه‌های قرنطینه‌، کنترل و پیشگیری می‌باشد. اگرچه حدت بیماری می‌تواند زیاد باشد اما میزان مرگ و میر ناشی از آن پایین است. در صورت ابتلای اسبان مسابقه، ضررهای اقتصادی شامل استراحت اسبان بیمار برای کسب آمادگی مجدد برای مسابقه و قرنطینه اسبان پیش از حمل و نقل می‌باشد. از ضرر‌های اقتصادی دیگر می­توان به هزینه واکسیناسیون مادیان­هایی که قرار است با سیلمی حامل جفت‌گیری کنند و نیز محدودیت‌های جابه­جایی، خرید و فروش، صادرات مادیان­ها، کره­اسبان و سیلمی­های احتمالاً حامل و سرم مثبت (حتی به علت واکسیناسیون)، اشاره نمود. این محدودیت­ها شامل صادرات سیلمی­های حامل و منی آنان نیز می‌باشد (5). بیماریزایی این ویروس هنوز دقیقا شناسایی نشده است ولی شامل عفونت­زایی در لنفوسیت‌های CD3+و آسیب عروقی می­باشد. سویه بسیار وحشی بوسایروس(bucyrus) به دنبال آسیب گسترده عروقی سبب مرگ دام می­گردد (5).

از جنبه‌های مهم در اپیدمیولوژی تورم سرخرگی اسبان وجود حالت آلودگی دائمی در سیلمی­هایی است که پس از بلوغ بیمار می‌شوند و دفع متناوب ویروس از منی آن‌ها برای مدت طولانی ادامه می­یابد، بنابراین استفاده از یک روش حساس و ویژه برای تشخیص سریع بیماری و همچنین مراقبت از جمعیت­های حساس ضروری است (7).

استان­های انتخاب شده برای نمونه­برداری در این تحقیق از مراکز مهم پرورش اســب در ایران می­باشند و جمعیت قابل توجهی از اسب­ها در این اســتان­ها پرورش می­یابند. اسب در اقتصاد ســاکنان این مناطق به‌طور مستقیم و غیرمستقیم تأثیرگذار است و تلاش در جهت تعیین شیوع بیماری­های اسب برای سیاستگذاران بهداشتی، دامپزشکان و  پرورش­دهندگان اسب حائز اهمیت می­باشد. هدف از این پژوهش، بررسی میزان آلودگی اسب­هایی با سابقه یا نشانه­های بالینی تورم سرخرگی اسبان با ویروس بیماری و ارتباط احتمالی آن با عواملی چون سن، جنس، نژاد و استان­های مورد بررسی است.

مواد و روش کار

نمونه­گیری از تعداد 149 رأس اسب از هر دو جنس، گروه‌های مختلف سنی و نژادهای مختلف با نشانه­های بالینی یا سابقه بالینی مرتبط با تورم سرخرگی اسبان شامل تظاهرات بیماری تنفسی (تب، ریزش فراوان از بینی، سرفه)، بیماری عصبی (آتاکسی، دیس‌متری، ازپاافتادگی) و سقط جنین (14) صورت پذیرفت.

 از آنجایی که آلودگی با این ویروس به خصوص در صورت انتقال از راه تناسلی غالباً باعث بروز شکل تحت­بالینی بیماری می­­شود و نیز به دلیل آنکه سقط جنین الزاماً همراه با نشانه­های بالینی در مادیان­ها نمی­باشد و همچنین چون اکثر اسبان مبتلا دارای نشانه­های بالینی ملایم تا متوسط هستند که در طی 5 تا 9 روز خود به خود از بین می­روند لذا برای انجام این تحقیق از اخذ سابقه و معاینات بالینی با هدف افزایش احتمال یافتن اسب­های آلوده به ویروس یا مبتلا به بیماری برای نمونه برداری استفاده شد (5).

به­منظور ثبت دقیق اطلاعات، فرمی طراحی شد و اطلاعات مورد نیاز شامل سن، جنس، نژاد، ســابقه بیماری، حضور نشانه­های بالینی تنفســی، عصبی، سابقه سقط جنین و یافته‌های حاصل از معاینات بالینی به تفکیک برای هر اسب ثبت گردید و سپس نمونه­گیری انجام شد. این روند در فاصله زمانی بهمن ماه 1394 تا آذر ماه 1395 صورت گرفت.

تعداد اسب­های نمونه­­برداری شده 149 راس بود که به تفکیک هر استان عبارت بودند از: گلستان 46 رأس (87/30 درصد)، خوزستان 45 رأس  (20/30 درصد)، تهران 37 رأس (83/24 درصد) و آذربایجان غربی 21 رأس (09/14 درصد).

نمونه­ اخذ شده از هر اسب شامل 5 میلی­لیتر خون بود که از ورید وداج در لوله­های حاوی فعال­کننده انعقاد (شرکت medical FL ساخت کشور ایتالیا) جمع آوری گردید. جداسازی سرم به کمک سانتریفیوژ و با سرعت 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه انجام شد و برای بررسی سرولوژی از کیت الیزای ID vet (ID Screen^® Equine Viral Arteritis Indirect) استفاده گردید. این کیت بر اساس الایزای غیرمستقیم طراحی شده است که قادر به ردیابی آنتی­بادی­های تولید­شده توسط سیستم ایمنی اسب بر علیه پپتید اختصاصی سطح ویروس تورم سرخرگی اسبان می­باشد. مراحل انجام تست الایزا طبق دستورالعمل شرکت سازنده صورت گرفت و میزان جذب نوری کنترل­های مثبت و منفی و نیز نمونه­های سرم مورد آزمایش در طول موج 450 نانومتر توسط دستگاه قرائت و ثبت گردید.

طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت، اگر مقدار متوسط جذب نوری در طول موج 450 نانومتر بیشتر از 350/0 و نسبت مقدار متوسط جذب نوری (ODPC) کنترل مثبت بیشتر از 3 باشد نشان­دهنده صحت انجام الایزا بود و سپس برای هر نمونه تفسیر نتایج صورت می­پذیرد.  S/Pنمونه­ها بر حسب فرمول زیرمحاسبه گردید و بر این اساس نمونه­های باS/P کمتر از 50 درصد، از نظــر آلودگی منفی و نمونه­های باS/P  بین 50 تا60 درصد، مشکوک و نمونه های باS/P مساوی یا بیشتر از 60 درصد، از نظر آلودگی مثبت محسوب گردید.

S/P = OD sample / OD positive control × 100

تجزیه و تحلیل آماری  با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 19 انجام شد. برای تجزیه و تحلیل داده‌ها از آزمون مربع کای و آزمون دقیق فیشر استفاده شد. برای یافتن توافق بین دو تست تشخیصی از ضریب توافق کاپا استفاده شد و 05/0 P≤معنی‌دار در نظر گرفته شد.

نتایج

از مجموع 149 رأس اسب نمونه­گیری­شده، 11 مورد (4/7 درصد) از نظر حضور آنتی­بادی علیه ویروس تورم سرخرگی اسبان مثبت بودند. از 11 نمونه سرم مثبت به ترتیب 5 مورد (1/4 درصد)، 4 مورد (7/26 درصد) و 2 مورد (50 درصد) دارای سابقه یا نشانه‌های بالینی بیماری تنفسی، سقط جنین و توامان عصبی-تنفسی بودند. هیچ اسبی با سابقه یا نشانه­های بالینی بیماری عصبی و یا توامان تنفسی_سقط جنین در موارد سرم مثبت یافت نشد (جدول 1). با استفاده از آزمون مربع کای، اختلاف آماری معنی‌داری بین موارد سرم مثبت و حضور سابقه یا نشانه­های بالینی مشاهده شد (001/0P<).

از 11 نمونه سرم مثبت به ترتیب 1 مورد (7/2 درصد)، 2 مورد (3/4 درصد)، 3 مورد (7/6 درصد) و 5 مورد (8/23 درصد) مربوط به استان‌های تهران، گلستان، خوزستان و آذربایجان غربی بودند (جدول 2). با استفاده از آزمون مربع کای، اختلاف آماری معنی‌داری بین موارد سرم مثبت و استان‌ها وجود داشت (05/0P<).

از نمونه­های سرم مثبت، 1 نمونه (9/2 درصد) از اسب­های با سن 5 سال یا کمتر، 9 نمونه (8/8 درصد) از اسب­های 15-6 ساله و 1 نمونه (3/8 درصد)  از اسب­های با سن 16 سال یا بیشتر بودند (جدول 3). با استفاده از آزمون مربع کای، اختلاف آماری معنی‌داری بین موارد سرم مثبت و گروه­های سنی مشاهده نشد.

به طور کلی از 149 رأس اسب نمونه­برداری­شده، 11 رأس از نژاد هلشتاین، 18 رأس از نژاد KWPN، 34 رأس از نژاد آمیخته، 32 رأس از نژاد ترکمن، 46 رأس از نژاد عرب و 8 رأس از نژاد تروبرد بودند. از11 اسب سرم مثبت، 6 مورد (6/17 درصد) نژاد آمیخته، 3 مورد (5/6 درصد) نژاد عرب، 1 مورد (5/12 درصد) نژاد تروبرد، 1 مورد (1/3 درصد) نژاد ترکمن بودند و هیچ مورد مثبتی در میان اسبان نژاد KWPN و هلشتاین یافت نشد (جدول 4). با استفاده از آزمون مربع کای، اختلاف آماری معنی‌داری بین موارد سرم مثبت و نژاد مشاهده نشد.

از 11 نمونه سرم مثبت، 8 مورد (8/5 درصد) مربوط به اسب­های ماده و 3 مورد (3/27 درصد) مربوط به اسب­های نر بود (جدول 5). با استفاده از آزمون مربع کای، اختلاف آماری معنی‌داری بین موارد سرم مثبت و جنس مشاهده نشد.

بحث

تست تجاری الایزا به علت داشتن سرعت، حساسیت (9/98 درصد) و ویژگی (3/98 درصد) مناسب برای تشخیص آلودگی اسب­ها با ویروس تورم سرخرگی اسبان (با توجه به ابتلای تحت‌بالینی بسیاری از اسب­ها) مورد استفاده قرار می­گیرد (13). امروزه دقت تست­های تجاری الایزا به قدری افزایش یافته است که می‌توان آن‌ها را به جای تست استاندارد خنثی­سازی سرم به کار برد (9،13). حساسیت و ویژگی کیت­های تجاری الیزا برای تورم سرخرگی اسبان تا حدی بالا است که از سوی موسسه تحقیقات و توسعه دامپزشکی آمریکا به عنوان تستی مناسب برای جایگزینی آزمون استاندارد طلایی خنثی­سازی ویروس توصیه شده است (4،6).

chung و همکاران در سال 2013 حساسیت و ویژگی تست الایزای رقابتی را به ترتیب 5/95 و 8/99 درصد بیان کرده‌اند (3) ولی این حساسیت مورد پذیرش برخی پژوهشگران واقع نشده است و این تست را هنوز جایگزین مناسبی برای تست خنثی سازی سرم نمی­دانند (6). در طی دو تحقیق جداگانه که توسط موسسه تحقیقاتی اسب گلاک انجام پذیرفت، به ترتیب 1235 و 1851 راس اسب با تست الایزا مورد بررسی قرار گرفتند. موارد حساسیت و ویژگی به‌دست آمده در مقایسه با تست استاندارد خنثی­سازی ویروس در این دو تحقیق به ترتیب  9/98 و  3/98 درصد و نیز  6/99 و  7/98 درصد اعلام گردید (4). سازمان جهانی بهداشت حیوانات (OIE) در دستنامه سال 2013 میلادی تست الایزا را به عنوان تست پیشنهادی برای بررسی­های سرولوژی جمعیت اسبان معرفی می‌کند.

 نمونه­های اخذ شده در این مطالعه از اسب‌داری‌های مختلف 4 استان کشور با جمعیت زیاد اسب، تهیه گردید. اسب­های موجود در این اسبداری­ها به منظور مسابقات پرش و سرعت، تولیدمثل و آموزش سوارکاری نگهداری می­شدند. تحقیقات متعددی در مورد بررسی سرولوژی تورم سرخرگی اسبان در مناطق مختلف دنیا صورت گرفته و نتایج متفاوتی بر اساس مناطق مختلف جغرافیایی و روش­های آزمایشگاهی مورد استفاده، بدست آمده است. در همین راستا شواهد سرولوژی، تأثیر حضور ویروس را در کشورهای بریتانیا، اسپانیا، ایتالیا، فرانسه، لهستان، هلند، بلژیک، آلمان، آمریکای شمالی و جنوبی و استرالیا نشان می­دهد (5).

بیماری در حال گسترش به کشورهای پاک از نظر این بیماری می­باشد. نیوزلند و ژاپن از کشورهایی هستند که هرگز بیماری در آن‌ها گزارش نشده است. حمل و نقل بین­المللی و انتقال اسپرم منجمد سبب انتقال بیماری می­گردد. فراوانی دام­های مبتلا در بین جمعیت­های اسب و نیز میزان ابتلا در بین نژادهای مختلف بسیار متفاوت است. تقریباً 2 درصد از اسبان آمریکا سرم مثبت هستند (به کمک تست خنثی سازی سرم با تیتر بالاتر از 1:4). حدود 25 درصد از مراکز پرورش اسب شاغل به امر تولید مثل اسبان دارای حداقل یک رأس اسب سرم مثبت غیر واکسینه هستند. مادیان­ها و اسب­هایی که به طور کلی برای نسل­کشی استفاده می­شوند با احتمال بیشتری سرم مثبت هستند (5).

Constable و همکاران در سال 2017 فراوانی اسبان سرم مثبت را درآمریکا بدین صورت گزارش نمودند: 24 درصد از اسبان استانداردبرد، 5/4 درصد از اسبان تروبرد، 6/3 درصد از اسبان خونگرم و 6/0 درصد از اسبان کوارتر. تقریباً 19 درصد از اسبان خونگرم وارد شده به کشور آمریکا از نظر آنتی­بادی مثبت و بیشتر آن‌ها از کشورهای آلمان و هلند بودند. در حدود 55 درصد از اسبان خونگرم و 93 درصد از اسب‌های لیپیزان کشور اتریش و 24 درصد از اسبان ترکیه نیز سرم مثبت بودند. از 8000 نمونه سرمی جمع­آوری­شده در کشور یونان 3/3 درصد مثبت بودند. بیماری در دو کشور انگلستان و آمریکا به دنبال واردات اسب و اسپرم رخ داده است (5).

Bulut و همکاران در سال 2012 با بررسی سرولوژی روی 208 راس از اسبان مناطق مختلف ترکیه، میزان آلودگی با این ویروس را 4/23 درصد اعلام نمودند (2). Asar و همکاران در سال 2016 با بررسی سرولوژی روی سرم 204 رأس اسب از مناطق مختلف ترکیه، فراوانی سرولوژی را 8/10 درصد ثبت نمودند. در این تحقیق 20 رأس مادیان و 2 رأس نریان سرم مثبت اعلام شدند (1). Marenzoni و همکاران نیز در سال 2013 با بررسی سرولوژی روی 346 راس اسب در کشور ترکیه با کمک روش خنثی­سازی سرم، فراوانی سرمی 16 درصد را به ثبت رساندند (10).

Hussein و همکاران در سال 2016 با بررسی سرولوژی 161 راس از اسبان عراق با روش الایزا، فراوانی سرمی 61/1 درصد را اعلام نمودند (6). Talafha و همکاران در سال 2016 با بررسی سرولوژی 254 راس از اسبان اردن با روش الایزا (با کیت مشابه تحقیق حاضر)، فراوانی سرمی این ویروس را 4/2 درصد ثبت کردند (14).  Turnball و همکاران در سال 1998 با بررسی سرولوژی روی خون 62 رأس از الاغ­های کشور امارات متحده عربی با کمک تست خنثی­سازی سرم، رخداد سرمی این بیماری را 51/1 درصد اعلام نمودند (15).

Mirsaeedi Farahani و همکاران در سال 2014 با بررسی سرولوژی با کمک تست الایزای تجاری (مشابه تحقیق حاضر) روی 126 راس اسب، فراوانی آلودگی با ویروس را 76/0 درصد (یک نمونه مثبت) ثبت نمودند و با مقایسه رخداد سرمی این ویروس با سایر مناطق دنیا به این نتیجه رسیدند که احتمالاً آلودگی با این ویروس در ایران بسیار کم باشد (11).

با در نظر گرفتن نتایج تحقیق حاضر مبنی بر میزان آلودگی 4/7 درصد از اسب­های با سابقه یا نشانه­های بالینی در چهار استان کشور می­توان به این نتیجه رسید که احتمالاً آلودگی با ویروس تورم سرخرگی اسبان در سایر استان­های کشور نیز وجود داشته باشد و اهمیت این بیماری با توجه به ویژگی تحت­بالینی آن و نیز تحقیقات میدانی اندک، در ایران بیشتر از حد انتظار باشد و این احتمال می‌رود تا واردات اسبان آلوده به این ویروس و نیز نقل و انتقال بدون نظارت و کنترل اسب­ها (با کمک روش­های توصیه‌­شده از سوی سازمان جهانی بهداشت حیوانات) در بین مناطق و استان‌های مختلف کشور سبب گسترش این ویروس در کشور شده باشد.

بیشترین اسب­های سرم مثبت ثبت شده در بررسی حاضر به ترتیب از استان‌های آذربایجان غربی، خوزستان، گلستان و تهران بودند و با استفاده از آزمون مربع کای، اختلاف آماری معنی‌داری بین موارد سرم مثبت و این استان‌ها مشاهده شد (05/0P<). با توجه به آنکه بین استان‌های تهران و آذربایجان‌غربی (02/0P=) و نیز بین استان‌های گلستان و آذربایجان غربی (027/0P=) اختلاف آماری معنی‌داری وجود دارد، شاید داشتن مرز مشترک با کشور ترکیه و عدم نظارت دقیق بر جابه­جایی اسبان، توجیه­کننده فراوانی بیشتر جمعیت اسب آلوده با ویروس تورم سرخرگی اسبان در استان آذربایجان غربی در مقایسه با سایر استان­های مورد بررسی در این تحقیق باشد.

بیشترین میزان آلودگی در اسبان دارای سابقه یا نشانه‌های بالینی تنفسی (5 مورد)، سقط جنین (4 مورد) و توأمان تنفسی_عصبی (2 مورد) مشاهده گردید که با استفاده از آزمون مربع کای، اختلاف آماری بسیار معنی‌داری بین موارد سرم مثبت و اسبان دارای سابقه یا نشانه بالینی مشاهده شد (001/0P<). با توجه به بروز نشانه­های بالینی اندک و غالباً تحت­بالینی در اسبان مبتلا به ویروس تورم سرخرگی اسبان، بر لزوم نمونه­گیری هدفمند بر اساس سابقه و یا نشانه­های بالینی تأکید می‌گردد. از طرف دیگر معنی­دار بودن ارتباط بین میزان آلودگی اسب­ها با ویروس و نشانه‌های تنفسی، سقط و توامان عصبی-تنفسی (05/0P<)،لزوم توجه بیشتر دامپزشکان به بیماری تورم سرخرگی اسبان هنگام برخورد با نشانه­های بالینی مشابه در اسب را گوشزد می‌نماید.

در مطالعه حاضر با استفاده از آزمون مربع کای، اختلاف آماری معنی‌داری بین موارد مثبت پاسخ الایزا و جنس دام­ها مشاهده نشد. Constable و همکاران در سال 2017 به فراوانی بیشتر آلودگی با این ویروس در مادیان­ها در طی بررسی­های سرولوژی اشاره کرده­اند (5). نظر به اینکه آلودگی مادیان­ها از هر دو راه انتقال عمودی و افقی با این ویروس رخ می­دهد (2) و از طرف دیگر مادیان­ها برای شرکت در مسابقات و یا به منظور جفت‌گیری در مراکز تولید مثل اسبان بیشتر جابه­جا می­شوند، شاید آلودگی بیشتر با این ویروس در مادیان­ها به این دلایل قابل توجیه باشد.

تابه‌حال هیچ گونه حساسیت نژادی برای ابتلای اسب­ها به ویروس تورم سرخرگی اسبان گزارش نشده است و ویروس می­تواند در تمام نژادهای اسب سبب ایجاد بیماری شود (5،7). در تحقیق حاضر نیز ارتباط آماری معنی­داری بین نژاد و آلودگی اسبان با این ویروس ثبت نگردید که البته علت این یافته را در بررسی حاضر می­توان ناشی از پراکندگی ناهمگون تعداد نمونه‌های اخذ شده از نژادهای مختلف کشور دانست.

اگرچه مطالعه حاضر، آلودگی با ویروس تورم سرخرگی اسبان را در اسب­های دارای سابقه یا نشانه‌ٌهای بالینی مرتبط با این ویروس نشان داده است اما نمی­توان نقش سایر عوامل پاتوژن مانند هرپس‌ ویروس­های تیپ یک و چهار تک­سمیان، رینوویروس­ها و نیز ویروس آنفلوانزای اسبان را به عنوان علل بروز نشانه­های بالینی رد کرد (4).

مطالعه حاضر، آلودگی با ویروس تورم سرخرگی اسبان را که یکی از عوامل محتمل برای ایجاد بیماری تنفسی و سقط در تک سمیان می­باشد در اسب­های 4 استان کشور با کمک روشی حساس و ویژه تأیید نمود. با توجه به توانایی این ویروس در ایجاد حالت آلودگی دائمی در سیلمی­ها و متعاقب آن انتشار ویروس در بین حیوانات سالم از طرق انتقال عمودی و افقی، لزوم اجرای برنامه­های هماهنگ در سطح کشور برای کنترل و پیشگیری از اشاعه این ویروس، خاطر نشان می­گردد.

سپاسگزاری

نویسندگان لازم می­دانند تا مراتب قدردانی خود را از زحمات آقای دکتر ایرج اشرافی تمای، آقای دکتر فرهاد موسی‌خانی و آقای مهندس خرمالی به عمل آورند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

جدول 1. فراوانی آلودگی اسب­ها با ویروس تورم سرخرگی اسبان بر حسب سابقه یا نشانه­های بالینی بیماری.

جدول2. فراوانی آلودگی اسب­ها با ویروس تورم سرخرگی اسبان بر حسب استان­های مورد مطالعه.

جدول 3. فراوانی آلودگی اسب­ها با ویروس تورم سرخرگی اسبان بر حسب سن در اسب­های مورد مطالعه.

جدول 4. فراوانی آلودگی اسب­ها با ویروس تورم سرخرگی اسبان بر حسب نژاد در اسب­های مورد مطالعه.

جدول 5. فراوانی آلودگی اسب­ها با ویروس تورم سرخرگی اسبان بر حسب جنس در اسب­های مورد مطالعه.