اتصالات روزنه­دار کانال­هایی هستند که امکان انتقال ترکیبات سیتوپلاسمی کوچک را بین سلول­ها فراهم می­کنند. پروتئین­هایی که این اتصالات را می­سازند تحت عنوان کانکسین شناخته می­شوند (33،36). کانکسین­ها در گروه­های 6 تایی، کانکسون­ها را می­سازند و دو کانکسون (نیم کانال) در کنار هم یک کانال را شکل می­دهند. گپ­جانکشن­ها امکان انتقال مستقیم یون­ها، مولکول­های کوچک و پیام رسان­ها نظیر Ca²⁺، ATP، cAMP، NAD⁺، IP₃، گلوتامات و پروستاگلندین­ها را در بین سلول­ها فراهم می­سازند (35). کانکسین­های 31، 26 و 43 امکان عبور cAMP ,ATP و IP3 و کانکسین 46 امکان نفوذ cAMP را فراهم می­سازند. کانکسین­ها از نظر اندازه حفره با یکدیگر تفاوت دارند به طوری که کانکسین 46 کوچک­ترین و کانکسین 43 بزرگ­ترین آن‌ها می­باشد (19). ده نوع از 21 نوع کانکسین شناخته‌شده در انسان، در لایه­های مختلف پوست قرار دارد. کانکسین 43 رایج‌ترین کانکسین پوست در ارتباط با لایه بازال، کراتینوسیت و فیبروبلاست است که در روند پرولیفراسیون سلول نقش دارد (27).

آنالیز ایمنوفلورسنت در پوست سالم رت نشان می­دهد که پروتئین کانکسین 43 در لایه­های زایگر و خاردار بیان می­شوند. بین روزهای یک و دو بعد از ایجاد زخم میزان کانکسین 43 به‌صورت واضح در لبه­ها و اطراف زخم، یعنی همان‌جایی که پرولیفراسیون روی می‌دهد، کاهش می­یابد. این کاهش سبب بسته شدن نارس اپیدرم بعد از ایجاد زخم شده و کاهش تعداد کانکسین 43 قبل از مهاجرت کراتینوسیت­ها می­تواند روند بسته شدن زخم را سرعت بخشد (24). در روند التیام زخم، کانکسین 43 در کراتینوسیت‌های لبه­ی زخم کاهش می­یابد و امکان مهاجرت سلول­ها و بسته شدن زخم را فراهم می­سازد. کاهش کانکسین 43 برای پرولیفراسیون و مهاجرت کراتینوسیت­ها در التیام زخم ضروری است اما در زخم­های مزمن مانند زخم­های دیابتی تعداد این کانکسین­ها بالا می­رود، درنتیجه روند التیام طبیعی زخم با مشکل مواجه می­شود (11،27). تا زمانی که تعداد این کانکسین‌ها کاهش نیابد مهاجرت کراتینوسیت­ها آغاز نمی‌شود و به نظر می­رسد که با کاهش تعداد کانکسین­های 43 در رت­های دیابتی شده، اپیتلیالیزاسیون مجدد سرعت می­یابد (2). در آسیب­های بافتی و در طی روند التیام کانکسین 43 نقش حیاتی در تنظیم التهاب دارد (14،16). یکی از متابولیت­های داخل سلولی مهم ATP است که در غلظت میلی مولار در سیتوزول حضور دارد و می­تواند به‌راحتی از برخی نیم­کانال­ها نظیر کانکسین‌های 26، 32 و 43 عبور کند. (23)

فلوفنامیک اسید، یک آمینواسید آروماتیک است که در خانواده ضدالتهاب‌های غیراستروئیدی (NSAIDs) قرار دارد و فعالیت ضدالتهابی آن در اثر مهار سیکلواکسیژناز و درنتیجه ممانعت از سنتز پروستاگلاندین­ها از آراشیدونیک اسید رخ می‌دهد. فلوفنامیک اسید کانال­های 43 را مهار می­کند (35) و بازدارنده‌ی گپ جانکشن­ها است ولی همچنان مکانیسم دقیق عمل این دارو در مهار کردن کانال‌های بین سلولی نامشخص است. (17). تحقیقات نشان می­دهند که اثرگذاری فنامات­ها به دلیل اتصال به محل تنظیم فرکانس­هایی است که موجب بسته شدن کانال­ها می‌شود، به همین دلیل، تأثیر فنامات­ها و مشتقاتش محدود به گپ‌جانکشن­های خاصی است (36). Leybaert و همکاران در سال 2003 با استفاده از پپتید­های وابسته به کانکسین در سلول­های اندوتلیال نشان دادند که فلوفنامیک اسید قادر به مهار کانال کانکسین بوده و مانع از آزاد شدن ATP به خارج سلول می­شود (26). Becker و همکاران در سال 2012 بیان کردند که پپتیدهای وابسته به کانکسین با ممانعت از خروج ATP از سلول، درترمیم زخم­های دیابتی نقش دارند (2). Wang و همکاران در سال 2007 طی مطالعات خود نشان دادند که بیان غیر­طبیعی کانال­های کانکسین در پوست دیابتی، التیام زخم را به تعویق می­اندازد (35). یک مشکل طولانی در زمینه اتصالات روزنه­دار، فقدان عوامل یا مهار‌کننده‌های کانکسین با توانایی بالا است. بازدارنده­های اختصاصی کانال­های کانکسین ممکن است اثرات درمانی داشته باشند، زیرا این کانال­ها به‌عنوان یک هدف فارماکولوژیک قابل‌اعتماد در درمان صرع، آریتمی قلبی، سرطان و تومورها موردتوجه قرارگرفته­اند (32،36).

با توجه به اینکه کانکسین 43 عمده­ترین کانکسین پوست در ارتباط با کراتینوسیت­ها و لایه زایگر بوده و در روند التیام زخم تعداد آن‌ها در کراتینوسیت­های لبه زخم کاهش می­یابد؛ از طرفی فلوفنامیک اسید، یک داروی ضدالتهاب غیراستروئیدی است که قادر به مهار کانکسین 43 می­باشد، به نظر می­رسد که این دارو با مهار کانال­های کانکسین بتواند روند التیام زخم را بهبود بخشد. به همین علت مطالعه حاضر با هدف بررسی تأثیر این دارو بر روند التیام زخم‌های دیابتی صورت گرفت.

مواد و روش‌کار

حیوان: در این مطالعه از 40 سر رت نژاد ویستار با وزن 10 ±200 گرم استفاده شد. رت­ها در قفس­های پنج­تایی در محیط با درجه حرارت 22-20 درجه سانتی­گراد و رطوبت 10±50 درصد و سیکل روشنایی-تاریکی 12 ساعته نگهداری شده، غذا به‌صورت پلیت مخصوص و آب بدون محدودیت در اختیار آن‌ها قرار گرفت.

روش ایجاد دیابت تجربی: دیابت تجربی در رت­ها با تزریق داخل صفاقی 150 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن آلوکسان (Sigma Aldrich Corporation – Germany) انجام شد. برای نتیجه بهتر، 24 ساعت قبل از تزریق به رت­ها غذا داده نشد. حیوان­هایی که میزان قند خون آن‌ها در هر دسی­لیتر بیش از 200 میلی­گرم بود و علائمی نظیر پرنوشی و پرادراری داشتند، دیابتی در نظر گرفته شدند (4).

ایجاد زخم: پس از حصول اطمینان از دیابتی بودن حیوان، به‌منظور ایجاد زخم ابتدا رت­ها توسط کتامین و زایلازین بیهوش شده و موهای پشت حیوان تراشیده شد. سپس برشی به ابعاد 2×2 سانتی‌متر در ناحیه پشت ایجاد و پوست به‌طور کامل یا تمام ضخامت، در شرایط آسپتیک برداشته شد.

روش درمان: پس از ایجاد زخم، رت­ها به‌صورت تصادفی به چهار گروه ده‌تایی تقسیم شدند:

گروه اول (2 درصد): زخم ایجادشده در رت­های این گروه توسط پماد 2 درصد اسید فلوفنامیک (2/0 گرم اسید فلوفنامیک، 5/6 گرم وازلین و 3/3 گرم اوسرین) پوشانده شد و پس از قرار دادن گاز استریل بر روی آن، بانداژ گردید.

گروه دوم (5 درصد): زخم ایجادشده در رت­های این گروه توسط پماد 5 درصد اسید فلوفنامیک (5/0 گرم اسید فلوفنامیک، 3/6 گرم وازلین و 2/3 گرم اوسرین) پوشانده و مانند گروه اول بانداژ گردید.

گروه سوم (10 درصد): زخم ایجادشده در رت­های این گروه توسط پماد 10 درصد اسید فلوفنامیک (1 گرم اسید فلوفنامیک، 6 گرم وازلین و 3 گرم اوسرین) پوشانده و مانند گروه اول بانداژ گردید.

گروه کنترل: زخم ایجادشده در رت­های این گروه توسط پماد کنترل (6/6 گرم وازلین و 4/3 گرم اوسرین) پوشانده و مانند گروه اول بانداژ گردید.

از روز صفر تا 21، در تمام گروه­ها به‌صورت روزانه پانسمان رت­ها تعویض و پماد زخم­ها تجدید گردید.

روش تعیین درصد بهبودی زخم: در روزهای صفر، 3، 5، 7، 9، 11، 13، 15، 17، 19 و 21 از سطح زخم توسط دوربین دیجیتال عکس‌برداری شد. به‌منظور بررسی روند بهبود ماکروسکوپی، با استفاده از نرم‌افزار Scion Image مساحت زخم محاسبه گردید. ایجاد زخم و اندازه­گیری سطح آن توسط یک نفر انجام شد. میزان بهبودی بر اساس فرمول زیر به دست آمد (8):

100* (A1-Ax)=  درصد بهبودی

A1/

Ai=  سطح زخم در روز i ام

انجام مطالعات هیستوپاتولوژیک: با توجه به ویژگی ضدالتهابی دارو و امکان تعارض آن با روند التهاب و ترمیم، نیمی از رت­های هر گروه در روز 5 و بقیه آن‌ها در روز 21 پس از ایجاد زخم، توسط اتر یوتانایز شدند. به‌منظور نمونه­برداری از پوست، از ثلث میانی زخم، نواری به طول 3 – 5/2 سانتی­متر و عرض 1 – 5/0 سانتی­متر به‌صورت تمام ضخامت برداشته شد. بدین ترتیب این نوار هم شامل بخش­های حاشیه­ای و مرکزی زخم و هم شامل نواحی سالم مجاور لبه زخم بود. نمونه­ها 72 ساعت در محلول بافر فرمالین 10 درصد و پس از ثبوت، جهت عمل‌آوری در دستگاه هیستوکینت قرار گرفتند. پس از قالب‌گیری توسط پارافین، برش‌هایی به ضخامت 6 میکرون از آن‌ها تهیه و متعاقب رنگ‌آمیزی‌های هماتوکسیلین و ائوزین و ماسون تری کروم توسط میکروسکوپ نوری موردمطالعه قرار گرفتند. از هر نمونه 5 اسلاید و در هر اسلاید 5 منطقه غیر هم­پوشاننده به‌صورت تصادفی انتخاب و بررسی گردیدند. درجه‌بندی زخم­ها براساس روش نیمه کمی و مطابق جدول 1 انجام شد (12).

تجزیه‌وتحلیل آماری با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 21 صورت پذیرفت. داده­های رتبه­ای در پارامترهای اپیتلیالیزاسیون، فیبروبلاست، آنژیوژنز و کلاژن توسط آزمون کروسکال والیس و آزمون من ویتنی در سطح معنی‌داری 05/0P< با هم مقایسه گردید. همچنین داده­های مربوط به سطح زخم نیز با استفاده از آزمون One-Way-ANOVA و تست تکمیلی Tukey در سطح معنی‌داری05/0P< با هم مقایسه گردید.

سلول­های التهابی- (-): عدم حضور سلول­های التهابی

(خفیف): حضور سلول التهابی در دو میدان میکروسکوپی

(متوسط): حضور سلول التهابی در سه تا پنج میدان میکروسکوپی

(زیاد): حضور سلول التهابی در بیش از پنج میدان میکروسکوپی

آنژیوژنز- (-): عدم حضور عروق خونی

(خفیف): حضور صفر تا دو عروق خونی

(متوسط): حضور سه تا چهار عروق خونی

(زیاد): حضور بیش از چهار عروق خونی.

فیبروپلازی- (-): حضور تعداد کمی فیبر کلاژن نازک همراه با تعداد زیاد فیبروبلاست

(خفیف): حضور فیبرهای نازک کلاژن همراه با تعداد زیاد فیبروبلاست

(متوسط): حضور فیبرهای ضخیم کلاژن همراه با تعداد زیاد فیبروبلاست

(زیاد): حضور فراوان فیبرهای ضخیم کلاژن همراه با تعداد کمی فیبروبلاست.

مساحت زخم:در روزهای صفر، 3، 5، 7، 9، 11، 13، 15، 17، 19 و 21 مساحت زخم در گروه­های موردمطالعه اندازه­گیری و نتایج زیر حاصل شد:

در روزهای صفر، سه و پنج اختلاف معنی­داری بین گروه­های موردمطالعه دیده نشد، اما از روز هفتم در دو گروه کنترل و 2 درصد مساحت زخم کم­تر شده و با گروه­های 5 درصد و 10 درصد دارای تفاوت معنی­دار شد (05/0P<) و این اختلاف را تا پایان دوره (روز 21) حفظ کرد. سطح زخم در گروه­های 5 درصد و 10 درصد بیشتر از گروه­های کنترل و 2 درصد بود. بین دو گروه کنترل و 2 درصد تفاوت معنی­داری مشاهده نشد (تصویر 1).

میزان بهبود زخم نیز تا روز پنجم اختلاف معنی­داری را در بین گروه­ها نشان نداد، اما از روز هفتم به بعد میزان بهبود زخم در گروه­های کنترل و 2 درصد در مقایسه با گروه­های 5 درصد و 10 درصد از اختلاف معنی­دار برخوردار بود. بااین‌وجود میزان بهبود زخم در گروه 5 درصد نسبت به 10 درصد و همچنین در گروه کنترل نسبت به گروه 2 درصد واجد اختلاف معنی­دار نبود. درمجموع بسته شدن و جمع شدن لبه­های زخم و درنتیجه میزان بهبودی زخم، در طول دوره (مدت 21 روز)، در گروه 2 درصد اندکی بهتر از گروه کنترل بود اما این اختلاف معنی­دار نبود. بااین‌حال سرعت بسته شدن زخم و میزان بهبودی آن در گروه 2 درصد بیشتر بوده و در مقایسه با سایر گروه­ها، حتی گروه کنترل از روند بهتر و سریع­تری برخوردار بود (نمودار 1).

زایش بافت اپیتیال:روند زایش بافت اپیتیال در گروه‌های 2 درصد، کنترل، 5 درصد و 10 درصد به ترتیب از بهترین تا بدترین وضعیت مشاهده شد. زایش بافت اپیتیال در روز 21 در گروه­های 2 درصد و کنترل به­وقوع پیوسته و به­خوبی پیشرفت کرده بود، اما در گروه­های 5 درصد و 10 درصد صورت نگرفته و بقایای لخته فیبرینی هنوز در زخم مشهود بود (تصویر 2). در گروه 2 درصد نسبت به سایر گروه_­­ها و حتی گروه کنترل، روند زایش بافت اپیتیال کامل­تر صورت گرفته و این اختلاف معنی­دار بود (05/0P<). در گروه کنترل نیز زایش بافت اپیتیال نسبت به گروه‌های 5 درصد و 10 درصد کامل­تر انجام‌شده و این اختلاف معنی­دار بود (05/0P<). در گروه 5 درصد اگرچه رشد و تکثیر کراتینوسیت­ها بهتر از گروه 10 درصد صورت گرفته بود اما روند زایش بافت اپیتیال در هر 2 گروه پیشرفت خوبی نداشت و بین آن‌ها اختلاف معنی­داری مشاهده نگردید.

فیبروبلاست­ها: از نظر تراکم فیبروبلاست در روز پنجم بین گروه­های موردمطالعه اختلاف معنی­داری مشاهده نگردید و تقریباً در تمام گروه­ها تراکم نسبتاً کم تا متوسطی را در جوانه گوشتی تشکیل دادند. در روز 21 تراکم فیبروبلاست­ها در دو گروه کنترل و 2 درصد اندک بود، درحالی‌که در گروه­های 5 درصد و 10 درصد تراکم متوسط و زیاد فیبروبلاست­ها در جوانه گوشتی به چشم خورد. تراکم فیبروبلاست­ها  در روز 21 بین گروه کنترل و سایر گروه­ها از اختلاف معنی­داری برخوردار بود (05/0P<)، همچنین این تراکم در گروه 2 درصد نیز با سایر گروه­ها واجد اختلاف معنی­دار بود (05/0P<) اما هیچ اختلاف معنی­داری بین تراکم فیبروبلاست در گروه­های 5 درصد و 10 درصد مشاهده نشد.

آنژیوژنز:در روز پنجم در هر دو گروه کنترل و 2 درصد عروق جدید نسبتاً زیادی در جوانه گوشتی شکل گرفت اما عروق تشکیل‌شده در گروه 2 درصد از وسعت بیشتری نسبت به گروه کنترل برخوردار بود به‌گونه‌ای که این تفاوت واجد اختلاف معنی­دار بود. میزان تشکیل عروق جدید در جوانه گوشتی در گروه 2 درصد در حد متوسط و در گروه کنترل اندکی کمتر از آن مشاهده شد. این میزان در گروه­های 5 درصد و 10 درصد بسیار کمتر از گروه­های کنترل و 2 درصد بود. اختلاف موجود بین گروه­های 5 درصد و 10 درصد با هر دو گروه کنترل و 2 درصد از نظر تشکیل عروق جدید معنی­دار بود (05/0P<)، بااین‌حال عروق جدید در جوانه گوشتی گروه 5 درصد اگرچه بیشتر از گروه 10 درصد تشکیل شد اما این اختلاف معنی­دار نبود.

در روز 21 در هر دو گروه کنترل و 2 درصد به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای از عروق موجود درجوانه گوشتی کاسته شد. میزان عروق موجود در گروه 2 درصد کم­تر از گروه کنترل بوده و اختلاف موجود بین این دو گروه کاملاً معنی­دار بود (05/0P<). در دو گروه 5 درصد و 10 درصد حتی در روز 21 عروق فراوانی در جوانه گوشتی حضور داشت و این تعداد در گروه 10 درصد بیشتر از گروه 5 درصد بود (تصویر 3). اختلاف موجود در گروه‌های 5 درصد و 10 درصد با گروه­های کنترل و 2 درصد از نظر تعداد عروق موجود در جوانه گوشتی کاملاً معنی­دار بود (05/0P<)؛ اما بین دو گروه 5 درصد و 10 درصد تفاوت معنی‌داری از این نظر مشاهده نشد.

رشته­های کلاژن:در روز پنجم رشته­های کلاژن در تمام گروه­های موردمطالعه یا هنوز تشکیل نشده یا در کمترین مقدار خود بود؛ اما در روز 21 با پیشرفت ترمیم، تراکم رشته­های کلاژن بیشتر شده و حجم رشته­های ضخیم کلاژن نیز افزایش یافت. در گروه­های کنترل و 2 درصد حجم قابل‌توجهی از کلاژن ضخیم در جوانه گوشتی دیده شد. اگرچه اختلاف معنی­داری بین این دو گروه از نظر حجم رشته­های کلاژن وجود نداشت، اما نظم رشته­ها و تشکیل دستجات ضخیم کلاژن در گروه 2 درصد بهتر از گروه کنترل قابل رویت بود. تراکم رشته­های کلاژن موجود در جوانه گوشتی در گروه 5 درصد کمتر از کنترل و در گروه 10 درصد کمتر از گروه 5 درصد بوده و علاوه بر آن ضخامت رشته­ها نیز با روند مشابهی در گروه 5 درصد کمتر از کنترل و در گروه 10 درصد کمتر از گروه 5 درصد بود (تصویر 4). این اختلاف اگرچه بین دو گروه 5 درصد و 10 درصد معنی­دار نبود، اما بین گروه­های  کنترل و 2 درصد با گروه­های 5 درصد و 10 درصد دارای اختلاف معنی­دار بود (05/0P<). از منظر کیفی نیز رشته­های کلاژن موجود در جوانه گوشتی در گروه­های 5 درصد و 10 درصد بسیار نامنظم بوده و درجات متفاوتی از رشته­های نازک تا نسبتاً ضخیم را شامل می‌گردید که با پراکندگی ضعیف تا متوسط در جوانه گوشتی قابل‌رؤیت بود.