گونه‌های تیلریا، نشخوارکنندگان اهلی و وحشی را در مناطق گرمسیری و تحت گرمسیری آلوده می‌کنند. تاکنون حداقل 6 گونه تیلریا در نشخوارکنندگان کوچک گزارش‌شده است که شامل سه گونه بیماریزا می‌باشد. تیلریا لستوکاردی که عامل تیلریوز بدخیم می‌باشد و تیلریا لونشونی و تیلریا اولینبرگی که به‌عنوان عوامل بیماریزا در گوسفندان چین گزارش‌شده‌اند. اما گونه‌های غیر بیماریزا یا بیماریزای خفیف شامل تیلریا اویس، تیلریا آنولاتا و تیلریا سپارتا می‌باشند (13،14،40).

انگل تیلریا مشابه دیگر تک‌یاخته‌های اپی‌کمپلکسا دارای چرخه زندگی پیچیده می‌باشد. که شامل 3 مرحله اسپروگونی، مروگونی و گامتوگونی می‌باشد (16). تعدادی از گونه‌های کنه‌ها ازجمله هیالوما، همافیزالیس، آمبلیوما و رپی‌سفالوس اسپروزوئیت‌های این تک‌یاخته را به میزبانان پستاندار منتقل می‌کنند (1،16،40).

در ایران تاکنون در نشخوارکنندگان کوچک گونه‌های تیلریا لستوکاردی، تیلریا اویس و تیلریا آنولاتا گزارش‌شده است. تیلریا لستوکاردی در نقاط مختلف ایران خصوصاً مناطق غرب و جنوب غربی گزارش‌شده است درحالی‌که تیلریا اویس در تمام کشور مشاهده‌شده است (13،14،40). تیلریا آنولاتا نیز اخیراً در چند مطالعه در گوسفند و بز در ایران گزارش‌شده است (40، 17).

تیلریوز باعث ضرر و زیان اقتصادی فراوانی در صنعت دام‌پروری می‌شود. عمده‌ترین ضرر اقتصادی ناشی از تیلریا لستوکاردی، مرگ‌ومیر حاصل از آلودگی با این‌گونه تیلریا می‌باشد (5،13). عامل انتقال این‌گونه تیلریا کنه‌ی هیالوما آناتولیکوم آناتولیکوم می‌باشند (15،39). عده‌ای از محققین معتقدند که تیلریا لستوکاردی به‌وسیله رپی‌سفالوس بورسا و احتمالاً رپی‌سفالوس سانگوئی نوس نیز منتقل می‌شود (27). اما تیلریا اویس به‌وسیله گونه‌های کنه رپی‌سفالوس بورسا (1)، رپی‌سفالوس اورتسی (24) و رپی‌سفالوس سانگوئی نوس (37) منتقل می‌شود (26).

به‌منظور تشخیص تیلریوز روش‌های مختلفی استفاده‌ شده است ازجمله نشانه‌های بالینی، آنالیز میکروسکوپی خون با رنگ‌آمیزی گیمسا، تست‌های سرولوژیکی و روش‌های مولکولی بر اساس آنالیز DNA (22،35). روش‌های مولکولی ازجمله PCR جزو روش‌های بسیار مناسب جهت تشخیص و تفریق گونه‌های تیلریا می‌باشد (9،22).

هدف از این مطالعه، بررسی میزان آلودگی به گونه‌های تیلریا و تشخیص و تفریق آن‌ها با استفاده از سه ژن 18S rRNA، TamS1 و TaSp و مقایسه تفاوت‌های بین آن‌ها می‌باشد.

مواد و روش‌کار

نمونه‌های خون: در این مطالعه تعداد 200 نمونه خون گوسفند موردبررسی قرار گرفت که در گروه انگل‌شناسی دانشکده دامپزشکی جمع‌آوری‌شده بود. نمونه‌ها در الکل 70 درصد نگه‌داری شدند که قبل از استخراج DNA به‌طور کامل الکل گیری شدند.

استخراج DNA: عملیات استخراج DNA با استفاده از کیت (DNA extraction Kit, MBST, Iran) بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده انجام گرفت. به‌طور خلاصه، به هر 100 میکرو لیتر نمونه خون 180 میکرو لیتر بافر لیز کننده اضافه گردید. سپس به این مجموعه 20 میکرو لیتر پروتئیناز K جهت دناتوره کردن پروتئین‌ها اضافه گردید و به مدت 10 دقیقه در 55 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. سپس به هر نمونه 360 میکرو لیتر محلول بایندینگ اضافه شد و بعد از ورتکس کردن به مدت 10 دقیقه در 70 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. پس از اضافه کردن 270 میکرو لیتر اتانول 70 و ورتکس کردن، کل این مجموعه به ستون‌های MBST ریخته شدند و با دور 4000 سانتریفوژ شدند. بعد از دو بار شستشو با بافر شستشو، با اضافه کردن 100 میکرو لیتر بافر حل‌کننده و انکوبه کردن آن ها در دمای آزمایشگاه، با دور 6000 سانتریفیوژ شد و DNA استخراج گردید. نمونه‌های DNA تا مراحل بعدی در دمای انجماد 20- نگه‌داری شدند.

روش PCR: در مطالعه حاضر به‌منظور تائید استخراج صحیح DNA، با استفاده از پرایمرهای P1/P2 مستخرج از ژن بتا اکتین گوسفندی (شماره دسترسی در ژن بانک U39357) PCR انجام شد. برای انجام PCR، 10 نانوگرم DNA، 2 میکرولیتر از هر کدام از آغازگرها (20 میکروملار)، 2 میکرولیتر dNTP (10 میلی مولار از هر نوکلئوتید)، 3 میکرولیتر MgCl2 (50 میلی مولار)، 10 میکرولیتر 10x PCR buffer و 5/0 میکرولیتر 5/2U Taq polymerase (سیناژن، ایران) در حجم نهایی 100 میکرولیتر استفاده شد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در دستگاه ترموسایکلر (MWG Biotech, Germany) با استفاده از برنامه زیر انجام گرفت.

5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد جهت جداسازی کامل دو رشته DNA، سپس در 34 سیکل به ترتیب در 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه (جهت جداسازی ثانویه DNA)، 45 ثانیه در دمای 60 درجه سانتی‌گراد (جهت اتصال پرایمرها به قسمت مکمل)، 45 ثانیه در 72 درجه (جهت انجام واکنش همانندسازی) صورت پذیرفت. سپس یک سیکل به مدت 7 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد (جهت همانندسازی کامل) انجام شد. محصول PCR مورد انتظار با استفاده از این پرایمرهای ژن بتا اکتین گوسفندی bp 686 بود.

تکثیر ژن 18S rRNA تیلریا: به‌منظور تشخیص نمونه‌های خون آلوده به گونه‌های تیلریا و بابزیا قسمتی از ژن 18S rRNA با استفاده از پرایمرهای P3/P4 تکثیر داده شدند. این جفت پرایمر بر اساس توالی نوکلئوتیدی ژن 18S rRNA طراحی گردید که در همه‌ی گونه‌های تیلریا و بابزیا مشترک هستند و می‌توان با این جفت پرایمر جنس تیلریا را از بابزیا تفریق نمود. واکنش PCR مشابه با ژن بتا اکتین انجام شد با این تفاوت که دمای آنیلینگ برای پرایمرهای P3/P4 در محدوده 54 درجه سانتی‌گراد بود. محصول PCR مورد انتظار برای گونه‌های تیلریا bp 426-430 و برای گونه‌های بابزیا bp 389-402 بود.

Semi-nested PCR: پس از تشخیص گونه‌های تیلریا، روی محصولات PCR حاصل از پرایمرهای P3/P4 روش Semi-nested PCR جهت تشخیص تفریقی گونه‌های تیلریا انجام شد. بدین منظور دو پرایمر فوروارد شامل P5 که اختصاصی گونه‌ی تیلریا اویس می‌باشد و P6 که اختصاصی گونه‌های تیلریا لستوکاردی و تیلریا آنولاتا می‌باشد. پرایمر P4 به‌عنوان ریورس استفاده شد. محصول PCR مورد انتظار برای پرایمرهای P5/P4 و P6/P4 به ترتیب bp 228 و bp 237 بود. همچنین دمای آنییلینگ برای هر دو جفت پرایمر 54 درجه سانتی‌گراد بود.

PCR روی ژن Tams1: با توجه به اینکه با روش Semi-nested PCR و توسط ژن 18S rRNA نمی‌توان تیلریا آنولاتا را از تیلریا لستوکاردی تفریق کرد. جهت تفریق این دو گونه تیلریا از ژن Tams 1 استفاده شد. بدین منظور دو پرایمر فوروارد و یک پرایمر ریورس مشترک بین دو گونه تیلریا روی ژن مذکور طراحی شد. پرایمر P7 که اختصاصی تیلریا لستوکاردی می‌باشد (شماره دسترسی در بانک ژنتیک AJ006448.1)، پرایمر P8 که اختصاصی تیلریا آنولاتا می‌باشد (شماره دسترسی در بانک ژنتیک AB917302.1) و پرایمر P9 که پرایمر ریورس می‌باشد و بین ژن Tams1 هر دو گونه تیلریا لستوکاردی و آنولاتا مشترک می‌باشد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از جفت پرایمرهای P7/P9 و P8/P9 به‌طور جداگانه و به ترتیب با دمای آنیلینگ 60 و 54 درجه سانتی‌گراد انجام پذیرفت. محصول PCR مورد انتظار روی ژن Tams1 برای تیلریا لستوکاردی و تیلریا آنولاتا به ترتیب 760 و bp 780 بود.

تکثیر ژن TaSp: پس از تشخیص تفریقی گونه‌های تیلریا با استفاده از روش‌هایی که توضیح داده شد؛ PCR بر روی ژن TaSp با استفاده از پرایمرهای اختصاصی این ژن، روی نمونه‌های آلوده به گونه‌های تیلریا لستوکاردی، تیلریا اویس و تیلریا آنولاتا انجام پذیرفت. بدین منظور با استفاده از جفت پرایمر P10 و P11 که مشترک بین سه گونه ذکرشده می‌باشد، ژن TaSp این‌گونه‌ها تکثیر داده شد.

اطلاعات مربوط به پرایمر‌های استفاده شده در این مطالعه در جدول 1 نشان داده شده است.

تعیین توالی نوکلئوتیدی: تعداد دو نمونه از هرکدام از محصولات PCR گونه‌های مختلف تیلریا حاصل از ژن‌های 18S rRNA، Tams1 و TaSp، جهت تعیین ترادف نوکلئوتیدی به شرکت تکاپوزیست ارسال گردید.

نتایج

در مورد تعدادی از DNA های استخراج‌شده با استفاده از جفت پرایمر P1/P2 ژن بتا اکتین، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز انجام شد و DNA‌های استخراج‌شده مورد تائید قرار گرفتند (تصویر1،a).

سپس به‌منظور یافتن نمونه‌های آلوده به گونه‌های تیلریا و بابزیا، همه‌ی نمونه DNA های استخراج‌شده با استفاده از جفت پرایمر P3/P4 اختصاصی ژن 18S rRNA، تکثیر داده شدند. از 200 نمونه موردبررسی، 42 نمونه آلوده به گونه‌های تیلریا بودند و آلودگی به بابزیا مشاهده نشد (تصویر1، b). به‌منظور تشخیص تفریقی گونه‌های تیلریا، محصولات PCR حاصل از جفت پرایمر P3/P4، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی به روش Semi-nested PCR تکثیر داده شدند. بدین‌صورت که با استفاده از پرایمرهای P5 (اختصاصی تیلریا اویس) و P6 (اختصاصی تیلریا لستوکاردی و تیلریا آنولاتا) به‌عنوان پرایمرهای فوروارد و پرایمر P4 به‌عنوان پرایمر ریورس بدین منظور استفاده شدند. از 42 نمونه آلوده به تیلریا که با روشSemi-nested PCR بررسی شدند، 24 نمونه با جفت پرایمر P5/P4 تکثیر داده شدند یعنی 24 مورد از 42 نمونه موردبررسی، تیلریا اویس بودند (تصویر1، c). 14 نمونه نیز با استفاده از جفت پرایمر P6/P4 مثبت شدند که نشان دهنده آلودگی به تیلریا لستوکاردی یا تیلریا آنولاتا می‌باشند (تصویر1، d). 4 نمونه نیز آلودگی توأم تیلریا اویس با تیلریا لستوکاردی یا تیلریا آنولاتا داشتند یعنی هم با جفت پرایمر P5/P4 و هم P6/P4 مثبت بودند.

با توجه به شباهت بسیار بالای ژن 18S rRNA در تیلریا لستوکاردی و تیلریا آنولاتا، به‌منظور تفریق این دو گونه از هم، از ژن Tams1 استفاده گردید. بدین منظور 14 نمونه‌ای که با استفاده از ژن 18S rRNA و روش Semi-nested PCR، تیلریا لستوکاردی یا تیلریا آنولاتا مثبت بودند و همچنین 4 نمونه‌ای که آلودگی توأم تیلریا اویس و تیلریا لستوکاردی یا تیلریا آنولاتا داشتند با استفاده از پرایمرهای P7/P9 و P8/P9 که به ترتیب اختصاصی تیلریا لستوکاردی و تیلریا آنولاتا بودند، تحت PCR قرار گرفت. از 14 نمونه‌ی موردبررسی، 12 نمونه به تیلریا لستوکاردی و 2 نمونه به تیلریا آنولاتا آلوده بودند. همچنین با استفاده از این دو جفت پرایمر، 4 نمونه‌ای که آلودگی توأم داشتند بررسی شد و مشخص گردید که هر 4 نمونه آلوده به تیلریا لستوکاردی می‌باشند (تصویر1، e,f). لازم به ذکر است که هیچ‌کدام از نمونه‌های آلوده به تیلریا اویس با استفاده از این دو جفت پرایمر تکثیر داده نشدند و PCR آن‌ها منفی شد.

پس از تشخیص تفریقی گونه‌های تیلریا با استفاده از روش‌های Semi-nested PCR روی ژن 18S rRNA و PCR روی ژن Tams1، ژن TaSp هرکدام از این نمونه‌ها با استفاده از پرایمرهای اختصاصی P10/P11 تکثیر داده شد (تصویر1، g).

در پایان، تعداد 2 نمونه از هرکدام از محصولات PCR گونه‌های مختلف تیلریا حاصل از ژن‌های 18S rRNA، Tams1 و TaSp، تعیین توالی شدند. نتایج تعیین توالی نشان داد که محصولات PCR ژن 18S rRNA تیلریا لستوکاردی به ترتیب شباهت 99 و 95 درصدی با محصولات PCR ژن 18S rRNA گونه‌های تیلریا آنولاتا و تیلریا اویس دارد. ژن TamS1 تیلریا لستوکاردی و تیلریا آنولاتا شباهت 86 درصدی را نشان دادند. و مقایسه نتایج تعیین توالی ژن TaSp تیلریا اویس در مقایسه با تیلریا آنولاتا و تیلریا لستوکاردی شباهت 96 و 86 درصدی را نشان داد. تفاوت عمده ژن TaSp تیلریا لستوکاردی در مقایسه با دو گونه تیلریای دیگر در ناحیه N-terminus این ژن مشاهده شد.

بحث

تیلریوز بیماری مهم گوسفندان در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری می‌باشد که به‌وسیله تک‌یاخته خونی تیلریا ایجاد می‌شود. این بیماری باعث خسارت‌های اقتصادی فراوان در صنعت دام‌پروری می‌شود (23،40). تیلریا لستوکاردی گونه‌ی بسیار بیماریزا در نشخوارکنندگان کوچک است که باعث بروز تیلریوز بدخیم در نقاط مختلف دنیا ازجمله ایران می‌شود (4،15). یکی دیگر از گونه‌های تیلریا در نشخوارکنندگان کوچک تیلریا اویس است که شیوع نسبتاً زیادی در این میزبان‌ها در ایران دارد. تیلریا اویس غیر بیماریزا بوده و یا از بیماریزایی بسیار اندکی برخوردار است (31،38،39). اخیراً در چندین مطالعه، تیلریا آنولاتا نیز در گوسفند و بز گزارش‌شده است (17،40). این‌گونه نیز در نشخوارکنندگان کوچک غیر بیماریزا می‌باشد (4). تیلریوز حاد دارای علائم بالینی ازجمله تب بالا، تورم غدد لنفاوی، مشکلات تنفسی و مرگ‌ومیر بالا می‌باشد. هرچند که مرگ‌ومیر بالا بدون علائم بالینی مشخص نیز مشاهده می‌شود (34). تاکنون 3 گونه تیلریا شامل تیلریا لستوکاردی، تیلریا اویس و تیلریا آنولاتا در نشخوارکنندگان کوچک در ایران گزارش‌شده است که دو گونه‌ی تیلریا لستوکاردی، تیلریا اویس شیوع بالایی در نشخوارکنندگان کوچک در ایران دارند (40، 17).

روش‌های مختلفی برای تشخیص تیلریوز استفاده‌شده است شامل روش‌های میکروسکوپی، روش‌های سرولوژی و روش‌های مولکولی. تشخیص تیلریوز در حال حاضر معمولاً بر اساس علائم بالینی و مشاهده اشکال پیروپلاسمی در گسترش‌های خونی و رنگ‌آمیزی با گیمسا صورت می‌گیرد. از مزایای روش‌های میکروسکوپی می‌توان به‌آسانی، سریع بودن و عدم نیاز به امکانات زیاد نام برد. اما از محدودیت‌های این روش نیز می‌توان به عدم تفریق گونه‌های مختلف تیلریا، حساسیت و ویژگی پایین این روش در مقایسه با روش‌های دیگر ازجمله روش‌های مولکولی و نیاز به مهارت و تجربه‌ی بالای فرد آزمایش‌کننده جهت تشخیص درست تیلریوز را برشمرد (6،22،36،38).

از روش‌های تشخیصی دیگر تیلریوز می‌توان به روش‌های سرولوژیکی اشاره کرد. تاکنون روش‌های سرولوژیکی مختلفی مانند ثبوت کمپلمان (CFT) ایمنوفلورسانت غیرمستقیم (IFAT) و الیزا (ELISA) برای تشخیص تیلریوز استفاده‌شده است. در هرکدام از این روش‌های سرولوژیکی مورداستفاده، از آنتی‌ژن‌های مختلفی استفاده‌شده است ازجمله در ابتدا از شیزونت و اشکال پیروپلاسمی انگل و سپس پروتئین‌های نوترکیب حاصل از ژن‌های مختلف انگل ازجمله TaSp (3)، TaD (30)، TaSE (29) و TaHSP70 (33) مورداستفاده قرارگرفته‌اند که با نتایج مختلفی همراه بوده‌اند. در مقایسه این پروتئین‌های نوترکیب، تیتر بسیار بالای آنتی‌بادی در برابر پروتئین نوترکیب TaSp در مقایسه با سایر پروتئین‌ها مشاهده‌شده است (33). روش‌های سرولوژیکی روشی مناسب برای تشخیص فاز بیماری تیلریوز می‌باشند و می‌توان با این روش‌ها حیواناتی را که قبلاً مبتلابه تیلریوز شده و بهبودیافته‌اند را از عفونت‌های تازه تفریق نمود. مهم‌ترین مشکل در استفاده از روش‌های سرولوژیکی وجود واکنش‌های متقاطع بین گونه‌های مختلف تیلریا با همدیگر و با برخی انگل‌های تک‌یاخته‌ای خونی دیگر می‌باشد (7،18،21،22). اما روش‌های مولکولی منطبق بهترین روش برای تشخیص تفریقی گونه‌های مختلف تیلریا می‌باشند. روش‌های مولکولی مختلفی برای تشخیص تفریقی گونه‌های تیلریا استفاده‌شده است و این روش‌ها دارای حساسیت و ویژگی بسیار بالایی برای تشخیص تیلریوز می‌باشند. به‌طوری‌که با استفاده از روش PCR می‌توان حضور یک پیروپلاسم را در یک میکرو لیتر خون گوسفند تشخیص داد. این حساسیت بالای تشخیص تیلریا در مطالعات مختلف گزارش‌شده است (2،8،20).

در نقاط مختلف دنیا روش‌های مختلف مولکولی شامل روش‌های PCR-RFLP، Real-time PCR، RLB و روش LAMP به‌منظور تشخیص گونه‌های تیلریا استفاده‌شده است (22،25،28،32).

در اکثر مطالعات انجام‌گرفته به‌منظور تفریق گونه‌های تیلریا از ژن 18S rRNA استفاده گردیده است. به‌طور مثال در ایران، در مطالعه‌ای که توسط Heidarpour Bami و همکاران در سال 2009 بر روی 100 نمونه خون گوسفند در شرق و جنوب شرق ایران انجام شد با استفاده از روش PCR-RFLP میزان آلودگی به تیلریا را 56 درصد اعلام کردند که از این میزان، 5/12 درصد آلوده به گونه‌ی تیلریا اویس و 5/87 درصد آلوده به گونه‌ی تیلریا لستوکاردی بودند (14).

Zaeemi و همکاران در سال 2010 در مطالعه‌ای که بر روی گوسفندان در شمال و غرب انجام دادند، تعداد 250 نمونه خون گوسفند را جهت تعیین گونه‌های تیلریا با روش PCR-RFLP با استفاده از ژن 18S rRNA موردبررسی قراردادند. در این مطالعه از 250 نمونه خون موردبررسی با روش PCR، 82 مورد تیلریا مثبت بودند که از این تعداد، 45 و 33 نمونه به ترتیب آلوده به تیلریا لستوکاردی و تیلریا اویس بودند و 4 نمونه دارای آلودگی توأم تیلریا لستوکاردی با تیلریا آنولاتا بودند. این مطالعه، اولین گزارش از آلودگی طبیعی گوسفند به تیلریا آنولاتا در ایران بود (40).

Shayan و Rahbari در سال 2005، با استفاده از روش PCR، گونه‌های تیلریا و بابزیا را در لام‌های خون رنگ‌آمیزی شده تفریق نمودند. در این مطالعه، ابتدا اقدام به استخراج DNA از لام‌های خونی که با روش گیمسا رنگ‌آمیزی شده بودند کردند. سپس با پرایمرهایی که از روی ژن‌های 18S rRNA، ژن Tams 1- 2 و ژن hsp70 طراحی کرده بودند، DNA‌های استخراج‌شده را تکثیر دادند. نتایج این مطالعه نشان داد که با استفاده از ژن 18S rRNA می‌توان جنس‌های تیلریا و بابزیا را به‌طور دقیق تشخیص و تفریق نمود (36).

در اکثر مطالعات انجام‌شده، به‌منظور تفریق گونه‌های تیلریا با روش PCR در میزبانان مختلف، از ژن 18S rRNA استفاده‌شده است. اما ژن Tams نیز در برخی مطالعات در ایران و سایر نقاط به‌منظور تفریق گونه‌های تیلریا استفاده ‌شده است (10،11،12،19،35).

در مطالعه حاضر گونه‌های تیلریای گوسفند با استفاده از ژن‌های 18S rRNA، TamS1 و TaSp تشخیص تفریقی داده شدند. و مشاهده گردید که می‌توان از ژن‌های TamS1 و TaSP به‌منظور تشخیص اختصاصی یک‌گونه‌ی تیلریا با روش PCR استفاده نمود. بنابراین می‌توان با استفاده از این سه ژن و با طراحی پرایمر اختصاصی، با انجام یک واکنش Multiplex PCR و با حداقل زمان و امکانات به‌صورت اختصاصی گونه‌های تیلریا را از هم تفریق نمود.

سپاسگزاری

نویسندگان از موسسه گروه پژوهشی انتقال سامانه های زیست مولکولی به عالت پشتیبانی مالی و علمی در اجرای این پژوهش تقدیر و تشکر به عمل می‌آورند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

جدول 1. لیست پرایمرهای استفاده شده.

تصویر 1. نتایج PCR روی ژن‌های β-actin، 18S rRNA، TamS1 و TaSp گونه‌های تیلریا. a. تکثیر ژن بتا اکتین با استفاده از پرایمرهای (P1/P2). 1: مارکر 100 bp، 2، 3، 4، 5: محصول PCR حاصل از جفت پرایمر P1/P2. b. تکثیر ژن 18S rRNA تیلریا با استفاده از جفت پرایمر (P3/P4). 1: مارکر 100 bp. 2 تا 7: محصول PCR حاصل از جفت پرایمر P3/P4. 8: کنترل منفی. c. محصول واکنش Semi-nested PCR حاصل از جفت پرایمر (P5/P4). 1: کنترل منفی. 2 تا 5: محصول PCR حاصل از پرایمرهای P5/P4 که اختصاصی تیلریا اویس می‌باشند. 6: مارکر 100 bp. d. محصول واکنش Semi-nested PCR حاصل از جفت پرایمر (P6/P4). 1 و 2: محصول PCR حاصل از پرایمرهای P6/P4 که اختصاصی تیلریا لستوکاردی یا تیلریا آنولاتا می‌باشند. 3: کنترل منفی. 4: مارکر 100 bp. e. 1: کنترل منفی. 2 و 3: تکثیر ژن TamS1 با جفت پرایمر P7/P9 که اختصاصی تیلریا لستوکاردی می‌باشد. 4: مارکر 100 bp. f. 1: مارکر 100 bp. 2 و 3: تکثیر ژن TamS1 با جفت پرایمر P8/P9 که اختصاصی تیلریا آنولاتا می‌باشد. g. 1: مارکر 100 bp. 2: تکثیر ژن TaSp تیلریا با استفاده از جفت پرایمر P10/P11.