مقدمه

پلی پپتید IpaD یکی از مهم‌ترین عامل‌های بیماری‌زای موجود در انواع شیگلا^[1] بوده، به‌گونه‌ای ‌که سرآغاز و گذرگاه همۀ فعالیت‌های تهاجمی شیگلا مرهون فعالیت کلیدی IpaD است. پادتن (آنتی‌بادی) ‌هایی که ناحیۀ انتهای آمین پروتئین IpaD را شناسایی می‌کنند توانایی برهمکنش این پروتئین با نمک‌های صفراوی به‌ویژه دی اکسی کولات را سرکوب می‌کنند. در این حالت باکتری قادر به انجام فعالیت ویژۀ خود برای فراخوانی و به‌کارگیری عامل‌های لازم برای ورود به یاختۀ میزبان نخواهد بود. در نتیجه توان شیگلا برای ایجاد روزنه در یاختۀ یوکاریوتی از بین رفته و فرآیند ورود باکتری به درون‌یاختۀ میزبان سرکوب می‌شود. با توجه به اینکه ناحیۀ N انتهای آمین IpaD یک ایمنوژن^[2] بسیار قوی در بروز شیگلوز است می‌توان از آن در طراحی واکسن استفاده کرد (Lamphear et al., 2004). شیگاتوکسین یک پروتئین هگزامر با وزن مولکولی 5/70 کیلودالتون بوده که از یک زیر واحد منومریک سمی و آنزماتیک به نام STxA و از یک زیر واحد متصل‌شونده به گیرندۀ (رسپتور) همو پنتامریک به نام STxB تشکیل شده است. قسمت غیرسمی STxB برای ورود و عملکرد قسمت سمی STxA)) ضروری است (Engedal et al., 2011). نتایج تحقیقات نشان داد، پلی پپتید IpaD می‌تواند منجر به تولید پادتن Anti-IpaD ‌شود. همچنین مشخص شد، پیش از به‌کارگیری دیگر کمک بازدارنده (افکتور) های پروتئینی روی سطح باکتری، پادتن‌ ضد IpaD با تداخل در عملکرد IpaD که در رأس سوزن قرار گرفته است آن را بلوکه کرده و بدین ترتیب بازدارندۀ انجام عملکرد IpaD می‌شود و در نتیجه ورود باکتری به یاخته­های میزبان سرکوب می­شود (Arai et al., 2001). از این‌رو این پروتئین به‌عنوان پادگن (آنتی‌ژن) نامزد واکسن شیگلوز قابلیت اتصال با یک ایمنو ادجوانت، مناسب را دارد. نتایج نشان داد، پروتئین به‌دست‌آمده از ترکیب ژن‌های ipaD وstxB می‌تواند موش سوری را نسبت به شیگا توکسین مصون کند، موش‌های ایمن شده توانستند 5/7 برابر LD50 شیگا توکسینE.coli O157:H7 را تحمل کنند (Honari et al., 2013). با توجه به اینکه استفاده از سامانه‌های گیاهی اقتصادی­تر از تولید پروتئین نوترکیب در دیگر سامانه‌هاست، می­توان بافت یا اندام خاصی از گیاه را که حاوی پروتئین نوترکیب مورد نظر است، به‌صورت خوراکی مصرف کرد. به کمک تولید انبوه در گیاهان، آسیب‌های ناشی از آلودگی با عامل‌های بیماری‌زای انسان به‌ویژه بیماری­های مشترک نیز کاهش می­یابد
(Daniell et al., 2000). تولید پروتئین دارویی در گیاهان نسبت به دیگر سامانه‌های بیانی برتری‌های زیادی دارد (Commandeur et al., 2003). برتری‌هایی مانند استفادۀ رایگان از نور خورشید، خاک، آب، کودهای ارزان و بدون بیمارگر (پاتوژن)­های انسانی گیاهان را برای تولید واکسن مناسب می­سازد چراکه گیاهان توانایی انجام تغییرپذیری پس از ترجمه را دارند (Hatt et al., 1989, Ma et al., 2003). امروزه بیش از 100 نوع پروتئین نوترکیب در گیاهان تولید شده است. کاهو گیاهی است که به‌سرعت در سرتاسر جهان برای تولید پروتئین‌های دارویی استفاده می‌شود (Kapusta et al., 1999, Zuo et al., 2001, Sun et al., 2006 ). انتقال ژن به کمک باکتری Agrobacterium tumefaciens برای تولید گیاهان تراریخته بسیار مرسوم است. بر پایۀ الگوی بیان ژن دو روش بیانی ثابت و موقت وجود دارد، در بیان ژن ثابت باید شرایط کشت بافتی و باززایی گونۀ گیاهی بهینه شده باشد که فرآیندی زمانبر است؛ بنابراین لازم است پیش از تراریختگی (ترانسفورماسیون) پایدار فعالیت ژن­ها بررسی شود. امروزه برای بررسی بیان ژن از بیان موقت به کمک باکتری Agrobacterium tumefaciens به‌عنوان آگرواینفیلتریشن استفاده می‌شود (Obembe et al., 2011). با بیان موقت ژن در مدت‌زمان کوتاهی میزان زیادی از پروتئین هدف به دست می­آید که دستیابی به چنین محصولی در این مدت‌زمان با روش‌های انتقال دائم امکان‌پذیر نیست، همچنین در بیان موقت، ژن تحت تأثیر ادغام کروموزمی و اثر مکانی قرار نمی­گیرد
(Wang & Ma, 2012). نخستین گام در زراعت مولکولی و تولید واکسن‌های زیرواحدی در گیاهان یافتن گیاه میزبان مناسب است. بهترین روش و نزدیک‌ترین روش برای دستیابی به این واقعیت، بیان موقت ژن مورد نظر در این گیاهان و بررسی کیفیت و کمیت تولید آن‌ها است (Li et al., 2007). با انتخاب گیاهانی مانند سبزی‌ها و میوه‌ها به‌عنوان سامانۀ بیان می‌توان از آن‌ها به‌عنوان منبع انتی ژن برای واکسینه کردن (واکسیناسیون) به‌صورت خوراکی استفاده کرد (Twyman et al., 2003). ازآنجاکه پروتئین ipaD نقش مهمی در تهاجم، بیماری‌زایی و ایجاد عفونت توسط شیلا دارد در این تحقیق، برای بیان آنتی­ژن ایمنوژنیک برای بیماری شیگلوز از انتهای آمین پروتئین IpaD  و زیر واحد B شیگاتوکسین (StxB) (به‌منظور افزایش تحریک سیستم ایمنی به‌عنوان ادجوانت) متصل شده بود استفاده شد. ژن شیمریک در باکتری E. coli و گیاه کاهو بیان شد.

مواد و روش‌ها

طراحی کاست ژنی در ناقل pET28a(+)

توالی ipaD  و stxB از بانک ژن دانشگاه امام حسین (ع) تهیه شد. بر پایۀ نوع نیاز آغازگرها طراحی (جدول 1) و توسط شرکت بایونیر[3] کره­جنوبی ساخته (سنتز) شد. با توجه به نوع طراحی، جایگاه­های برشی و نیز لینکر فورینی (شش اسیدآمینه که به ترتیب شامل 5^′Gly-Val-Arg-Arg-His-Arg3^′′) است، برای این کاست تعبیه و در ناقل (وکتور) بیانی pET28a(+) همسانه سازی شد.

الحاق قطعه‌های ژنی ipaD و stxB با روش SOEing PCR

در آغاز واکنش PCR به‌منظور افزایش قطعۀ ژنی ipaD با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ipaDF و ipaDSR توسط آنزیم Pfu  (تهیه‌شده از شرکت ترموساینس، کدانزیم Ep0501) درحجم 25 میکرولیتر انجام گرفت (شکل2 -الف) و پس‌ازآن واکنش PCR برای افزایش قطعۀ ژنی stxB با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ipaDSF و stxBR توسط آنزیم Pfu درحجم 25 میکرولیتر انجام گرفت (شکل 2-ب). هر واکنش شامل 40 نانوگرم DNA الگو، مخلوط نوکلئوتیدها با غلظت نهایی 0.5 میلی مولار، 20 پیکومول از هر آغازگر و 10میکرولیتر بافر 10X-buffer Pfu در دمای اتصال 58 درجۀ سلسیوس بهینه شد. . خالص‌سازی قطعه‌ها از روی ژل با روش گلس میلک (با روش راسل و سمبروک، 2001) انجام شد. سپس برای انجام سوئینگ (Soeng) پی‌سی‌ار (شکل 2-ج) در آغاز یک واکنش PCR آغازین شامل 40 نانوگرم محصول بازیابی‌شده از روی ژل، مخلوط نوکلئوتیدها با غلظت نهایی 0.5 میلی‌مولار و 10 میکرولیتر بافر10X-buffer Pfu به‌صورت 94درجۀ سلسیوس4 دقیقه، 58 درجۀ سلسیوس 3 دقیقه، و 72 درجۀ سلسیوس 15 دقیقه انجام شد و پس از پایان این واکنش آغازگرهای اختصاصی ipaDFو stxBR (20پیکومول از هر آغازگر) به مخلوط واکنش اضافه شد و واکنش PCR معمولی با حجم واکنش 25 میکرولیتر و با شرایط زیر انجام شد (جدول 2). پس از الحاق قطعه‌های ژنی و ساخت پروتئین نوترکیب برای تأیید درستی کار تعیین توالی (توسط شرکت بایونیر، کره جنوبی) انجام شد.

انتقال سازه های ژن کد کننده پروتئین نوترکیب در E. coli

عامل بیانی pET28a(+) حاوی ژن­های ipaD +stxB  با روش تکانۀ (شوک) دمایی به یاخته‌های مستعد (به روش کلرید کلسیم) (Sambrook and Russell, 2001)، اشرشیاکلی سویۀ بیانی BL21 منتقل شد و غربال‌گری همسانه­های به‌دست‌آمده روی محیط LB آگار حاوی 40 میکروگرم در میلی‌لیتر کانامایسین انجام شد. درستی همسانه‌سازی توسط هضم آنزیمی تأیید شد (شکل 3). روش کار بنا بر دستورکار Nezhad moghadam et al.  ((2006 انجام شد.

تأیید پروتئین نوترکیب

برای تخلیص پروتئین نوترکیب از فام‌نگاری (کروماتوگرافی) جذبی Ni-NTA آگارز با دستورکار شرکت کیاژن (Ni-NTA Agarose 25ml nickel-charged resin USA, Cat no. 30210) استفاده شد.

برای انجام آزمون الایزا استخراج پروتئین کل در سه تکرار زیستی (بیولوژیکی) انجام و آزمایش در دو تکرار فنی و با استفاده از آنتی­سرم ipaD (تهیه‌شده از دانشگاه امام حسین (ع)) با نسبت 1:200 و آنزیم کانژوگه HRP انجام شد.

تأیید پروتئین نوترکیب با لکه‌گذاری وسترن

برای بررسی پروتئین نوترکیب به‌دست‌آمده از باکتری­های تراریخت‌شده با سازۀ بیانی (+)pET28a  آزمون وسترن بلات انجام شد. به این منظور 15 میکروگرم از پروتئین باکتری در کنار نمونۀ شاهد (باکتری میزبان بدون سازه) روی ژل اکریلامید 10درصد جداسازی شد. انتقال پروتئین از ژل اکریلامید به غشای PVDF انجام و انسداد (بلاکینگ) به‌منظور نداشتن اتصال غیراختصاصی با استفاده از BSA 3 درصد انجام شد. در این آزمون از پادتن آنتی­هیستیدین تگ به نسبت 1:4000 و همچنین پادتن پلی­کلونال اختصاصی ipaD به نسبت 1:200 استفاده شد. در فاصلۀ هر مرحله شستشو با بافر PBS-T سه مرتبه و هر بار به مدت 5 دقیقه انجام گرفت. همچنین از آنزیم کانژوگه آلکالین فسفاتاز و سوبسترای BCIP/NBT برای آشکارسازی نوار (باند) مربوط به پروتئین نوترکیب استفاده شد (بر پایۀ دستورکار شرکت Abcam).

جدول1. توالی آغازگرهای مورد استفاده برای کاست ژنی ipaD-stxB

Table1. Primers used for gene cassette ipaD-stxB

شکل 1. نمای کلی سازۀ بیانی باکتریایی

Fiqure 1. Schematic of bacterial expression construcl

جدول 2. چرخۀ حرارتی انجام‌شده برای واکنش SOEing PCR

Table2.Thermal cycles for SOEing PCR

بیان موقت سازۀ ژنی در گیاه کاهو

طراحی آغازگر و ساخت سازۀ گیاهی

با توجه به ترادف ژن توالی کدکنندۀ ipaD  و stxB طراحی آغازگر با روش گلدن برید 2006 (Orzaez) انجام و توسط شرکت سیگما ساخت شد (جدول 3).

جدول3. توالی آغازگرهای مورد استفاده برای کاست ژنی ipaD-stxB برای انتقال موقت به گیاه کاهو

Table3. Primers used for gene cassette ipaD-stxB for transient expression to lettuce

                                           Sequenc                                                                                                                                Name  

همسانه‌سازی محصول PCR و ساخت سازۀ گیاهی به روش Golden Braid

همسانه‌سازی در ناقل Universal Domesticator

پس از انجامPCR ، بازیابی محصول PCR با استفاده از دستورکار کیت شرکت کیاژن انجام شد. همسانه‌سازی محصول PCR در پلاسمید  pUPD2(شکل 4-الف) با دستورکار کیت گلدن برید انجام شد (Orzaez, 2016).

ساخت واحدهای بیانی در ناقل سطح آلفا

واحدهای بیانی متشکل از راه‌انداز، توالی کننده و پایان‌دهنده است که در ناقل­ pDGB سطح آلفا همسانه‌سازی می­شوند. درواقع ناقل UD حاوی توالی مورد نظر که از لحاظ توالی نیز تأیید شده­اند به‌عنوان الگو برای واکنش GB-BsaІ و ساخت واحدهای بیانی استفاده می‌شدند (شکل 4-ب). الحاق نهایی به پلاسمید pDGB3Ω1 (شکل 4-ج) با دستورکار کیت گلدن برید Orzaez (2006 ) انجام شد.

شکل 4. نمای کلی ساخت سازۀ گیاهی

Figure 4. Schematic of plant vector

مواد گیاهی مورد استفاده

در این تحقیق از گیاه کاهوی ایرانی رقم  TN-96-39(تهیه‌شده از بانک ژن گیاهی ایران) برای انتقال موقت و بررسی بیان پادگن­ها استفاده شد. بذرهای کاهو در محیط 1/2MS در دورۀ 16/8 روشنایی/ تاریکی قرار گرفتند. برای همسانه­سازی از باکتری Escherichia coli سویۀ DH5a و برای انتقال سازه­ها به گیاه از Agrobacterium tumefaciens سویۀ C58 استفاده شد.

انتقال موقت سازۀ ژنی به گیاه

سازۀ­ ژنی بهAgrobacterium tumefaciens  سویۀ C58 به روش انجماد و ذوب منتقل شد (Wang, 2015 ). برای انتقال به گیاه، محیط اینفیلتراسیون کاهو با دستورکار Kapila et al., 1997)) آماده و پس از دو ساعت نگهداری آگروباکتریوم در محیط اینفیلتراسیون، انتقال به برگ­های کاهو تحت خلأ انجام شد. برگ­ها به مدت 3 روز در تاریکی و دمای 22 درجۀ سلسیوس نگهداری شدند و پس‌ازآن نمونه­های گیاهی در نیتروژن مایع فریز و تا زمان استفاده در دمای 70- درجۀ سلسیوس ذخیره شدند.

تأیید پروتئین نوترکیب در کاهو با آزمون الایزا

از نمونه­های انتقال موقت استخراج پروتئین انجام
(Guy et al., 1992) و بر پایۀ روش Bradford, 1976)) تعیین غلظت پروتئین­ها صورت گرفت. روش کار با دستورکار (Engvall & Perlmann, 1971) انجام شد.

استخراج RNA ، ساخت cDNA و شرایط واکنش PCR

برای ارزیابی نمونه­های انتقال موقت کاهو در سطح RNA، استخراج از نمونه­های گیاهی در سه تکرار زیستی با استفاده از کیت استخراج RNA با دستورکار شرکت دنازیست انجام شد. تیمار با DNaseI و ساخت cDNA با استفاده از کیت شرکت تاکارا و با دستورکار آن شرکت انجام گرفت. آغازگرهای مورد استفاده بنا بر جدول 4 بوده است.

جدول 4. توالی آغازگرهای مورد استفاده در ارزیابی بیان موقت پروتئین نوترکیب.

Table4. Primers used for qRT-PCR

بررسی بیان ژن نسبی در سطح رونویسی

برای بررسی پادگن IpaD در سطح رونویسی، پس از 72 ساعت از اینفیلتراسیون، استخراج RNA با استفاده از کیت شرکت دنازیست برای گیاه تراریخت (بیان موقت) و گیاه شاهد (بدون سازۀ مورد نظر) در سه تکرار زیستی انجام شد. نمونه­های cDNA با استفاده از کیت ساخت cDNA شرکت تاکارا و بر پایۀ دستورکار مربوطه ساخته شد. به‌منظور اجزای واکنش RT-PCR واکنش به حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل 4 میکرولیتر کیت 5X HOT FIREPol حاوی اواگرین، µM 4/0 آغازگر پیشرو، µM 4/0 آغازگر پسرو و 600 نانوگرم cDNA بود. برای نرمال­سازی نتایج ژن مرجع اکتین استفاده شد. تجزیۀ نتایج با استفاده از نرم‌افزار REST2009 حضور رونوشت پادگن IpaD را در گیاه کاهو تأیید می کند. آغازگرهای اختصاصی و آغازگرهای ژن خانه‌دار اکتین در جدول 4 ارائه شده است.

نتیجه‌گیری و بحث

هضم ناقل (pET28a(+))

پلاسمید نوترکیب به باکتری E. coli Bl21DE3 انتقال داده شد. به‌منظور تأیید حضور قطعه در ناقل بیانی از هضم آنزیمی توسط آنزیم با اثر محدود BamHІ استفاده شد که در این حالت ژن ipaD  که حدود 320 جفت باز طول دارد، از ناقل خارج شد (شکل3).

افزایش و الحاق قطعه‌های ژنی ipaD+stxB با روش سوئینگ پی سی ار

نتایج به‌دست‌آمده از افزایش ژن ipaD-stxB با استفاده از آغازگرهای اختصاصی در شکل 2 نشان داده شده است. قطعۀ 539 جفت بازی به‌دست‌آمده از انجام SOEing PCR با آنزیم Pfu روی ژل آگارز تأییدی بر درستی افزایش قطعۀ مورد نظر است.

الف                                    ب                                          ج

شکل 2. امتزاج توالی کدکنندۀ پادگن  ipaD و stxB با روش  SOEing PCRالف) تکثیر قطعۀ ژنی ipaD ب) افزایش قطعۀ ژنی stxB ج) تکثیر قطعه‌های ژنی ipaD و stxB با سوئینگ پی سی آ، چاهک شماره 1 قطعۀ ژنی به‌دست‌آمده از ترکیب ipaD و stxB، چاهک شماره 2 افزایش قطعۀ ژنی ipaD ، چاهک شماره 3 افزایش قطعۀ ژنی stxB و M  نشانگر DNA 100 جفت بازی.

Figure 2. Fusion of ipaD and stxB by SOEing PCR.  A: Amplification of stxB, B: Amplification of ipaD, C:Amplification of ipaD + stxB by SOEing PCR, lane 2 amplification of ipaD, lane 3 amplification of stxB and M molecular size marker 100bp. Agarose gel 1%.

شکل3. هضم ناقل بیانی + STxB pETipaD با آنزیم BamHІ .ستون­های  1 و 2پلاسمید هضم شده. ستون‌های 3 و 4 پلاسمید. ستون 5 نشانگر DNA 100جفت بازی.

Figure3. Digestion of expression vector pETipaD+stxB with BamHІ enzyme. Colomns 1 and 2; digested plasmids. Colomns 3 and 4; plasmids (control). Colomn 5; molecular size marker 100bp.

نتایج بیان پروتئین­های نوترکیب در E. coli سویۀ Bl21 (DE3)

پس از بیان اولیۀ پروتئین­های نوترکیب در باکتری و مقایسۀ زمان­های مختلف نمونه­برداری، زمان 4 ساعت پس از القا برای نمونه­برداری در نظر گرفته شد. نتایج الگوی نواری پروتئین­های نمونۀ­ شاهد (باکتری بدون ناقل) و مقایسه با پروتئین­های تولیدشده از باکتری­ حاوی سازۀ معرفی‌شده در شکل (5)، نشان داده شده است. پروتئین ناشی از القای باکتری BL21 حاوی سازۀ pETipaD-stxB در حالت غیرالقایی، القاشده با IPTG و همچنین نمونه پروتئین حاصل از باکتری شاهد (بدون سازه) استخراج و روی ژل اکریلامید جداسازی شدند. الگوی پروتئین­های تولیدی از هر استخراج مشاهده می­شود. همچنین پروتئین خالص با وزن مولکولی 24.5 کیلودالتون در محدودۀ وزنی مورد انتظار روی ژل مشاهده شد. همچنین نتیجۀ تخلیص پروتئین­های نوترکیب حاصل از عصارۀ پروتئینی باکتری حاوی سازۀ موردنظر که با استفاده از روش فام‌نگار جذبی Ni-NTA آگارز به دست آمد، در شکل 5 مشاهده می­شود. نتایج به‌دست‌آمده با نتایج (Honari et al., 2013) همخوانی داشت.

شکل 5-. بیان پروتئین نوترکیب ipaD+stxB  در باکتریBL21 . چاهک  شماره 1 نمونۀ شاهد (باکتری بدون القا)، شماره­های 2 ، 3 و 4(نمونه‌برداری در زمان‌های 1 ، 2 و 4 ساعت پس از القا، پروتئین کل)، چاهک شماره 5 نمونۀ شاهد (باکتری بدون القا)، شماره‌های 6، 7 و 8 ( نمونه­برداری در زمان­های 1، 2 و 4ساعت پس از القا، پروتئین محلول). در هر دو حالت (پروتئین کل و پروتئین محلول) پروتئین با وزن مورد انتظار در موقعیت 24.5کیلودالتون نشانگر پروتئینی مشاهده شد. حرف M نشانگر اندازۀ پروتئینی See Blue(NuPAGE)MES است.

Figure5. Expression of recombinant protein ipaD+stxB in BL21. Colomn 1;  control,  colomns 2, 3 and 4; sampling 1, 2 and 4h after induction(total protein), colomn 5; control, colomns 6, 7 and 8; samplying 1, 2 and 4h after induction(soluble protein). M marker size protein (Blue) (SDS PAGE 12%).

شکل 6. خالص‌سازی پروتئین نوترکیب ipaD+stxB بیان شده در باکتری BL21. ستون1 شاهد (باکتری بدون سازه)، حرف M نشانگر اندازۀ پروتئینی Unstained Protein marker Fermentas، ستون2و3 باکتری حاوی سازۀ مورد نظر پیش از تخلیص، ستون 4باکتری حاوی سازۀ موردنظر پس از خالص‌سازی با روش فام‌نگاری جذبی Ni-NTA آگارز.

Figure 6. Puridication of recombinant protein ipaD+ stxB expressed in BL21. Colomn 1; control, M marker size protein. Colomns 2 and 3; bacterial extract before purification; colomn 4; bacteri after purification with Ni-NTA agaros absorbtion choromotograpghy (SDS PAGE 12%).

نتایج بررسی پروتئین­های نوترکیب باکتری با استفاده از آزمون الایزا

بررسی واکنش پادگن تولیدی حاصل از سازۀ (شکل 7-الف) در E.coli، با استفاده از پادتن آنتی­هیستیدین­تگ و همچنین پادتن اختصاصی پادگن از آزمون الایزا[4] انجام شد. نتایج به‌دست‌آمده از آزمون الایزا به دو صورت کیفی و کمّی ارائه شد. در گزارش نتایج به‌صورت کیفی، تنها تفاوت میزان جذب نمونۀ حاوی پروتئین نوترکیب و میزان جذب حاصل از نمونۀ شاهد در طول‌موج 450 نانومتر با هم مقایسه شدند. در آزمون کمّی از نمودار استاندارد استفاده شد. به این منظور از مقادیر مختلف پادگن خالص در آزمون الایزا استفاده و میزان جذب در 450 نانومتر به دست آمد. با استفاده از میزان پادگن خالص و میزان جذب در 450 نانومتر، نمودار استاندارد ترسیم و معادلۀ خط به دست آمد (شکل 7-ب). از این معادلۀ خط برای برآورد میزان برآوردی پروتئین نوترکیب موجود در پروتئین باکتری استفاده شد تا نتیجه آزمون به‌صورت کمّی قابل ارائه باشد. نتایج بررسی روی پروتئین کل باکتریBL21 حاوی سازۀ pETipaD-stxB نشان داد، میزان جذب به‌دست‌آمده از آزمون الایزا در نمونه­های پروتئین کل حاصل از باکتری­های حاوی سازه و پروتئین کل شاهد تفاوت معنی­داری دارند (شکل6-الف)، که این تفاوت تولید پروتئین نوترکیب و قابلیت برهمکنش با پادتن مونوکلونال آنتی­هیستیدین­تگ را نشان می­دهد. بنابراین برای 6 میکروگرم پروتئین کل مورد استفاده در آزمون 87/54 درصد پادگن محاسبه شد. نتایج به‌دست‌آمده با نتایج (Shokrian Hajibehzad et al., 2016) (Honari et al., 2013) همخوانی داشت.

برای بررسی وجود پادگن ipaD-stxB در پروتئین کل حاصل از سازۀ pETipaD-stxB، آزمون الایزا با استفاده از پادتن اختصاصی ipaD انجام شد. نتیجۀ این آزمون که با استفاده از چهار تکرار زیستی و دو تکرار فنی و چهار میزان متفاوت پروتئین کل به دست آمد نشان داد، بین نمونه­ها و شاهد تفاوت معنی­داری از نظر میزان جذب در طول‌موج 450 نانومتر وجود دارد (شکل 7-الف)، بدون در نظر گرفتن درصد پادگن تولیدی می­توان گفت که معنی­دار شدن تفاوت نمونه­ها و شاهد، دست‌کم گویای تولید پروتئین نوترکیب در باکتری با قابلیت واکنش با پادتن است. همچنین نتایج بیان باکتریایی پروتئین­ نوترکیب، نشان داد که وجود اجوان stxB احتمال دارد سبب نامحلول شدن پروتئین نوترکیب شود و این ویژگی می­تواند سهم پادگن را در پروتئین کل افزایش دهد زیرا نامحلول شدن پروتئین­ها امکان دور ماندن از دسترس پروتئازها را فراهم می­کنند (Aboei Mehrizi et al., 2016).

تأیید پروتئین­های نوترکیب باکتریایی با استفاده از آزمون وسترن بلاتینگ

برای تأیید پروتئین نوترکیب حاصل از سازه­های باکتریایی در E.coli، آزمون وسترن بلات انجام شد. نتیجۀ این آزمون برای پروتئین­ حاصل از سازۀ pETipaD-stxB که با استفاده از پادتن آنتی هیستیدین­تگ (شکل 8-ب) و پادتن اختصاصی (شکل 8-ج) انجام شد در شکل (8) ارائه شده است.

الف                                                                                                        ب

شکل 7. آزمون الایزا برای پروتئین نوترکیب ipaD+ stxB در باکتری BL21 الف) مقایسۀ میزان جذب در طول‌موج 450 نانومتر برای پروتئین شاهد (بدون سازه) و پروتئین باکتری BL21 حاوی سازه در آزمون الایزا با استفاده از پادتن اختصاصی ipaD. ب) معادلۀ خط حاصل از این نمودار استاندارد برای برآورد میزان پادگن ipaD-stxB در پروتئین کل مورد ارزیابی استفاده شد.

Figure7. ELISA for recombinant protein expressed in BL21. A) absorbtion in 450 nm  with polyclonal antibody against ipaD. B) Standard curve for ipaD used polyclonal antibody against ipaD as a first antibady.

د                 الف                                   ب                                             ج                           

شکل 8. آزمون وسترن بلات برای تأیید پروتئین­ نوترکیب  ipaD+ stxB در باکتری الف) شماره­ 1 شاهد (بدون سازه) شماره 2 (پروتئین ipaD) و شماره 3 (پروتئین ipaD-stxB). حرف M مارکر پروتئینیPrestained protein ladder10-170 ب) وسترن بلات با پادتن آنتی هیستیدین تگ ج) وسترن بلات با پادتن اختصاصی ipaD. د)شماره 1 (پروتئین ipaD-stxB) شماره 2 (پروتئین ipaD) و حرف M نشانگر پروتئینی.

Figure8. Westhern blotting for confirm expression of recombinant protein in bacteria. A) Colomn 1; control (Bacteria without construct), colomn 2; ipaD protein and colomn 3; ipaD+stxB protein. M; marker size ladder. B) Westhern blotting with anti tagged histidin C) westhern blotting with polyclonal antibody against ipaD. D) Colomn 1; ipaD+stxB protein; colomn 2; ipaD.

بنا بر نتایج به‌دست‌آمده در این تحقیق میزان جذب به‌دست‌آمده از آزمون الایزا در نمونه­های پروتئین کل به‌دست‌آمده از باکتری­ حاوی سازه و پروتئین کل شاهد تفاوت معنی­داری دارند، که این تفاوت تولید پروتئین نوترکیب و قابلیت برهمکنش با پادتن را نشان می­دهد. همچنین در روش لکه‌گذاری وسترن در ناحیۀ موردنظر ستونی که باکتری­های واجد سازه قرار گرفته بود نوار مشاهده شد. نتایج بررسی‌های (Honari et al., 2015) نشان داد، با ترکیب کردن ipaD-stxB میزان عیار (تیتر) پادتن و ایمنی‌زایی در حیوان آزمایشگاهی افزایش می­یابد. تولید پروتئین نوترکیب ipaD-stxB می­تواند به ایمنی‌زایی در برابر شیگلوز کمک کرده و روزنه­ای برای تولید واکسن نامزد ایجاد کند.

تأیید پروتئین نوترکیب در کاهو با آزمون الایزا

تولید پروتئین­ها در سامانۀ بیان موقت یکی از سازوکار­های مهم در بررسی بیان پروتئین­های تولیدشده و بررسی میزبان مناسب برای بیان پروتئین نوترکیب است. در این تحقیق پس از استخراج پروتئین از برگ­های اینفیلتره شده گیاه کاهو ( تجاری ) آزمون الیزا انجام شد. در این تحقیق از سه تکرار برای گیاهان تراریخت و سه تکرار برای گیاه شاهد استفاده شد و نتایج به‌دست‌آمده از رنگ تولیدشده تجزیۀ آماری شد. همۀ نتایجی که بیان می‌شود پس از تجزیۀ آماری با نرم‌افزار SPSS در سطح احتمال 95 درصد معنی‌دار شدند. در شکل 9-الف مقایسه بین میزان جذب و میزان پادگن در گیاه کاهو و همچنین در نمونۀ شاهد ارائه شده است. در نظام انتقال موقت عامل‌های مختلفی از جمله شمار روز پس از اگرواینفیلتراسیون تا زمان نمونه‌برداری بر میزان بیان پروتئین نوترکیب تأثیر دارد، بنابراین در 2 تا 3 روز پس از اگرواینفیلتراسیون بیشترین بیان پروتئین مشاهده شده و پس‌ازآن کاهش می­یابد (Choi et al., 2008).

                                                     لف                                                                              ب

شکل 9. آزمون الایزا برای پروتئین نوترکیب ipaD+stxB در گیاه کاهو الف) مقایسۀ میزان جذب در طول‌موج 450 نانومتر برای گیاه شاهد (بدون سازه) و گیاه حاوی پروتئین نوترکیب با استفاده از پادتن اختصاصی ipaD  ب) معادلۀ خط به‌دست‌آمده از این نمودار استاندارد برای برآورد میزان پادگن ipaD-stxB در پروتئین کل مورد ارزیابی استفاده شد.

Figure9. ELISA for recombinant protein ipaD+stxB expressed in lettuce. A) absorbtion in 450 nm with ipaD polyclonal antibody B) Standard curve for ipaD+stxB used ipaD polyclonal antibody.

به‌منظور ترسیم نمودار استاندارد از پروتئین خالص ipaD غلظت­های مختلف استفاده شد و بر پایۀ رابطۀ غلظت پادگن خالص و میزان جذب به‌دست‌آمده از نمونه در طول‌موج 450 نانومتر، نمودار استاندارد و معادلۀ خط مربوط به آن به دست آمد. در شکل 9-الف میزان جذب نمونه­های بیان موقت در طول‌موج 450 نانومتر با هم مقایسه شده­اند. در ادامه به کمک معادلۀ خط به‌دست‌آمده از نمودار استاندارد (شکل 9-ب)، میزان جذب نمونه­ها در طول‌موج 450 نانومتر به میزان پادگن تبدیل و میزان پروتئین نوترکیب به‌دست‌آمده از بیان موقت نمونه­های برگی کاهو بر پایۀ درصد پادگن تولیدی نسبت به پروتئین کل (%TSP)[5] محاسبه شد. میزان درصد پادگن نسبت به پروتئین کل محلول حدود 25/0 درصد برآورد شده است.

نتیجۀ بررسی بیان ژن در سطح رونویسی

به‌منظور بررسی بیان ژن­ها برای انتقال موقت سازۀ گیاهی از qRT-PCR استفاده شد. در شکل 10 واکنش PCR برای انتقال موقت سازه با استفاده از آغازگرهای ipaD روی سه تکرار زیستی برای کاهو و نمونۀ­ شاهد (نمونۀ برگی غیرتراریخته) انجام شد. چنانچه در تصویر ژل مشاهده می­شود نوار مربوط به قطعۀ ipaD تنها در سه تکرار زیستی کاهو مشاهده می­شود و کنترل منفی شامل نمونه­ شاهد، نواری را نشان نداد.

شکل 10. RT-PCR با آغازگرهای اختصاصی ژن ipaD به‌منظور تأیید رونویسی از روی توالی کدکنندۀ ipaD روی نمونه­های کاهو پس از اگرواینفیلتراسیون )ژل آگارز یک درصد( چاهک شماره 1 شاهد )کاهو) ، شماره2، 3و 4 گیاه کاهو بیان‌کنندۀ پادگن ipaD. M نشانگر اندازۀ مولکولی DNA Ladder, 100 bp Plus, Sinaclon.

Figure10. RT-PCR with specific primers of ipaD for confirm transcription of ipaD in lettuce after agroinfiltration. Colomn 1; control, colomns 2, 3 and 4; transient expression. M molecular size ladder 100 bp. Sinacolon (Agaros gel 1%).

شکل 11. بیان نسبی ipaD اندازه‌گیری‌شده با q-RT-PCR  در برگ کاهو.

Figure11.Relative expression ipaD measured via q-RT-PCR in lettuce leaves.

(Pourseyedi et al., 2009) در نتایج بررسی‌های خود نشان دادند، یونجه و توتون در مقایسه با کاهو قابلیت و ظرفیت (پتانسیل) بیشتری برای تولید پروتئین‌های نوترکیب دارند. بافت برگی کاهو محتوای آب بالایی دارد و پروتئین­ها در این شرایط پایداری خوبی نداشته و تجزیه می­شوند به همین دلیل میزان بیان در کاهو پایین است (Hefferon, 2009). کاهو به دلیل میزان اندک آلکالوئید­های مختلف در بافت برگی و هزینه­های پایین‌دستی کم برای تولید پروتئین­های نوترکیب بسیار مورد توجه است (Negrouk et al., 2005).

نتیجه‌گیری کلی

نتیجۀ به‌دست‌آمده از بیان پروتئین نوترکیب ipaD-stxB در باکتری، پروتئینی با وزن مولکولی 24.5 کیلودالتون در محدودۀ وزنی مورد انتظار روی ژل­اکریل­امید نشان داد. آزمون الایزا تفاوت معنی‌داری را بین نمونه­های پروتئین کل به‌دست‌آمده از باکتری­های حاوی سازه و پروتئین کل شاهد (باکتری­های بدون سازه) نشان داد که بیانگر تولید پادگن و قابلیت برهمکنش آن با پادتن پلی کلونال ipaD است. برحسب برآورد، پادگن تولیدی 87/54 درصد پروتئین کل باکتری را به خود اختصاص داده است. لکه‌گذاری وسترن با پادتن پلی کلونال ipaD و پادتن اختصاصی مونوکلونال آنتی هیستیدین تگ تولید پروتئین نوترکیب را تأیید کرد. سازۀ­ ساخته‌شده برای تولید پادگن ipaD+stxB در گیاه با انتقال موقت به کمک آگروباکتری به کاهو در سطح RNA با استفاده از RT-PCR و در سطح پروتئین با آزمون الایزا تأیید شد. همچنین با ترسیم نمودار استاندارد با استفاده از پادگن خالص ipaD و کمّی کردن نتایج آزمون الایزا، مشخص شد، درمجموع پروتئین نوترکیب 25/0 درصد پروتئین محلول کل برگ کاهو را به خود اختصاص داده است. مقایسۀ سامانۀ بیانی باکتری و گیاه نشان‌دهندۀ میزان بالای تولید پادگن (87/54 درصد پروتئین کل) در باکتری نسبت به گیاه (25/0 درصد پروتئین محلول کل برگ) است. اما تولید و بیان پروتئین نوترکیب در گیاه به‌منظور تولید واکسن گیاهی خوراکی اهمیت دارد.

سپاسگزاری

بدین‌وسیله از اعضاء هیئت علمی و کارکنان گروه زراعت و اصلاح نباتات پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، که امکانات اجرای این طرح را فراهم نمودند قدردانی می­شود.

REFERENES

1. Aboei Mehrizi, F. A., Abbasi, A., Honari, H. & Alizadeh, H. (2016). The use of viral translation enhancer and suppressor of gene silencing 2b to construct binary vector for high expression of protective antigen and lethal factor of the bacteria that cause anthrax.‏ Iranian Journal of Crop Sciences,47(3), 353-366.(In Farsi).
2. Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N. & Nagamune, T. (2001). Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein engineering, 14(8), 529-532.‏
3. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, 72(1-2), 248-254.‏
4. Choi, M. S., Yoon, I. S., Rhee, Y., Choi, S. K., Lim, S. H., Won, S. Y., ... & Lomonossoff, G. (2008). The effect of Cucumber mosaic virus 2b protein to transient expression and transgene silencing mediated by agro-infiltration. Plant Pathol J, 24, 296-304.‏
5. Commandeur, U., Twyman, R. M. & Fischer, R. (2003). The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet, 5(110), 1-9.‏
6. Daniell, H., Streatfield, S. J. & Wycoff, K. (2001). Medical molecular farming: Production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. Trends in plant science, 6(5), 219-226.‏
7. Engedal, N., Skotland, T., Torgersen, M. L. & Sandvig, K. (2011). Shiga toxin and its use in targeted cancer therapy and imaging. Microbial biotechnology, 4(1), 32-46.‏
8. Engvall, E. & Perlmann, P. (1971). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 8(9), 871-874.‏
9. Guy, C., Haskell, D., Neven, L., Klein, P. & Smelser, C. (1992). Hydration-state-responsive proteins link cold and drought stress in spinach. Planta, 188(2), 265-270.‏
10. Hefferon, K. L. (2009). Biopharmaceuticals in plants: toward the next century of medicine. CRC Press.
11. Hiatt, A., Caffferkey, R. & Bowdish, K. (1989). Production of antibodies in transgenic plants. Nature, 342(6245), 76-78.‏
12. Honari, H., Amlashi, I., Minaei, M. E., & Safaei, S. (2013). Immunogenicity in guinea pigs by IpaD-STxB recombinant protein. Arak Medical University Journal (AMUJ), 4 (73), 84 - 93. (In Farsi).
13. ‏Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M. & Angenon, G. (1997). An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant science, 122(1), 101-108.
14. Kapusta, J., Modelska, A., Figlerowicz, M., Pniewski, T., Letellier, M., Lisowa, O. & Legocki, A. B. (1999). A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus. The FASEB Journal, 13(13), 1796-1799.
15. Lamphear, B. J., Jilka, J. M., Kesl, L., Welter, M., Howard, J. A., Streatfield, S. J. (2004). A corn- based delivery system for animal vaccines: An oral transmissible gastroenteritis virus vaccine boosts lactogenic immunity in swine. Vaccine, 22(19), 2420-2424.
16. Li, J., Chen, M., Liu, X. W., Zhang, H. C., Shen, F. F. & Wang, G. P. (2007). Transient expression of an active human interferon-beta in lettuce. Scientia Horticulturae, 112(3), 258-265.‏
17. Ma, J. K., Drake, P. M. & Christou, P. (2003). The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics, 4(10), 794-805.‏
18. Nezhad moghadam, M. R. Modaresi, M. H. Bababshamsi, M. & Chanankhah, M. (2006). Streptokinase, extraction, cloning and expression of high recombinant active protein by the simplification approach in the purification process. Research in medicine. 30(3), 245-252. (In Farsi).
19. Niyogi, S. K. (2005). Shigellosis. Journal of microbiology (Seoul, Korea), 43(2), 133-143.
20. Obembe, O. O., Popoola, J. O., Leelavathi, S. & Reddy, S. V. (2011). Advances in plant molecular farming. Biotechnology advances, 29(2), 210-222.‏
21. Orzaez, D. (2016). lab Golden Braid 3.0 kit.
22. Pourseyedi, S., Hashemi Sohi, H., Omidi, M., Ghoreshi, S. A., Boushehri, S. N. & Jourabshi, E. (2009). Transient expression of VP2 gene of very virulent IBDV in tobacco, Alfalfa and lettuce leaves by agroinfiltration. Veterinary Journal.‏83, 18-25. (In Farsi).
23. Russell Sambrook, J. (2001). Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edn. Coldspring Harbour.‏
24. Shokrian Hajibehzad, S., Honari, H., Nasiri, J., Mehrizi, F. A. & Alizadeh, H. (2016). High-level transient expression of the N-terminal domain of IpaD from Shigella dysenteriae. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 52(3), 293-302.‏
25. Sun, H. J., Cui, M. L., Ma, B. & Ezura, H. (2006). Functional expression of the taste‐modifying protein, miraculin, in transgenic lettuce. FEBS letters, 580(2), 620-626.‏
26. Twyman, R. M., Stoger, E., Schillberg, S., Christou, P. & Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: Host systems and expression technology. TRENDS in Biotechnology, 21(12), 570-578.‏
27. Wang A. & Ma S (2012) Molecular farming in plants: Recent advances and future prospects: Springer.
28. Wang, K. (2015). Agrobacterium Third edition, Methods in molecular biology 1223, Humana press.
29. Zuo, X., Zhang, X., Shan, L., Xiao, C., He, D. & Ru, B. (2000). Expression of human intestinal trefoil factor (hITF) gene in lettuce. Acta Botanica Sinica, 43(10), 1047-1051.‏

[1] -Shigella                                                               

[2] -Immunogen

[3]- Bioneer

[4]- Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

[5]- Total soluble protein (%TSP)