مقدمه

کبد از جمله اندام‌هایی است که در دوره جنینی خیلی زود و بلافاصله بعد از قلب، شروع به شکل­گیری می­کند (24). جوانه کبدی در سمت شکمی، از اندودرم روده جلویی جنینی در اثر القا سلول­های مزودرمی ناحیه کبدی-قلبی بیرون می­زند. این جوانه شامل سلول‌های زایایی است که طناب­های سلولی هپاتوسیت­ها ایجاد می‌کنند. کبد دو منشا اندودرمی و مزودرمی دارد (3،18،21). در مرحله دوازده جنین جوجه، جوانه کبدی از روده پیشین جنینی به وجود می­آید و در مرحله چهارده به سمت مزودرمی که ماتریکس کبد را می­سازد، پیشروی می­کند (3،13). رشد جوانه کبدی به سمت تیغه عرضی و نفوذ به داخل آن موجب القا کبد توسط سلول‌های مزانشیمی آن ناحیه می‌شود.  در نتیجه این القا، سایر اجزا کبد مثل بافت همبند، اندوتلیوم، کوپفر و سلول­های خون ساز نیز به وجود می­آیند. هپاتوسیت­ها که با آرایش طنابی در کنار هم قرار می­گیرند، از سلول‌های بزرگ اندودرمی جوانه کبدی متمایز می‌شوند (21). جوانه به دو انشعاب جلویی و عقبی تقسیم می­شود که به ترتیب در سمت چپ و راست داکتوس ونوزوس قرار می­گیرد (10). قسمت جلویی این جوانه، کبد و درخت مجاری صفراوی داخل کبدی و بخش عقبی آن کیسه صفرا و مجاری صفراوی خارج کبدی را به وجود می­آورد (18).

روند بافت­زایی کبد در پستاندارانی مثل موش صحرایی، سگ و شتر یک کوهانه بررسی شده است (1،12،19). این مطالعه در بین پرندگان در مرغ به روش­های مختلف و تعداد فراوان انجام شده است (5،7،16،25،26). کبد سایر پرندگان مانند بلدرچین (8)، بوقلمون (20)، بلدرچین ژاپنی (4) و کبک (14) نیز از نظر هیستوژنز مورد بررسی قرار گرفته­اند، اما تا کنون مطالعه­ای بر روی روند بافت­زایی کبد قرقاول صورت نگرفته است.

مطالعه روند بافت­زایی اندام­های مختلف در دوره­ی جنینی اطلاعات پایه‌ای در مورد زمان رخداد اتفاقات بافت­‌زایی هر اندام در اختیار قرار می­دهد. اطلاع از زمان دقیق رخدادهای بافت­زایی به عنوان دانش ضروری برای مطالعاتی که در آن­ها نقش ژن­ها و مولکول­های پروتئینی در هیستومورفوژنز هر اندام بررسی می­شود، مطرح می­باشند. به عبارت دیگر آگاهی از زمان دقیق دوره شکل­گیری و تغییرات عملکردی یک اندام در زمان جنینی، که به دوره­ی بحرانی معروف است، شرط اولیه برای بررسی نقش عوامل مولکولی ریخت­زا می­باشد.  از طرف دیگر اثر مواد مختلف خارجی بر روی شکل­گیری یک ارگان بایستی در دوره­ی بحرانی آن اندام بررسی شود. چرا که یک ناهنجاری­زا در صورتی بر روی اندام هدف خود جنین اثر می­گذارد که در دوره­ی بحرانی شکل‌گیری آن اندام به بدن جنین وارد شود (13،20).  به همین دلیل زمان، توالی و نحوه بافت­زایی اندام­های مختلف به طور جداگانه و در حیوانات مختلف بررسی شده است. این مطالعه که اولین پژوهش در تعیین روند بافت­زایی کبد در قرقاول می­باشد، مبنایی خواهد بود برای مطالعات آینده­ای که در حوزه­ی جنین شناسی تجربی بر روی مدل پرندگان انجام خواهد گرفت.

مواد و روش‌کار

60 قطعه تخم نطفه دار قرقاول از مزرعه تولید تخم قرقاول تهیه و در انکوباتور با درجه حرارت 5/37 درجه سانتیگراد و رطوبت 58 تا 62 درصد قرار داده شد. از روز 5 تا آخر دوره انکوباسیون در هر روز تعداد 3 قطعه جنین، پس از بررسی و اطمینان از زنده بودن آن‌ها، از انکوباتور خارج و از تخم های نطفه دار استخراج گردید. بدین منظور پوسته تخم‌ها، از سمت اتاقک هوا به وسیله پنس جدا و پرده‌های جنینی کنار زده شد و جنین خارج گردید. جنین‌ها توسط سرم فیزیولوژی در شیشه ساعت شستشو داده شدند. جنین‌های کوچک را به طور کامل در فرمالین بافر 10 درصد قرار دادیم اما در مورد جنین­های بزرگتر، پس از تشریح، کبد آن­ها جدا شده و در فرمالین بافر 10 درصد قرار گرفت. بعد از تثبیت بافت­ها، آن­ها را جهت پاساژ بافتی از فیکساتیو خارج کردیم. به جهت جلوگیری از آسیب نمونه­های کوچک از پاساژ دستی بهره گرفتیم. پس از انجام پاساژ بافتی از نمونه­ها توسط پارافین، بلوک تهیه و بعد از ثبت مشخصات آن­ها، به کمک میکروتوم (مدل ام آر 225، هیستولاین ایتالیا)، برش­های 5 میکرونی تهیه شد. در نهایت اسلایدهای مربوطه برای رنگ آمیزی آماده شدند. به منظور بررسی عمومی بافت کبد و سلول­های آن از رنگ آمیزی معمول هماتوکسلین ائوزین (H&E)، جهت بررسی ذخایر گلیکوژنی و زمان ظهور آن‌ها از رنگ آمیزی پریودیک اسید شیف (PAS) و برای مشاهده بهتر فضاهای پورت و بافت همبند از رنگ آمیزی تری کروم ماسون (TM) استفاده کردیم (17با تغییر). لازم به ذکر است به منظور پیدا کردن و رسیدن به کبد در نمونه­های کوچک و نیز بالا بردن دقت کار در تشخیص واکنش PAS در همه نمونه­ها، از تمام بلوکها برش­های سریالی تهیه گردید. در نهایت اسلایدهای به دست آمده توسط میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار گرفتند و از آنها به کمک دوربین تصاویر دیجیتال تهیه شد.

نتایج

روز5 انکوباسیون: یک ردیف سلول مکعبی از خارج کبد را پوشانده بود. در زیر آن هپاتوسیت‌ها با آرایش آسینی به چشم می‌خوردند. فضاهای بزرگ و بی قاعده‌ای در اطراف آن‌ها دیده می‌شد که دارای سلول‌های خونی نابالغ فراوان بودند. سلول‌های کبدی به دو شکل تیره و روشن وجود داشتند. سلول‌های تیره در نواحی مرکزی دارای هسته هتروکروماتین تر و سیتوپلاسم تیره‌تر بودند. هپاتوسیت‌های روشن در تمام نواحی کبد قابل مشاهده بودند اما با تراکم بیشتری در محیط کبد و در زیر بافت مکعبی قرار گرفته بودند. هسته آن‌ها مراحل مختلف تقسیم میتوز را نشان می­داد. کانالیکول­های صفراوی در بین هپاتوسیت­های مجاور رویت شدند. در رنگ آمیزی تری کروم هیچ کلاژنی در پارانشیم و نواحی محیطی کبد ردیابی نشد. واکنش به رنگ PAS (پاس) مثبت بود اما در برش­ها و قسمت­های مختلف کبد شدت متفاوتی داشت و به صورت خفیف تا شدید مشاهده شد (تصویر1).

روز 6 انکوباسیون: سلول­های مزوتلیال اطراف کبد در برخی نقاط به صورت سنگفرشی درآمده بودند. کمی از مقدار فضاهای بزرگ و بی قاعده کاسته شده بود. در این روز هم هنوز اثری از رشته کلاژن در زیر مزوتلیوم و پارانشیم کبد نبود. فقط معدودی از هپاتوسیت­های نواحی مرکزی کبد واکنش PAS مثبت خفیفی نشان دادند و در بقیه قسمت­ها این واکنش منفی بود (تصویر2).

روز 7 انکوباسیون: سلول­های کبدی در دسته­هایی به صورت آسینوسی در کنار هم قرار گرفته بودند و به تعداد کمتر طناب­های سلولی به چشم می خورد. کانالیکول­های صفراوی در بین این سلول­ها به وضوح دیده می­شدند. سلول­های روشن و در حال تقسیم میتوز در بین سلول­های تیره و با تراکم بیشتر در محیط کبد قابل مشاهده بودند. درون فضاهای بزرگ سینوزوئیدها، سلول­های خونی نابالغ به وفور یافت می­گردید. در دیواره سینوزوئیدها هسته سلول اندوتلیال رویت شد. واکنش به رنگ آمیزی پاس و تری کروم همانند روز قبل بود (تصویر3)

روز 8 انکوباسیون: مزوتلیوم در بیش تر قسمت­ها به صورت سنگفرشی مشاهده گردید و آرایش طنابی شکل هپاتوسیت­ها نیز افزایش یافته بود. سینوزوئیدها به اندازه­های بزرگ و کوچک به چشم می­خورد. میزان گلبول­های قرمز بالغ خون درحال افزایش بود. در این روز برای اولین بار تعداد کمی سلول کوپفر در دیواره سینوزوئیدها مشاهده شد. سیاهرگ­های مرکزی نیز در حال تشکیل و رویت بودند. همچنین در قسمتی از کبد ناحیه‌ای به شکل فضای پورت در حال شکل‌گیری بود که با رنگ آمیزی تری کروم قابل تشخیص بود. در منطقه بسیار کوچکی از قشر کبد در زیر مزوتلیوم، الیاف کلاژن بسیار ظریفی مشاهده شد. سلول­های روشن و درحال تقسیم در محدوده باریکی از محیط کبد به چشم می­خوردند. در مرکز نیز به تعداد خیلی کم سلول روشن در لابه لای سلول‌های تیره قرار داشتند. در این روز نیز کانالیکول­های صفراوی با وضوح زیادی دیده شدند و از نظر تعداد افزایش چشمگیری نشان دادند. واکنش پاس در روز هشتم نیز فقط در تعدادی از هپاتوسیت­های نواحی مرکزی کبد اندکی مثبت بود و در بقیه قسمت­ها هیچ گرانول قرمز رنگی مشاهده نشد (تصویر4).

روز9 انکوباسیون: مزوتلیوم به طور کامل سنگفرشی شده بود. در رنگ آمیزی تری کروم، کپسول گلیسون در برخی قسمت­های کبد دیده می‌شد.سلول­های روشن در حاشیه کبد همچنان به چشم می‌خوردند. فضاهای پورت و سیاهرگ­های مرکزی در حال کامل شدن و سینوزوئیدها در حال باریکتر شدن بودند. آرایش طنابی هپاتوسیت‌ها در اطراف سیاهرگ­های مرکزی رو به افزایش بود. در این روز برای اولین بار در سیتوپلاسم هپاتوسیت­های سراسر کبد، گرانول­های PAS مثبت واضحی مشاهده شد.

روز10 انکوباسیون: سلول­های کبدی با آرایش طنابی 2 ردیفه در اطراف سیاهرگ­های مرکزی قرار گرفته بودند. فضای سینوزوئیدها باریک­تر و منظم­تر از روز قبل بود. میزان سلول­های بالغ خونی نیز افزایش یافته بود. از تعداد سلول­های روشن به شدت کاسته شده بود و اکثر سلول­های مشاهده شده در پارانشیم کبد هپاتوسیت­های تیره بودند. تعداد سیاهرگ‌های مرکزی و سلول­های کوپفر افزایش داشت. کپسول گلیسون مشابه روز قبل در برخی قسمت­های کبد قابل مشاهده بود. واکنش به PAS نیز همانند روز قبل به شکل قوی و یکنواخت، در تمام قسمت­های حاشیه‌ای و مرکزی کبد مشاهده گردید.

روز 11 انکوباسیون: در محیط کبد سلول­های هپاتوسیت با آرایش آسینی مشاهده می‌شدند. برای اولین بار مجاری صفراوی در مجاورت فضای پورت مشاهده گردید. کپسول گلیسون نازکی، تقریباً به طور کامل بر روی سطح کبد تشکیل شده بود. در داخل پارانشیم کبد هم محل­های تشکیل فضاهای پورت با رنگ آمیزی تری کروم قابل ردیابی بود. واکنش به PAS نیز مثبت بود و در تمام هپاتوسیت­ها دیده می­شد (تصویر5).

روز12 انکوباسیون: تمام مشاهدات همانند روز قبل بود و رخداد جدیدی دیده نشد.

روز 13 انکوباسیون: سیاهرگ­های مرکزی با طناب­های دو ردیفه در اطراف آن­ها در پارانشیم متراکم­تر شده کبد، قابل مشاهده بودند. از تعداد سلول­های روشن به شدت کاسته شده بود و به ندرت در حاشیه رویت می­شدند و پارانشیم توسط سلول‌های تیره اشغال شده بود. تعداد سلول­های کوپفر بیشتری در این روز به چشم خورد. واکنش به رنگ پریودیک اسید شیف کاهش چشمگیری داشت به این ترتیب که از اندازه و تعداد گرانول­های پاس مثبت در هپاتوسیت­های تمام مناطق کبد، به شدت کاسته شده بود.

روز 14 انکوباسیون: فضای پورت به صورت واضحتر و به تعداد بیشتر رویت شد و سینوزوئیدها باز هم باریکتر شده بودند. واکنش PAS، همانند روز قبل بسیار خفیف بود (تصویر6).

روز 15 انکوباسیون: در این روز تغییر مشهودی به چشم نخورد و ساختارهایی مثل فضای پورت و سینوزوئیدهای باریک همانند روز قبل بود اما واکنش به PAS اندکی افزایش یافته بود.

روز 16 انکوباسیون: چیدمان سلول­های کبدی منظمتر شده بود و تعداد سیاهرگ­های مرکزی افزایش یافته و فضای پورت،  مجاری صفراوی و کانالیکول­ها واضح تر رویت گردید. واکنش PAS افزایش

یافته و نسبتاً قوی مشاهده شد و گرانول­های قرمز رنگ PAS مثبت در اندازه­های مختلف در اکثر هپاتوسیت­ها دیده شد (تصویر7).

 

 

 

تصویر1. روز پنجم جنینی، رنگ آمیزی PAS،  بزرگنمایی 400X،  1-سلول­های مکعبی، 2- غشا پایه، 3- سلول­های روشن، 4- گرانول­های پاس مثبت، 5- کانالیکول صفراوی، 6- فضاهای بزرگ و بی قاعده، 7- سلول­ های خونی نابالغ.

 

 

تصویر2. روز ششم جنینی، رنگ آمیزی تری کروم ماسون، بزرگنمایی X100-1-سلولهای مزوتلیال سنگفرشی 2-سلولهای مزوتلیال مکعبی.

 

 

تصویر3. روز هفتم جنینی، رنگ آمیزی H&E،  بزرگنمایی 400X. 1-سلول‌های خونی نابالغ  2- هپاتوسیت­ها با آرایش آسینی 3- کانالیکول صفراوی  4- سلول­های مزوتلیال مکعبی  5- سلول­های روشن.

 

 

تصویر4. روز هشتم جنینی، رنگ آمیزی H&E،  بزرگنمایی 100X. 1- سیاهرگ­های مرکزی با آرایش طنابی شکل هپاتوسیت­ها در اطراف آن­ها   2- سلول کوپفر  3- سلول اندوتلیال.

 

 

تصویر5. روز یازدهم جنینی، رنگ آمیزی H&E،  بزرگنمایی 400X. 1- طناب­های دو ردیفه هپاتوسیت ها  2- مجرای صفراوی  3- سلول کوپفر 4- سلول اندوتلیال.

 

 

تصویر6. روز چهاردهم جنینی، رنگ آمیزی H&E،  بزرگنمایی 400X. 1- کپسول گلیسون 2- طناب­های دو ردیفه هپاتوسیت­ها  3- فضای پورت.

 

 

تصویر7. روز شانزدهم جنینی، رنگ آمیزی H&E،  بزرگنمایی 100X. 1- فضاهای پورت 2- سیاهرگ­های مرکزی.

 

 

تصویر8. روز هجدهم جنینی، رنگ آمیزی تری کروم ماسون،  بزرگنمایی 40X. 1- پارانشیم کبد با سینوزوئیدها و هپاتوسیت­های متراکمی که به شکل بالغ خود رسیده اند 2سیاهرگ­های مرکزی  3- فضای پورت.

 

 

 

روز 17 انکوباسیون: تمام مشاهدات همانند روز قبل بود و رخداد جدیدی دیده نشد.

روز 18 انکوباسیون: پارانشیم کبد متراکمتر و آرایش سینوزوئیدهای اطراف سیاهرگ­های مرکزی منظمتر شده بود. همه ساختارهای کبد به شکل بالغ خود نزدیک شده بودند. کپسول گلیسون و فضاهای پورت به خوبی با رنگ آمیزی سبز تری کروم قابل مشاهده بودند. مجاری صفراوی به وضوح در فضاهای پورت رویت می­شدند. واکنش PAS هم همانند روز قبل قوی و مثبت بود و به صورت دانه های قرمز رنگی که در سیتوپلاسم اکثر هپاتوسیت‌ها پراکنده بودند، مشاهده شد (تصویر8).

روز 19 انکوباسیون: تمام مشاهدات همانند روز قبل بود و رخداد جدیدی دیده نشد.

روز 20 انکوباسیون: سینوزوئیدها، سیاهرگهای مرکزی، فضاهای پورت و تمام اجزاء کبد به آرایش بالغ خود رسیده بودند.

در این روز تقریباً سلول نابالغ خونی به چشم نخورد. واکنش PAS در اکثر قسمت­های کبد افت شدیدی داشت و در تعداد اندکی از هپاتوسیت­ها دیده می­شد.

روز 21 انکوباسیون: پارانشیم کبد بسیار متراکم بود و به ندرت عروق خونی با لومن بزرگ مشاهده شد. مثل روز قبل، واکنش به PAS بسیار خفیف بود.

روز 22 انکوباسیون: همه قسمت­های کبد در اوج تکامل خود بودند. تنها تفاوت نسبت به روز قبل افزایش واکنش PAS بود که گرانول­های ریز قرمز رنگ با پراکندگی یکنواخت، در تمام هپاتوسیت­ها مشاهده شد.

روز 23 انکوباسیون: همه اجزاء کبد مانند روز قبل به شکل بالغ خود دیده می­شدند و واکنش PAS هم مثبت قوی بود.

روز 24 انکوباسیون: در آخرین روز دوره انکوباسیون هم اتفاق جدیدی مشاهده نشد. زیرا کبد در روزهای قبل به شکل بالغ خود رسیده بود. واکنش PAS هم مثبت بود.

بحث