مقدمه

در طول دهه گذشته وقوع بیماری­های میکروبی ناشی از مواد غذایی نه تنها در کشورهای در حال توسعه دارای فقر بهداشتی، بلکه در کشورهای توسعه یافته با استاندارد بالای بهداشتی نیز رو به افزایش بوده است (17).

یکی از مهم­ترین میکروارگانیسم­های بیماری­زا (پاتوژن) در فرآورده­های گوشتی به ویژه آن‌هایی که طی تولید مکررا با دست تماس دارند، استافیلوکوکوس اورئوس (عامل مسمومیت غذایی استافیلوکوکال) می­باشد و در حال حاضر سلامت عمومی را در سراسر جهان به خطر انداخته است. در انسان، این باکتری در قسمت قدامی بینی بزرگسالان وجود دارد و در 20 تا 30 درصد از جمعیت انسانی به صورت دائم و پایدار و در 60 درصد افراد به صورت متناوب دیده می­شود. لذا افرادی که در مراکز تهیه، عمل­آوری و توزیع غذا فعالیت دارند، در صورت عدم رعایت مسائل بهداشتی قادرند باکتری را به غذا انتقال دهند (5).

باکتری استافیلوکوکوس اورئوس دارای توکسین­های مختلفی مانند لوکوسیدین، همولیزین و انتروتوکسین است، که در بیماری‌های غذازاد، انتروتوکسین از اهمیت زیادی برخوردار بوده و مصرف مواد غذایی آلوده به این توکسین موجب بروز مسمومیت غذایی می­گردد (4). از دلایل شیوع بالای مسمومیت استافیلوکوکی می­توان به وجود باکتری در پوست و مخاط کارکنان، مقاومت و رشد باکتری در محیط‌های قندی نمکی و از همه مهم­تر تولید انتروتوکسین مقاوم به حرارت اشاره کرد (18،‌ 15).

برای درمان اغلب عفونت­های ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس از داروهای بتالاکتام به خصوص نسل­های جدید سفالوسپورین­ها استفاده می­شود، اما افزایش سریع مقاومت به این داروها موجب ناموفق بودن درمان عفونت­های وابسته به این ارگانیسم شده است. اصلی­ترین مکانیسم مقاومت به داروهای بتالاکتام در استافیلوکوکوس­ها تولید آنزیم­های بتالاکتاماز و یا تغییر پروتئین­های دیواره (Penicillin Binding Proteins, PBPs) می­باشد که تمایل کاهش­یافته آن‌ها به دارو منجر به مقاومت وسیعی نسبت به پنی‌سیلین­های نیمه سنتزی، سفالوسپورین­ها و کارباپنم­ها می­شود. بتالاکتامازها به طور انتخابی حلقه بتالاکتام را باز می­کنند به نحوی که ساختار تغییر­یافته دارو نمی­تواند اتصال موثری با PBSها برقرار نماید و در نتیجه سنتز سلولی ادامه می­یابد (22) همبستگی بین مقاومت به پنی­سیلین در ایزوله­های بالینی استافیلوکوکوس اورئوس و تولید بتالاکتاماز، اولین بار در سال 1944 گزارش شد. طبق آمار، سویه­های مقاوم باکتری از میزان 5 درصد در سال 1946، به 50 درصد در سال 1950 و به بیش از 90 درصد تا سال 2000، رسیده است (7).

دو مکانیسم مقاومت اولیه در برابر بتالاکتام­ها در گونه‌های استافیلوکوکوس قابل توجه است: بیان آنزیم­های بتالاکتاماز کدگذاری شده توسط ژن blaZ و تولید پروتئین­های اتصال دهنده پنی­سیلین 2a که توسط ژن MecA کدگذاری شده است. شیوع مقاومت پنی‌سیلین در بیماری­های جانوری ناشی از استافیلوکوکوس اغلب به دلیل ژن blaZ است. ژن blaZ بخشی از اپران سه قسمتی bla است. اپران bla شامل blaZ، blaI و blaR1 است (10).

تست­های مختلفی برای ارزیابی محصولات بتالاکتاماز در استافیلوکوکوس­ها می­تواند انجام شود. یک روش کیفی برای جداسازی بتالاکتاماز، استفاده از دیسک­های Nitrocefin است. در این روش از سوسپانسیون­های باکتریایی در سرم فیزیولوژی بر روی این دیسک­ها استفاده می­شود و تغییر رنگ دیسک مورد بررسی قرار می­گیرد. یک روش دیگر، استفاده از تست میکروبیولوژیک clover leaf است. در این تست، بر روی محیط آگار مولر هینتون، یک سویه آکسفورد استافیلوکوکوس اورئوس، به عنوان شاخص، و از دیسک‌های حاوی یک میکروگرم بنزیل پنی­سیلین استفاده می­شود (23).

با توجه به اینکه این تست­های فنوتیپی حساسیت کمتر از 72 درصد دارند، ردیابی blaZ با استفاده از روش PCR، به عنوان gold standard توصیه می­شود (10).

نتایج مطالعات انجام شده بر روی آلودگی باکتریایی غذاهای مصرفی در برخی از دانشگاه­ها نشان داد که کباب­کوبیده و ماهی از نظر شمارش کلی باکتری­ها آلوده­ترین نوع غذاها بوده­اند و 6/55 درصد نمونه­ها دارای آلودگی استافیلوکوکوس اورئوس بوده­اند و همچنین آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس فقط در نمونه­های مربوط به کباب­کوبیده وجود داشته است (26).

از زمان کشف داروهای شیمیایی و ترکیبات ضد میکروبی، گرچه کنترل عفونت­های غذایی امکان­پذیر گردیده، ولی با این همه، برخی باکتری­ها به ترکیبات فوق مقاوم هستند و علاوه بر این نگرانی‌هایی در خصوص ایمنی و پتانسیل اثر افزودنی­های مصنوعی و عوارض جانبی نگهدارنده­های شیمیایی بر سلامت مصرف­کنندگان مطرح شده که معطوف شدن توجهات به بحث جایگزینی آن‌ها با ترکیبات ضد میکروبی طبیعی را در پی داشته است. در این میان، توجه تولیدکنندگان و مصرف­کنندگان به استفاده از ترکیبات گیاهی معطوف شده که خواص ضد میکروبی ترکیبات فوق، مورد مطالعه قرار گرفته و اثرشان علیه طیف وسیعی از باکتری­ها، مخمرها و قارچ­ها به اثبات رسیده است (19).

پیاز و فلفل از مهم­ترین و پرکاربرد­ترین افزودنی­های گیاهی در مواد غذایی تهیه شده از گوشت چرخ کرده مانند کباب کوبیده می‌باشند. پیاز نوعی گیاه غده­ای گوشتی زیر زمینی از خانواده لاله با نام علمی Allium cepa است. پیاز دارای بخش هوایی و بخش ریشه خوراکی است. بو و مزه پیاز مربوط به ترکیب محیط و ژنتیک آن است. بوی پیاز مربوط به مواد گوگردی فراری است که در هنگام تقطیر در حرارت معمولی اتاق تجزیه می­گردند. فلاوونوئیدهای پیاز ترکیبات شیمیایی هستند که در برابر میکروارگانیسم‌ها فعال می‌شوند و در محیط آزمایشگاه، در برابر رشد میکروارگانیسم­ها اثر آنتی باکتریال از خود نشان می­دهند (31).

فلفل قرمز از جمله گیاهانی است که در طب سنتی در درمان عفونت­های چرکی استفاده می­شوند. فلفل گیاهی است علفی و دارای ساقه بی کرک که از تیره Piperaceae است. برخی از ترکیبات ضد میکروبی استخراج شده از آن عبارتند از: کاپسانتین، ترپینر، بتاپینن، آلفاپینن، لینالئول و ترپینئول (33).

بنابراین تحقیق حاضر با هدف بررسی و مقایسه اثر ضد میکروبی عصاره­های متانولی فلفل­قرمز و پیاز­قرمز بر استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن بتالاکتاماز جدا شده از گوشت چرخ­کرده، انجام شد.

مواد و روش‌کار

تهیه عصاره الکلی: پس از تهیه میوه فلفل­قرمز و پیاز­قرمز از فروشگاه­های محلی و شناسایی دقیق آن ناخالصی­های احتمالی موجود جدا گردید، قسمت­های خوراکی گیاه خرد و در سایه خشک گردید و پس از آسیاب کردن بصورت پودر درآمد و سپس با نسبت 1 به 5 با متانول 70 درصد در آب مقطر (v/v) به صورت سوسپانسیون درآورده شدند و در محیط آزمایشگاه نگه داشته شدند و پس از 24 ساعت مخلوط حلال و گیاه از هم جدا شدند و به وسیله کاغذ­های صافی بزرگ (واتمن شماره 41) و کوچک (واتمن شماره 1)، فیلتراسیون دقیق انجام شد تا عصاره خالص حاصل شود. عصاره خالص در دستگاه تبخیر کننده دوار تحت خلا (روتاری) ( ساخت آلمان، شرکت IKA) قرار گرفت و در دمای 45 درجه سانتیگراد حلال آن به مدت 1 ساعت به آرامی تبخیر و عصاره غلیظ شده به دست آمد (20).

نمونه­برداری و جداسازی استافیلوکوکوس: نمونه­برداری از 30 مرکز توزیع و عرضه گوشت بسته­بندی شده در شهر سمنان تحت شرایط بهداشتی و به صورت کاملاً تصادفی انجام شد و نمونه­ها در بسته‌های 500 گرمی در کنار یخ به آزمایشگاه بهداشت مواد غذایی منتقل شدند. برای جداسازی استافیلوکوکوس اورئوس ابتدا 25 گرم از نمونه به 225 سی­سی پپتون واتر بعنوان غنی کننده اولیه افزوده شد و پس از مخلوط کردن کامل، 24 ساعت در 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شد. 1/0 سی سی از هر نمونه در محیط کشت اختصاصی استافیلوکوکوس اورئوس (آگار برد پارکر) کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری گردید (30). تایید بیوشیمیایی کلنی‌های سیاه با هاله شفاف اطرافی به وسیله آزمون­های تولید کواگولاز و نوکلئاز مقاوم به حرارت و کاتالاز صورت گرفت (2). پس از تایید بیوشیمیایی کلنی­های استافیلوکوکوس اورئوس با روش PCR از نظر جنس و گونه و حضور ژن بتالاکتاماز مورد بررسی و تایید قرار گرفتند. جدایه­های تایید شده به مدت 18 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در محیط آبگوشت قلب و مغز (BHI) کشت داده شد. سپس کشت مجدد از کشت اول داده شد و به مدت 18 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری شد. از کشت دوم برای تهیه استوک به نسبت 1 به 5 با گلیسرین استریل مخلوط و در حجم­های 100 میکرولیتری در لوله­های اپندورف استریل در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد (16).

استخراج اسیدهای نوکلئیک:جهت استخراج DNA از جدایه­های ذخیره شده S. aureusابتدا نمونه­ها از یخچال خارج شده و بمدت 24 ساعت در محیط لوریا برتانی آگار (LB) در دمای 37 درجه سانتیگراد کشت شدند. سپس از پرگنه­های رشد یافته برداشت کرده و به میکروتیوب­های حاوی 25 میکرولیتر NaOH نیم نرمال افزوده شد تا شیرابه‌ای یکنواخت بدست آید. پس از گذشت 30 دقیقه، 25 میکرولیتر تریس یک مولار به سوسپانسیون فوق اضافه گردید تا عمل هضم باکتری­ها توسط سود متوقف شده و محلولی با pH نهایی 5/7 تهیه شود. بلافاصله با افزودن 450 میکرولیتر آب مقطر استریل به مجموعه حجم محلول به 500 میکرولیتر رسیده و رقت نهایی از عصاره DNA جهت انجام آزمون PCR تهیه گردید.

انجام آزمون PCR جهت تایید مولکولی S. aureus و ردیابی ژنblaZ : پس از انجام مراحل استخراج DNA از سوش­های استافیلوکوکوس آرئوس مورد مطالعه، واکنش زنجیره­ای پلی مراز مطابق پروتکل ارائه شده توسط Trung و همکاران در سال 2015 با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی توالی 16SrRNA گونه S.aureus، و جهت ردیابی ژن بتالاکتاماز blaZ از پرایمرها و پروتکل ارائه شده توسط Haveri و همکاران در سال 2005 درون دستگاه ترموسایکلر XP (BIOER tech. China)­­ در 35 سیکل و تحت شرایط دمایی زیر انجام شد: دناتوراسیون اولیه 3 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد ، دناتوراسیون 1 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد، اتصال 40 ثانیه در 3/57 درجه سانتیگراد، طویل­سازی 40 ثانیه در 72 درجه سانتیگراد و طویل­سازی نهایی 4 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد انجام پذیرفت (27‌، 13). توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه در جدول1 آمده است. مخلوط واکنش در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل: 3 میکرولیتر DNA استخراج شده، 5/12 میکرولیتر مستر میکس، 1 میکرولیتر از پرایمرها (جدول 1)، 5/7 میکرولیتر آب مقطر استریل در یک میکروتیوب 2/0 میلی­لیتری تهیه شد.

برای قرائت نتایجPCR ، محصولات PCR روی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز گردید. شاهد مثبت و منفی در تمام واکنش­های PCR مورد استفاده قرار گرفت. به عنوان شاهد مثبت گونه استافیلوکوکوس آرئوس از سویه استاندارد 29213 و به عنوان شاهد منفی از گونه اشریشیاکلی استفاده شد. بدلیل عدم وجود سویه استاندارد واجد ژن blaZ جهت استفاده در مطالعه حاضر، محصولات تکثیر شده در آزمون مورد نظر جهت تعیین توالی به شرکت سیناکلون ارسال شده و نتایج اخذ شده پس از انجام Nucleotide BLAST مشخص نمود که توالی مربوط به محصولات تکثیر شده دقیقاً متعلق به ژن blaZ می‌باشند. بعلاوه صحت نتایج PCR با استفاده از سوش فاقد مقاومت فنوتیپی در تست آنتی­بیوگرام علیه آنتی­بیوتیک­های بتالاکتام از لحاظ وجود باندهای غیر­اختصاصی کنترل گردید. در گوده اول ژل نیز مارکر bp-plus100 استفاده شد (تصویر 1). برای رنگ­آمیزی ژل از رنگ Ethidium Bromide  استفاده شده و  زیر دستگاه UV نتایج بررسی شد

اثر ضد میکروبی عصاره‌ها بر جدایه‌های استافیلوکوکوس اورئوس-تهیه میزان تلقیح باکتری: جهت تهیه میزان تلقیح باکتری از کشت استوک گلیسیرینه به داخل محیط آبگوشت BHI برده و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 18 ساعت گرمخانه گذاری شد. سپس از کشت اول کشت مجددی داده شد و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 18 ساعت گرمخانه گذاری شد. از کشت دوم مقادیر مختلفی به داخل لوله کووتی که حاوی 4 میلی­لیتر آبگوشت BHI استریل بود، منتقل شد تا جذب نوری 1/0 در طول موج 600 نانومتر به دست آید. سپس با انتقال 1 میلی­لیتر از سوسپانسیون باکتریایی داخل کووت، به لوله حاوی 9 میلی­لیتر آب پپتونه 1/0 درصد رقت­های متوالی تا 10 به نمای منفی شش، از طریق انتقال 100 میکرولیتر از هر رقت به پلیت­های حاوی BHI آگار از رقت­های تهیه شده، کشت داده شد. پلیت­ها به مدت 24 ساعت در دمای  35 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شد و پس از این مدت، تعداد باکتری شمارش شد و از این طریق میانگین تعداد باکتری درکووت حاوی سوسپانسیون باکتری با جذب نوری معادل 1/0 با دو بار تکرار محاسبه شد. با مشخص شدن این عدد، هرگاه که سوسپانسیون باکتریایی با جذب نوری 1/0 تهیه شود، تعداد باکتری در آن معادل عدد محاسبه شده بوده و می­توان از این سوسپانسیون غلظت­های دلخواه را تهیه نمود. البته در هر مورد تعداد دقیق باکتری تلقیح شده از طریق کشت هم زمان باکتری و شمارش تعداد کلونی محاسبه شد (11).

روش انتشار از چاهک در آگار (agar well diffusion): در این روش از محیط آگار مولر هینتون استفاده گردید (28). بدین ترتیب که سواب های پنبه ای استریل، درون سوسپانسیون باکتریایی با غلظت 10⁶ CFU در هر میلی لیتر غوطه ور شدند و درون لوله در قسمت بالای سطح مایع، به دیواره لوله فشرده شدند. سپس سواب به سرعت در تمام سطح پلیت حرکت داده شد تا تلقیح به خوبی انجام شود. در هر پلیت شش چاهک با فواصل یکسان به قطر 6 میلی متر، یکی در مرکز و پنج تا در اطراف ساخته شد، به گونه­ای که 2 میلی متر از لبه پلیت فاصله داشت. 5 تا از چاهک­ها به صورت آسپتیک با 50 میکرولیتر از غلظت­های مختلف هر عصاره (100، 200، 300، 400 و 500 میلی­گرم در میلی­لیتر در BHI براث حاوی 5 درصد DMSO) پر شدند. یکی از چاهک­ها نیز به عنوان کنترل با 50 میکرولیتر محیط استریل BHI براث حاوی 5 درصد DMSO پر شد. پلیت­ها به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفتند تا عصاره در آگار پخش شود و سپس به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند. در نهایت محدوده ممانعت بر حسب میلی­متر اندازه­گیری شد. آزمایش با سه بار تکرار انجام شد و نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش گردید (1).

 تعیین حداقل غلظت بازدارنده رشد (MIC) به روش میکرودایلوشن: در مطالعه حاضر، جهت تعیین حداقل غلظت بازدارنده رشد به روش میکرودایلوشن از پلیت 96 خانه با چاهک ته گرد و با حجم 300 میکرولیتر استفاده گردید. غلظت­های متوالی از عصاره­ها در آبگوشت BHI حاوی 5 درصد DMSO تهیه شد. سپس 200 میکرو­لیتر از هر کدام از غلظت­ها به هر کدام از پلیت­های 96 خانه انتقال داده شد و تا 30 میکرولیتر از سوسپانسیون هر باکتری نیز اضافه شد (با غلظت نهایی 10⁵ x 5 CFU در هر میلی­لیتر باکتری در هر چاهک)، که با تهیه رقت­های متوالی از سوسپانسیون باکتری و کشت در پلیت و شمارش تعداد کلونی تایید گردید. محتویات هر چاهک به مدت 2 دقیقه توسط Plate Reader مجهز به شیکر مخلوط شد. سپس جذب نوری با استفاده از Plate Reader در زمان صفر و با طول موج 600 نانومتر خوانده شد. پلیت­ها به مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند و بعد از اتمام گرمخانه گذاری کدورت یا عدم کدورت در چاهک­ها به صورت چشمی مشاهده گردید و با جذب نوری خوانده شده بعد از گرمخانه گذاری توسط Plate Reader تایید شد. روش کار به این صورت بود که افزایش جذب نوری به میزان بزرگتر یا مساوی 1/0 نسبت به زمان صفر به معنای رشد باکتری و ایجاد کدورت و اولین غلظت از عصاره­ها که فاقد کدورت بودند به منزله حداقل غلظت بازدارنده رشد (MIC) در نظر گرفته شدند (24 ، 16).

MBC: تعیین حداقل غلظت کشندگی باکتری (باکتری کشی): برای تعیین MBC، 20 میکرولیتر از رقت­های متوالی عصاره و سوسپانسیون باکتری که در تست MIC فاقد کدورت بودند، در محیط تازه نوترینت آگار به صورت خطی کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شد. کمترین غلظتی که فاقد رشد در محیط نوترینت آگار بود، به عنوان MBC گزارش شد (1).

بررسی اثر عصاره­های پیاز و فلفل بر نمودار رشد باکتری: در این مرحله بر اساس نتایج حاصل از تعیین حداقل غلظت بازدارنده رشد عصاره­ها (جدول 4) اثر غلظت­های تحت بازدارنده عصاره­های پیاز و فلفل به تنهایی و به صورت توام با هم روی رشد یکی از ایزوله­های تایید شده در طی 24 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفت. غلظت­های مورد استفاده عبارت بودند از عصاره متانولی فلفل صفر و 5/7 میلی گرم بر میلی­لیتر و عصاره متانولی پیاز 0 و 5/12 میلی­گرم بر میلی­لیتر. مجموع حالات مورد استفاده در جدول 2 آمده است. 10 میلی­لیتر از محلول­های تهیه شده (در غلظت­های مختلف) در لوله­ها توزیع شد و سپس 100 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری (با غلظت نهایی 10⁵ x 5 CFU در میلی­لیتر) به هر 4 لوله اضافه گردید. لوله­ها در دمای 35 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند و در ساعت­های صفر، 1، 2، 4، 6، 8، 10، 12، 24 رقت­های مورد مطالعه از هر 4 لوله در زمآن‌های فوق تهیه شد و در پلیت آگار BHI به صورت سه تایی کشت داده شد و بعد از گرمخانه گذاری به مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد شمارش تعداد کلونی انجام شد و تعداد باکتری­ها در ساعات مورد نظر بر حسب لگاریتم CFU در هر میلی­لیتر (log CFU/ml) محاسبه شد.

نمودارهای مربوط به منحنی رشد باکتری با نرم افزار Graphpad prism 4 ترسیم شد و کلیه تحلیل­های آماری بین لگاریتم تعداد باکتری­ها در ساعات مختلف و همچنین شیب خط منحنی­های رشد با استفاده از نرم­افزار SPSS 16 صورت گرفت. جهت مقایسه داده­ها از تست One-way ANOVA همراه تست تکمیلی توکی و همچنین آنالیز ارزیابی­های مکرر (Repeated measure) برای بررسی روند رشد استفاده شد و اختلاف میانگین داده­ها در سطح 5 درصد از لحاظ آماری، معنی­دار تلقی گردید.

نتایج

میزان آلودگی نمونه­ها:میزان آلودگی به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و تایید ملکولی باکتری و ژن بتالاکتاماز جدایه­ها در نمونه­های گوشت چرخ­کرده به ترتیب در جدول 2 و تصویر  1 نمایش داده شده است. همان­گونه که مشاهده می­شود از 22 نمونه از گوشت­های چرخ­کرده (3/73 درصد) استافیلوکوکوس اورئوس جدا گردید که تمام جدایه­ها با تست PCR نیز تایید شدند (تصویر 1). ردیابی ژن blaZ  نیز نشان داد که 5 نمونه از جدایه­های استافیلوکوکوس اورئوس (7/22 درصد از نمونه­های آلوده و 6/16 درصد از کل نمونه­ها) حاوی ژن بتالاکتاماز بودند (تصویر 1).

اثر ضد میکروبی عصاره­ها: بر اساس نتایج این پژوهش، فعالیت ضد باکتریایی عصاره­های پیاز و فلفل­قرمز بر روی 5 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس حاوی ژن بتالاکتاماز در جدول 4 آمده است. همان گونه که مشاهده می­گردد در تمامی آزمایش­ها و بر ضد تمام جدایه­های استافیلوکوکوس اورئوس عصاره فلفل­قرمز اثر مهاری قوی­تری دارد که این برتری در ارتباط با آزمایش انتشار چاهک از نظر آماری نیز معنادار می­باشد (05/0>P).

جدول 1. مشخصات پرایمرهای استفاده شده جهت ردیابی ژن 16s rRNA و blaZ.

جدول 2. مجموع حالات مورد استفاده در بررسی اثر غلظت­های مختلف عصاره­های فلفل قرمز و پیاز قرمز روی نمودار رشد باکتری.

جدول 3. تعداد نمونه­های آلوده به  استافیلوکوکوس اورئوس.

جدول 4. فعالیت ضد میکروبی عصاره­های فلفل قرمز و پیاز قرمز بر روی جدایه­های استافیلوکوکوس اورئوس حاوی ژن بتالاکتاماز.

^a (Inhibition Zone) : میانگین ±انحراف معیار قطر هاله مهاری به میلی­متر، ^b MIC: حداقل غلظت مهاری (میلی­گرم بر میلی­لیتر)، ^c MBC : حداقل غلظت کشندگی (میلی­گرم بر میلی­لیتر)، * حروف غیر مشابه در ستون­های مربوط به IZ نشان دهنده تفاوت معنادار آماری (05/0 >P) بین دو عصاره می­باشند.

 تصویر 1. نتایج حاصل از الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز. M: مارکر به اندازه 100 باز، :B1 شاهد منفی (جدایه اشریشیاکلی) مربوط به آزمون تایید استافیلوکوکوس آرئوس، Sa+: شاهد مثبت استافیلوکوکوس آرئوس (29213)، 1-5: نمونه­های مثبت تشخیص داده شده به عنوان S. aureus، B2: شاهد منفی جهت ردیابی blaZ، Bla+: نمونه شاهد مثبت blaZ (تعیین توالی شده مطابق جدول 2)، 6-10 : نمونه­های مثبت از لحاظ حضور ژن blaZ.

نمودار1. منحنی رشد و شیب خطی رشد (روند افزایشی) باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در حضور کنترل، عصاره فلفل به تنهایی، عصاره پیاز به تنهایی و ترکیب عصاره­های پیاز و فلفل (O: پیاز، P: فلفل).

 بررسی اثر عصاره­های پیاز و فلفل بر نمودار رشد باکتری: نمودار 1 منحنی­های رشد و همچنین شیب خطی (روند افزایشی) جدایه استافیلوکوکوس اورئوس حاوی ژن بتالاکتاماز را در حضور  عصاره­های هیدروالکلی پیازقرمز و فلفل­قرمز نشان می­دهند. تحلیل آماری روی منحنی رشد باکتری در نمودار 1 نشان داد که از ساعت 2 گرمخانه گذاری در تمامی ساعات میزان باکتری در گروه کنترل و گروه حاوی عصاره پیاز­قرمز بیشتر از گروه­های عصاره فلفل­قرمز و گروه ترکیبی بود (001/0>P) و بین دو گروه کنترل و عصاره پیاز و همچنین بین دو گروه عصاره فلفل و گروه ترکیبی اختلاف معنادار دیده نشد (05/0<P). مقایسه و تحلیل آماری لگاریتم تعداد باکتری­ها در هر گروه و بررسی افزایش معنادار در تعداد باکتری­ها (001/0>P) نشان داد که دوره فاز تاخیر در گروه­های کنترل، عصاره پیاز، عصاره فلفل و ترکیب پیاز و فلفل به ترتیب 1، 2، 4 و 4 ساعت بود. مقایسه شیب خطی منحنی­های رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در حضور عصاره­های پیاز و فلفل نیز نشان داد که بین روند افزایشی تعداد باکتری در دو گروه کنترل (با شیب 02/0±17/0) و پیاز به تنهایی (با شیب 02/0±17/0) و همچنین بین دو گروه فلفل به تنهایی (با شیب 02/0±12/0) و ترکیب پیاز و فلفل (با شیب 01/0±12/0) اختلاف معنادار وجود ندارد (05/0<P) ولی روند افزایشی تعداد باکتری در گروه­های فلفل به تنهایی و ترکیب پیاز و فلفل به صورت معنادار کندتر از گروه کنترل و گروه پیاز به تنهایی است (05/0>P)