شناسائی مرفومتریک و مولکولی دیکروسلیوم دندریتیکوم با استفاده از مارکرژنتیکی ND1 در دام های اهلی استان مرکزی

دیکروسلیازیس یکی از شایع‌ترین بیماری‌های مجاری صفراوی و کیسه صفرای طیف وسیعی از نشخوارکنندگان اهلی و وحشی وگاهی خرگوش، خوک، اسب و انسان با گسترش جهانی می‌باشد(3،13). عامل ایجاد کننده بیماری ترماتود دی ژنه‌آ متعلق به جنس دیکروسلیوم است که تاکنون 3 گونه از آن به نام‌های: دیکروسلیوم دندریتیکوم از سراسراروپا، آفریقا و آمریکا، دیکروسلیوم‌هاسپس ازآفریقا و دیکروسلیوم چایننسیس از آسیا گزارش شده است(1). از بین این 3 گونه، دیکروسلیوم دندریتیکوم حائز اهمیت پزشکی، دامپزشکی و اقتصادی بیشتری است. شیوع آلودگی انسانی روند افزایشی داشته واز این جهت ترماتود کبدی دیکروسلیوم دندریتیکوم یکی از عوامل مهم تهدید کننده سلامت انسان بشمار می‌رود(14). این بیماری بشدت سلامت میزبان خودرا به خطر انداخته به گونه‌ای که باعث عفونت شدید کبد و در نتیجه تحمیل خسارات قابل توجهی به اقتصاد دامپروری، مرگ ومیر، کاهش تولیدات دامی و افزایش استفاده از داروهای ضد کرمی می‌شود(9،11،13). بررسی‌های صورت گرفته در نقاط مختلف ایران نشان می‌دهد، آلودگی به ترماتود کبدی دیکروسلیوم دندریتیکوم شیوع متفاوتی دارد، به گونه‌ای که نسبت آلودگی در گاو 01/0درصد تا 66درصد، گوسفند 03/0درصد تا20درصد، بز02/0درصد تا 3/23 درصد و در گاومیش 8/0درصد تا 1/11درصد در مناطق مختلف جغرافیائی کشور گزارش شده است(8-2). همچنین یک مرور سیستماتیک و متاآنالیز شیوع نسبی آلودگی درگوسفندان، بزها و گاوهای کشتارشده در مناطق مختلف کشور را به‌ترتیب: 1/3درصد، 3/1درصد و 5/0درصد نشان داده است(3). ارزش اقتصادی کبدهای معدوم شده دام‌های کشتارگاهی آلوده به این کرم در ایران بالغ بر 8099418 دلار برآورد شده است(7). تشخیص دیکروسلیازیس براساس آزمایش مدفوع و مشاهده تخم، بررسی‌های هماتولوژیک، شناسائی آنتی بادی‌های اختصاصی و تکنیک‌های بیوشیمیائی(16) صورت می‌گیرد. در کشتارگاه پس از اتوپسی کامل حیوان، تشخیص بر اساس مشاهده کرم بالغ در کبد، کیسه صفرا و همچنین معاینات آناتومیک و بررسی‌های ایمنوپاتولوژیک صورت می‌گیرد(5). استفاده از شاخص‌ها و نسبت‌های مرفومتریک از جمله: وضعیت قرارگرفتن بیضه‌ها، اندازه بدن (طول وعرض)، قطربادکش شکمی‌ (داخلی وخارجی)، قطر بادکش‌ دهانی (داخلی وخارجی)، طول وعرض بیضه‌ها وطول غدد وتیلوژن برای شناسائی گونه‌های جنس دیکروسلیوم توسط محققین بکارگرفته شده و براساس آن گونه‌های مختلف انگل از یکدیگر تشخیص داده شده است. درعین حال این روش برای تشخیص دقیق تغییرات درون گونه‌ای فاقد حساسیت لازم می‌باشد(1،2). امروزه برای شناسائی تغییرات درون گونه‌ای و بین گونه‌ای ترماتودهای کبدی جنس دیکروسلیوم از مارکرهای ژنتیکی قابل اعتماد از جمله ژن‌های هسته 18s، 28s و ITS2 و همچنین ژن‌های میتوکندریائی (ND1 و CO1) استفاده می‌شود. این مارکرها قادر به جداسازی و شناسائی گونه‌ها از یکدیگر بطور دقیق می‌باشد(2،6،20). علی‌رغم اهمیت دیکروسلیازیس، اطلاعات محدودی در مورد خصوصیات مرفومتریک و ژنومیک عامل ایجاد کننده بیماری در دسترس می‌باشد. با توجه به شیوع بالای دیکروسلیازیس و لزوم بکارگیری استراتژی‌های کنترل و پیشگیری مؤثر و کارآمد در دام‌های کشور، لازم است درکنار استفاده از روش‌های انگل شناسی، از تکنیک‌های نوین بخصوص روش‌های مولکولی حساس و قابل اعتماد جهت تشخیص دقیق عامل بیماری و انتشار گونه‌ها در میزبانان مناطق مختلف جغرافیائی کشور استفاده شود. به همین منظور هدف از مطالعه حاضر، تعیین خصوصیات مرفولوژیکی و مولکولی ایزوله‌های دیکروسلیوم جمع آوری شده از دام‌های ذبح شده در کشتارگاه استان مرکزی براساس مارکرژنتیکیND1  می‌باشد. نتایج این مطالعه می‌تواند در تشخیص، درمان، بکارگیری استراتژی‌های کنترل و پیشگیری از بیماری مورد استفاده قرار گیرد.

مواد و روش‌کار

جمع آوری نمونه: این تحقیق با طراحی مقطعی(Cross –Sectional)  روی120کبد شامل (40 کبد گاو، 40 کبد گوسفند و 40 کبد بز) جمع آوری شده از کشتارگاه صنعتی استان مرکزی طی سال 1395صورت گرفت. تشخیص آلودگی به ترماتود کبدی دیکروسلیوم پس از کالبد گشائی کامل حیوان و معاینه دقیق کبد و مجاری صفراوی و ایجاد برش در بافت توسط دامپزشک صورت گرفت. کبدهای آلوده در اسرع وقت به آزمایشگاه انگل شناسی منتقل و پس از باز نمودن کامل کلیه مجاری صفراوی، تمامی کرم‌های‌ موجود بدون هر گونه ‌آسیب فیزیکی جدا و شمارش گردید. از هر میزبان160کرم بالغ تازه دیکروسلیوم دندریتیکوم و در مجموع 480 کرم برای شناسایی ۲۱ شاخص مرفولوژیک و مرفومتریک پس از حداقل 3 بار شستشو با سرم فیزیولوژی انتخاب گردید. شاخص‌ها و نسبت‌های مرفولوژیک و مرفومتریک مورد مطالعه عبارت بود از: اندازه بدن (طول وعرض و نسبت طول به عرض بدن)، اندازه بادکش‌ها (قطر داخلی و خارجی بادکش شکمی و دهانی، نسبت قطر خارجی بادکش دهانی به شکمی و فاصله بین بادکش‌ها)، اندازه بیضه (طول و عرض)، اندازه تخمدان (طول وعرض)، طول غدد زرده (راست و چپ)، قطر اواوتیپ، فاصله بادکش شکمی تا انتهای خلفی بدن، اندازه رحم (طول وعرض)، طول سیر و نسبت طول بدن به طول غدد زرده برحسب میکرومتر اندازه‌گیری  و محاسبه شد(18). نمونه‌ها تا انجام کار مولکولی در C°80- نگهداری شد. داده‌ها با استفاده از آزمون آماری ANOVA و با استفاده ازنرم افزارآماری SPSS ویرایش 16 تجزیه و تحلیل و مورد قضاوت آماری قرار گرفت.

استخراج DNA ژنومی از کرم بالغ: از هر میزبان،20 کرم بالغ دیکروسلیوم با ویژگی‌های متفاوت مرفولوژیک و مرفومتریک و در مجموع60 نمونه برای استخراجDNA  انتخاب گردید. برای انجام این کار، نمونه‌ها را از فریزر خارج نموده و پس از 3 بار شستشو با بافر PBS استریل سرد، محلول هموژنی از بافت انگل تهیه و به آن µl 200 بافر لیز کننده اضافه و به مدت 3 ساعت درحمام آب گرم C°56 انکوبه و سپس عمل استخراج DNA با استفاده از کیت بافتیBioneer Accu Prep (کره جنوبی) و مطابق با دستور العمل کارخانه سازنده با تغییراتی در زمان انکوباسیون و مقدار آنزیم پروتئیناز K صورت گرفت. خلوص DNA استخراج شده با دو روش الکتروفورز ژل آگارز و اسپکترو فتومتری UV‌ در طول ‌موج‌های nmا‎260 و280 تایید گردید. طراحی پرایمرهای اختصاصی گونه برای ژن مورد مطالعه، با استفاده از نرم افزارPrimer3 صورت گرفت و اختصاصیت و عمکرد آن با نرم افزار BLAST تائید گردید. درجدول 1 توالی پرایمرهای مورد استفاده نشان داده شده است. پس از حصول اطمینان از کیفیت محصول، DNA استخراج شده با µl 80 محلول Elution‌ رقیق شده و تا زمان انجام واکنش PCR در C°20 - نگهداری شد.

واکنشPCR ، تعیین توالی ژن و ترسیم درخت فیلوژنیND1 : قطعه‌ای از ژن ND1 به اندازه تقریبیbp 200تکثیر شد. مخلوط PCR به حجم µl 20 شامل: µl2 DNA انگل،µl 2 Master Mix، 1µlپرایمر Forward، 1µlپرایمر Reverse و 14µl آب مقطر استریل تهیه و واکنش PCR با استفاده از دستگاه ترموسایکلر مدل Flex cycler2 (انگلستان) با پروتکل زیر صورت گرفت: مرحله واسرشت ابتدایی C°95 به مدت 5 دقیقه، مرحله واسرشت C°95 به مدت 1دقیقه، مرحله اتصال پرایمر C° 55 به مدت 45 ثانیه و مرحله طویل شدن زنجیره C° 72 به مدت 45 ثانیه. این 3مرحله به تعداد30 سیکل و در نهایت یک سیکل به مدت 10دقیقه در C° 72 انجام گرفت. سپس µl 4 از محصول PCR  تهیه شده به همراه µl 2 بافر loading در ژل آگاروز 5/1درصد به همراه مارکر وزنی DNAاbp 100، کنترل منفی (آب مقطر دو بار تقطیر) و کنترل مثبت (محصول PCR حاوی DNA استاندارد شده انگل) در ژل آگاروز 5/1درصد بارگذاری و در ولتاژ80 آمپر به مدت 45 دقیقه الکتروفورزو با استفاده ازترانس لومیناتور باندهای تشکیل شده آنالیز گردید. برای منظور دستیابی به توالی ژنND1 دیکروسلیوم، محصول PCR 8 ایزوله با استفاده از سکانسر DNA automa 310و هر دو پرایمر بکار رفته در واکنش PCR  تهیه شده و پس از مرتب سازی در بانک ژن ثبت شد. توالی‌ها با استفاده از نرم افزار BLASTا(Basic Local Alignment Search Tool) با موارد ثبت شده در بانک ژن مقایسه و میزان مشابهت ژنتیکی آن‌ها با استفاده از نرم افزارClastalw2 مورد آنالیز دوبدو قرار گرفت. همچنین درخت فیلوژنی پس از هم ترازی چندگانه توالی‌ها، به همراه چند توالی ثبت شده از راسته پلاژورکید در بانک ژن با استفاده ازنرم افزار MEGA5 و الگوریتم neighbor joining ترسیم گردید(19).

نتایج

بررسی مرفومتریک: از هرمیزبان مورد مطالعه،160کرم بالغ تازه دیکروسلیوم دندریتیکوم و در مجموع480 نمونه برای شناسایی21 شاخص و نسبت مرفومتریک مورد مطالعه قرارگرفت. مقایسه پارامترهای مرفومتریک نشان داد که اندازه شاخص‌ها در3 میزبان تحت مطالعه با یکدیگر متفاوت است(0.0001>P). در جدول 2 شاخص ها و نسبت های مرفولوژیک و مرفومتریک ترماتود کبدی دیکروسلیوم در گاو، گوسفند و بز با یکدیگر مقایسه شده است. موقعیت قرارگرفتن بیضه‌ها که معیار قابل اعتمادی برای تشخیص افتراقی گونه‌های دیکروسلیوم می‌باشد، در تمامی ایزوله‌ها، پشت سرهم (tandem) بود که خود موید گونه دیکروسلیوم دندریتیکوم در میزبانان منطقه مورد مطالعه می‌باشد.

بررسی مولکولی: پس از استخراج DNA موجود در پیکره60 کرم بالغ، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، واکنش PCR انجام و اندازه ناحیه ژنومی ND1 درتمامی ایزوله‌ها باندbp 200 نشان داده شد (تصویر1).

پس از بررسی‌های مولکولی، به منظور تائید گونه انگل، از محصول تخلیص شدهPCR  تعیین توالی صورت گرفت. توالی‌ها پس از مرتب سازی در بانک جهانی ژن باشماره‌های LC189318.1،LC189317.1 به ثبت رسید. نتایج آنالیز دوبدوی توالی‌های 3 میزبان مورد مطالعه و همچنین در مقایسه با موارد ثبت شده در بانک جهانی ژن، نشان‌دهنده مشابهت ژنتیکی ایزوله‌ها، بین 97 تا 99 درصد بود و به این ترتیب دیکروسلیوم دندریتیکوم تنها گونه آلوده کننده جنس دیکروسلیوم دربین نشخوارکنندگان استان مرکزی تعیین گردید. همچنین آنالیز فیلوژنتیک توالی‌ها نشان داد، تمامی ایزوله‌های مورد مطالعه مربوط به گونه دیکروسلیوم دندریتیکوم می‌باشد (تصویر 2).

بحث

دراین مطالعه با دوروش مرفومتریک وتعیین توالی نشان داده شد از بین  3 گونه جنس دیکروسلیوم، تنها دیکروسلیوم دندریتیکوم باعث آلودگی نشخوارکنندگان استان مرکزی می‌شود. یکی ازشاخص‌های مرفومتریک قابل اعتماد و مهم برای تشخیص افتراقی گونه‌های دیکروسلیوم، موقعیت قرار گرفتن بیضه‌ها می‌باشد. مطالعه Otranto و همکارانش در سال 2007 که بر روی گوسفندان اتریشی، آلمانی وایتالیایی آلوده به ترماتود کبدی دیکروسلیوم صورت گرفته بود، نشان داد ‌در تمامی‌ایزوله‌های ‌دیکروسلیوم ‌چایننسیس‌ دو ‌بیضه‌درکنار هم قرار دارد، ولی ‌در ایزوله‌های دیکروسلیوم‌ دندریتیکوم موقعیت قرار گرفتن بیضه‌ها پشت‌ سرهم می‌باشد. همچنین پهنای بدن درقسمت میانی ‌دیکروسلیوم چایننسیس نسبت به دیکروسلیوم دندریتیکوم بیشتر می‌باشد (15). یافته‌های تحقیق حاضر نشان داد، بیضه‌ها در تمامی ایزوله‌ها موقعیت پشت سرهم دارد که بدین ترتیب می‌توان نتیجه گرفت، تنها عامل دیکروسلیازیس در استان مرکزی، دیکروسلیوم دندریتیکوم می‌باشد. Taira و همکاران وی در سال 2006 با استفاد از این شاخص، تنهاگونه آلوده کننده آهوی ika در ژاپن را دیکروسلیوم چایننسیس تشخیص دادند(18). شاخص مهم دیگر اندازه طول و عرض کرم بالغ می‌باشد. در مطالعه حاضرطول کرم بالغ دیکروسلیوم دندریتیکوم در ایزوله‌های گوسفند و بز به ‌ترتیب:mm 1/0±84/6  و mm 11/0±57/6 (0.0001>P) و عرض آن برای 2 میزبان مورد بررسی به ترتیب: µm 22/0±49/1و  25/0±43/1(0.0001>P) و نسبت طول به عرض به ترتیب: 625/0±58/4 و 622/0±64/4 (0.0001>P) محاسبه شد که مویدگونه دیکروسلیوم دندریتیکوم در میزبانان منطقه مورد مطالعه می‌باشد. در مطالعه Bari و همکاران در سال 2018 طول و عرض کرم بالغ در ایزوله‌های گوسفند دیکروسلیوم mm 66/1±71/7 و mm 046/0±65/1 ودرایزوله‌های بز mm 104/0±73/6 وmm 03/0±65/1محاسبه شده است(2). در مطالعهOtranto و همکارانش در سال 2007،  طول و عرض کرم بالغ دیکروسلیوم دندریتیکوم ایزوله گوسفند به ترتیب در محدوه mm 60/5-70/4 (mm 33/0±05/5 ) و mm 80/1-30/1 (mm 29/0±47/1)گزارش شده است(15) که بدین ترتیب طول و عرض کرم‌های بالغ دیکروسلیوم دندریتیکوم دام‌های کشتارگاهی استان مرکزی در مقایسه با  نتایج مطالعه Bari و همکاران کوتاه‌تر است (2) ولی در مقایسه با مطالعه Otranto و همکاران بلندتر می‌باشد (15). نتایج این تحقیق نشان داد، علی‌رغم مشاهده اختلافات مرفومتریک قابل ملاحظه درون گونه‌ای، تفاوت اندکی در توالی‌های ژن میتوکندریائیND1 مشاهده می‌شود، به گونه‌ای که در بین ایزوله‌ها و همچنین در مقایسه با موارد ثبت شده در بانک ژن حداقل70درصد مشابهت ژنتیکی وجود دارد که خودگویای این واقعیت است که تنها گونه دیکروسلیوم دندریتیکوم قادر به آلودگی دام‌های منطقه مورد مطالعه می‌باشد. تاکنون اطلاعاتی کمی در مورد خصوصیات مرفومتریک گونه‌های دیکروسلیوم دراختیار می‌باشد (10،12،17). ازاین‌رو ارزیابی تغییرات درون گونه‌ای و بررسی موتاسیون با این روش بطور دقیق امکان پذیر نمی‌باشد. بنابراین استفاده از تکنیک‌های نوین از جمله روش‌های مولکولی جهت تشخیص هویت انگل و بررسی تغییرات درون گونه‌ای و بین گونه‌ای با استفاده از مارکرهای ژنتیکی قابل اعتماد ضروری است. ﭘﻴﺸﺮﻓﺖ‌هایی ﻛﻪ در زﻣﻴﻨﻪ ﺑﻴﻮﻟﻮژی ﻣﻮﻟﻜـﻮلی ﺑـﻪ وﻳﮋه ﺗﻜﺜﻴﺮ ﻧﻮاﺣی ﺧﺎصی از ژﻧﻮم اﻧﮕـﻞ ﺑـﻪ ﺷـﻴﻮة واﻛـﻨﺶ‌های زﻧﺠﻴـﺮه‌ای ﭘﻠﻴﻤـﺮاز ﺣﺎﺻـﻞﺷـﺪه، اﺧﺘﻼﻓﺎت ﺑﺎرزی در ﻧﻮع و ﺗﺮﺗﻴﺐ ﺑﺎزهای آلی ﮔﻮﻧﻪ‌های ﻣﺨﺘﻠﻒ ﻣﻮﺟﻮدات ﺷﻨﺎﺳـﺎیی ﻧﻤـﻮده ﻛـﻪ اﻳـﻦ ﺗﻔﺎوت‌ها می‌ﺗﻮاﻧﻨﺪ ﮔﻮﻧﻪ‌های ﻣﺸﺎﺑﻪ را از هﻤﺪﻳﮕﺮ ﺗﻔﻜﻴک ﻛﻨﻨﺪ. مطالعات مولکولی در زمینه ویژگی‌های ژنتیکی گونه دیکروسلیوم به‌طور محدودی در ایران وجهان صورت گرفته است و در عین حال تمامی مطالعات نشان دهنده دیکروسلیوم دندریتیکوم به عنوان گونه غالب که قادر به ایجاد بیماری دیکروسلیازیس در دام‌های اهلی می‌باشد، از جمله مطالعات Bari و همکاران در سال 2018 که با استفاده از مارکر ژنتیکی(28S,rDNA) تنها  عامل دیکروسلیازیس درگوسفندان استان مازندران را دیکروسلیوم دندریتیکوم گزارش کرده است (2). همچنین Gorjipoor و همکاران در سال 2015 با استفاده از ژنND1 وITS2 و توالی بدست آمده گونه، و توالی بدست امده، دیکروسلیوم دندریتیکوم را تنها گونه غالب انگل در گاو و گوسفند در ایران معرفی کرده است (6). درتحقیق حاضراز این ژن برای توصیف تغییرات درون گونه‌ای دیکروسلیوم در استان مورد مطالعه استفاده شد. براساس این مارکربین توالی‌های ایزوله‌های گاوی گوسفندی بزی با مواردثبت شده دربانک جهانی ژن تا 99درصد شباهت دارند.

نتیجه گیری: پژوهش حاضرکه برای اولین بار در استان مرکزی به مطالعه شاخص‌های مرفومتریک وخصوصیات مولکولی (ND1) و تعیین توالی پرداخته است، نشان داد دیکروسلیوم دندریتیکوم تنهاگونه دیکروسلیوم است که باعث بروزدیکروسلیازیس درنشخوارکنندگان استان مرکزی می‌شود. ازاین رو باتوجه به زیان‌های اقتصادی بیماری کنترل و پیشگیری از آن کاملاًضروری می‌باشد.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از مدیریت اداره دامپزشکی و دامپزشکان محترم مسئول فنی کشتارگاه استان مرکزی که در انجام نمونه‌گیری نهایت همکاری را مبذول داشته‌اند، تشکر و قدردانی می‌گردد. این تحقیق از محل اعتبار ویژه پژوهشی معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی کاشان (طرح شماره 94142) انجام شده که بدین وسیله از مسئولین محترم معاونت پژوهشی تشکرو قدردانی می‌گردد.

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.