بررسی شیوع آنتی بادی ضد توکسوپلاسماگوندی در دامهای کشتار شده در کشتارگاه سنندج به روش آگلوتیناسیون تغییر یافته (MAT) در سال 2015

توکسوپلاسما گوندی  انگل تک یاخته‌ایی از شاخه اپی کمپلکسا و تحت رده کوکسیدیا و خانواده سارکوسیستیده است که باعث نوعی عفونت معمولاً بدون نشانه و شایع در انسان و طیف وسیعی از حیوانات خونگرم از جمله دام‌های اهلی می‌شود، در چرخه انتقال توکسوپلاسما گربه و گربه سانان وحشی به عنوان میزبان اصلی در نظر گرفته میشوند که در سلول‌های اپیتلیال روده باریک آن‌ها در اثر سیکل جنسی (اسپروگونی) اووسیست تشکیل می‌شود (11). راه‌های انتقال انگل به انسان عباتند از : مصرف گوشت نپخته حاوی کیست نسجی،مصرف آب یا غذا حاوی اووسیست (oocyst) و انتقال مادرزادی (17). این انگل سبب ایجاد توکسوپلاسموز با علایم بسیار متفاوت ومتنوعی می‌شود که در نوع مادرزادی ، هیدروسفالی، یرقان، کوریورتینیت و سقط جنین در انسان و پستانداران از مهم ترین آن‌ها محسوب می‌شود(27) سقط جنین در دام‌ها ضررهای اقتصادی به همراه دارد(12). هنگامی که یک شخص برای اولین بار در معرض توکسوپلاسما قرار می‌گیرد ایمونوگلوبولین (IgG) به مقدار قابل اندازه گیری در خون برای بقیه عمر وجود خواهد داشت که اندازه گیری آن برای بررسی میزان شیوع آلودگی به انگل مناسب است(13).

میزان شیوع انگل در مناطق جغرافیایی مختلف و برحسب عادات تغذیه افراد  متفاوت است(26). برآورد می‌شود که حدود یک سوم جمعیت جهان به توکسوپلاسما آلوده باشند(23)؛ شیوع سرمی انگل در افراد در انگلستان و ایالات متحده 30 درصد، فرانسه 50درصد، ایتالیا و هلند 60درصد ، لهستان 50-60 درصد گزارش شده است(20). شیوع این انگل در دام‌های لهستان در گاو 55 درصد و در گوسفند بیشتر از 80درصد، در ترکیه از 1/7 درصد تا 7/88 درصد در مناطق مختلف گزارش شده است(22)، در ایران شیوع توکسوپلاسما در زنان مراجعه کننده جهت مشاوره ازدواج شهرستان بابل 64 درصد در استان مازندران و گیلان  55درصد بوده است(9) و شیوع توکسوپلاسما در دام‌ها در همدان درگاو 3/2درصد در گوسفند 3/13درصد(16)، در شیراز در گاو 55درصد و در گوسفند 5/29درصد (4)، در خرم آباد در گاو 9/11درصد و در گوسفند 1/16درصد (21)گزارش شده است.

روش‌های مختلفی جهت تشخیص آلودگی به توکسوپلاسما وجود دارد (5) که در میان آن‌ها برای تشخیص بهتر آلودگی به توکسوپلاسما روش‌های سرولوژی مانند آگلوتیناسیون اصلاح شده (MAT) و الایزا مناسبتر و قابل انجام تر به نظر می‌آیند و در حیواناتی مثل گوسفند، بز، گاو و خوک نیز انجام شده اند. هر دو تست دارای ویژگی و حساسیت بالایی هستند ،اما حساسیت MAT بیشتر از الایزا است و در حدود 9/82درصد برای تشخیص توکسوپلاسما گوندی محاسبه گردیده است. ویژگی آن 29/90درصد می‌باشد. برتری دیگر MAT نسبت به الایزا قابلیت استفاده آن  برای تمامی گونه‌ها  است، اما الایزا بدلیل نیاز به گونژوگه اختصاصی هر بار برای یک گونه قابل انجام است. همچنین از لحاظ مقرون به صرفه بودن، زمان لازم برای آزمایش و ساده بودن تست، روش MAT نسبت به الایزا برتری‌هایی دارد(18). MAT یک روش سرولوژیک برای تشخیص آنتی بادی‌های توکسوپلاسما گوندی درخون،سرم و دیگر مایعات بدن می‌باشد. درMAT ، تاکی زوئیت‌های توکسوپلاسما در فرمالین فیکس می‌شوند تا آنتی بادی‌های IgG که به وسیله بدن میزبان تولید شده‌اند را تشخیص دهد(8).

به دلیل ارتباط نزدیک افراد با دام‌ها در منطقه مورد مطالعه و همچنین مناسب بودن منطقه کردستان جهت پرورش دام و همچنین تعیین وضعیت آلودگی دام‌ها به توکسوپلاسما، مطالعه حاضر برای اولین بار در استان کردستان با هدف تعیین شیوع آنتی بادی ضد توکسوپلاسما در دام‌های کشتار شده به روش آگلوتیناسیون در سنندج در سال 94 طراحی شده است

مواد و روش کار

منطقه مورد مطالعه: سنندج مرکز استان کردستان واقع در غرب ایران در ارتفاع 1450 تا 1538 متری از سطح دریا در منطقه کوهستانی زاگرس و در آب وهوای سرد و نیمه خشک قرار دارد .این شهرستان به دلیل برخورداری ازشرایط طبیعی مناسب ، مراتع سرسبز و پوشش گیاهی غنی و همچنین ویژگی‌های اقلیمی و توپوگرافی، مساعد دامداری بوده و این امر از فعالیت‌های بسیار کهن این منطقه محسوب می‌شود(2). در شهرستان سنندج 340 هزار راس دام وجود دارد که البته  دامدارها از اکثر نقاط استان دام‌های خود را جهت کشتار به تنها کشتارگاه صنعتی استان واقع  درسنندج نیز انتقال می‌دهند. نمونه گیری این مطالعه از کشتارگاه صنعتی  سنندج انجام گرفته است.

نمونه حیوانی: با توجه به میزان شیوع توکسوپلاسما در گاو، گوسفند و بز بر اساس مطالعات قبلی (8)که به ترتیب برابر 55درصد، 29درصد و 25درصد بود ، با  دقت 8درصد و آلفای 5درصد، و بر اساس نظر مشاور آماری   و فرمول d²/((p-1)pا×z²)=n0 و اصلاح حجم نمونه با لحاظ تعداد محدود نمونه ([(1/N ا-n0)+1]/n=n0، محاسبه و تعیین حجم نمونه صورت گرفت و برای تهیه نمونه‌های خون  تعداد کل 343 راس دام کشتار شده مشتمل بر 130 راس گاو،  111 راس گوسفند و 102 راس بز در کشتارگاه سنندج در طول سه ماه (از اول فروردین تا اواخر خرداد 1394) هر هفته 2 روز به کشتارگاه مراجعه شده و هر بار ازشروع کشتار وبه تناوب 5 نمونه خون گاو، 5 نمونه خون گوسفندو با توجه به محدودیت کشتار بز،تمام نمونه‌های خون مربوط به بز جمع آوری شد. نمونه خونها سریعامی‌شود به آزمایشگاه انگل شناسی دانشگاه علوم پزشکی کردستان انتقال و سرم‌ها پس از جداسازی در دمایC˚20- تا زمان انجام آزمایش نگهداری شدند. بعد از اتمام نمونه برداری کلیه نمونه‌ها به صورت همزمان طبق دستورالعمل دسمونت (8)  آزمایش شدند .

روش انجام تست آگلوتیناسیون مستقیم اصلاح شده (MAT): نمونه سرم هر حیوان با رقت‌های متوالی که به صورت سریالی تهیه شدند جهت تعیین آنتی بادی IgG علیه توکسوپلاسما گوندی استفاده گردید در روش آگلوتیناسیون مستقیم تغییر یافته رقت‌های سرم 20/1، 40/1 و تا حداکثر 320/1 استفاده گردید و آنتی ژن مورد استفاده طبق پروتکل موجود(8) که در دانشگاه علوم پزشکی شیراز تهیه شده بود مورد استفاده قرار گرفت.. تیتر آنتی بادی در رقت مساوی یا بالاتر از 20/1 بعنوان تیتر مثبت در نظر گرفته شد و معیار مثبت بودن مشاهده تشکیل شبکه توری مانند در ته پلیت بود بطوریکه که در نمونه‌های منفی حالت دکمه‌ای در ته پلیت تشکیل می‌شود (تصویر 1). همچنین سرم مثبت و منفی برای بررسی صحت آزمایش نیز استفاده گردید. در واکنش منفی (آگلوتینه نشدن) آنتی بادی ناکافی در سرم باعث می‌شود آنتی ژن‌ها به یکدیگر متصل شوند و در سطح شیبدار ته چاهک جمع شده و تشکیل یک تکمه را دهند. در واکنش مثبت (آگلوتینه شدن) آنتی بادی کافی موجود در سرم آنتی ژن‌ها را به یکدیگر متصل میکند و یک شبکه پیچیده از آنتی ژن و آنتی بادی را ته چاهک تشکیل میدهد (تصویر 2).

تجزیه و تحلیل آماری: تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 19 انجام شد. فراوانی آلودگی به‌ صورت نسبی و مطلق بیان شد. برای تحلیل داده‌ها از آزمون‌های مربع کای (Chi- square) و دقیق فیشر (Fisher’s Exact Test) استفاده شد. 0.05≥P معنی‌دار در نظر گرفته شد.

نتایج

ازتعداد کل 343 راس دام کشتار شده منطقه کردستان، سن دام‌های مورد بررسی در مورد دام‌های کوچک پرواری12-15 ماه، مولد حداقل 5/3سال ودر مورد دام‌های بزرگ پرواری16-18 ماه ومولد  حداقل 4 سال بود.

از مجموع 343 نمونه سرم آزمایش شده، کلاً 53 راس (45/15درصد) از دام‌ها با روش سرمی MAT آلوده به توکسوپلاسما بودند. از کل 130 راس گاو مورد بررسی 31 راس آن‌ها (84/23درصد) سرم مثبت تشخیص داده شدند. همچنین از 111 راس گوسفند، 9 راس (1/8درصد) و از 102 راس بز، تعداد 13 راس (74/12) مثبت  شدند که این تفاوت از نظر آماری نیز معنی‌دار بود (جدول 1).

همچنین از 123 راس گاو نر و 7 گاو ماده، 1 مورد مثبت مربوط به گاو ماده و بقیه موارد مثبت مربوط به جنس نر و از 91 راس گوسفند نر و 20 گوسفند ماده، سه مورد از نمونه‌ها مثبت مربوط به ماده و بقیه نمونه‌های مثبت مربوط به جنس نر بوده است. از 98 راس بز نر و 4 بز ماده نیز، تمامی موارد مثبت مربوط به جنس نر بوده است ولی این تفاوت از نظر آماری معنی‌دار نبود(جدول 2)

بحث

در این مطالعه میزان کل شیوع آلودگی به توکسوپلاسما در دام‌های مورد مطالعه 45/15درصد بدست آمد که بترتیب در گاو 8/23درصد، در گوسفند 1/8درصد و در بز  7/12درصد بود و این تفاوت از نظر آماری معنی‌دار بود، اما دوجنس از نظر آلودگی با توکسوپلاسما، تفاوت آماری معنی‌داری را نشان ندادند.

با مطالعه بررسی‌های صورت گرفته، شیوع آلودگی به توکسوپلاسما در استان‌های مختلف ایران و در شرایط جغرافیایی مختلف باهم تفاوت دارد. به این صورت که در مطالعه Shaikhian و همکاران در سال 2013 که در لرستان(21) و به روش الایزا انجام شد میزان شیوع در گاو 9/11درصد و در گوسفندان 1/16درصد بوده است  و همچنین در مطالعه Daryani و همکاران در مازندران در سال 2006  که به روش IFA انجام شد در گاوها این میزان 9درصد، در گوسفند 35 درصد و در بز 30 درصد بوده است(10)، در مطالعه جامعی که توسط Boniadin و همکاران  در مرکز ایران در سال 2007 به روش IFAT انجام گردیده میزان کل سرم مـثبت در گوسفندان 1/29درصد بوده است که به تفکیک در شهرکرد 38درصد، در بروجن 5/22درصد، درلردگان 18درصد، در فارسان 32درصد و در اردل این میزان به 35درصد می‌رسد(7). 

مطالعه Askari و همکاران که در شیراز در سال 2013 به روش   MATانجام شد میزان شیوع سرمی در گاو 55درصد، در گوسفند 5/29درصد و در بز این میزان 8/18درصد بوده است(4) در مطالعه Bahraini و همکاران که در کرمان در سال 2008 به روش آگلوتیناسیون اصلاح شده (MAT) برروی بز و گوسفند انجام شده میزان آلودگی در گوسفند 7/24درصد و در بز این مقدار 8/15درصد بوده است(6). 

با مرورتحقیقات مشابه در سایر کشورها که با روش‌های مختلف ایمونولوژیکی صورت گرفته نیز نتایج متفاوتی مشاهده می‌شود بطور مثال در مطالعه که توسط Albuquerque و همکاران در ریودوژانیریوی برزیل در سال 2011 و به روش ایمنوفلورنس غیرمستقیم انجام شد میزان آلودگی در گاو 77/14درصد بود(3).  در مطالعه‌ای که در آفریقای جنوبی توسط Abu Samraa  و همکاران در سال 2007 به روش الایزا و ایمنوفلورنس غیرمستقیم بر روی گوسفند انجام گردید، میزان آلودگی به روش الایزا 3/4درصد و به روش IFA 6/5 درصد بدست آمد(1). همچنین در مطالعه Vesco  و همکاران در سال 2007  که در ایتالیا و به روش IFAT بر روی گوسفند انجام گردید، میزان آلودگی 97/33درصد تعیین شد(24). و در مطالعه‌ای که در چین توسط Wang CR و همکاران در سال 2011  به روش همآگلوتیناسیون غیرمستقیم بر روی بز و گوسفند انجام گردید، میزان آلودگی به ترتیب 7/9درصد و 6/17درصد بود (25). نتایج مطالعه Oncel و همکاران در سال 2007 که در استانبول ترکیه بر روی گوسفندان و به روش الایزا انجام دادند، 56 درصد آلودگی به توکسوپلاسما را نشان می‌دهد(19).

به طورکلی بامقایسه بین درصدهای آلودگی بدست آمده و مشاهده شده فوق که از نقاط مختلف ایران و جهان و با روش‌های مختلف انجام گردید، میزان آلودگی در محدوده حداقل 4 درصد تا حداکثر 55 درصد تعیین شده است و به طوریکه ملاحظه می‌شود نشان دهنده تفاوت بسیار زیاد ومنطقی آلودگی به توکسوپلاسما در مناطق مختلف جغرافیایی است چراکه انتشار و شیوع توکسوپلاسما در انسان وحیوانات متنوع مخزن آن کاملاً، وابسته به شرایط زیست محیطی ،آب وهوایی، فرهنگی و آداب غذایی جوامع است (23،26).

در مطالعه حاضر نیز شیوع کلی به ‌دست آمده یعنی 45/15درصد، ضمن اینکه دقیقا در محدوده کلی مورد اشاره در مقالات مروری قرار می‌گیرد، اما به تفکیک نوع حیوان تفاوت‌ها و نیز شباهت‌هایی را نشان می‌دهد، به طوریکه که در اکثر مطالعات قبلی میزان آلودگی بالا در گوسفندان نسبت به گاو را، بدلیل تفاوت در نوع چرا در نظر گرفته‌اند ،در مطالعه حاضر شیوع سرمی آلودگی به توکسوپلاسما گوندی در گاو بیشتر از گوسفند و بز بوده است و این مطالعه از این نظر با اکثر مطالعات انجام گرفته در مناطق دیگر در ایران تفاوت دارد که احتمالاًً دلیل این تفاوت‌ها ناشی از عوامل مختلفی نظیر  ورود گاوهای آلوده از کانونهای مجاور آلوده به کشتارگاه در زمان نمونه گیری و استفاده از تکنیک‌های متفاوت تشخیصی آزمایشگاهی با حساسیت‌های مختلف در مطالعات قبلی مرتبط است.

امااین افزایش آلودگی در گاو با نتایج مطالعه Askari همسو است. در مطالعه Askari و همکاران در سال 2013 که در شیراز به روش MAT انجام گردید، میزان آلودگی دردام‌ها و بویژه در گاو‌ها بالا وحدود 55درصد گزارش گردید (4) که این شیوع بالا را ناشی از نوع سبک سنتی زندگی روستایی آن منطقه و ارتباط بالای دام‌های اهلی با حیواناتی مثل گربه که مخزن‌های اصلی این انگل به حساب می‌آید، دانستند، ازسایر دلایل احتمالی میتوان به بیشتر بودن متوسط طول عمر گاوها درزمان ذبح که شانس بیشتری برای تماس با انگل در گاو بوجود می‌آورد و همچنین حجم غذای بیشتر گاو نام برد که شانس ابتلای بیشتری را سبب می‌شود، و بدین صورت ونیز با توجه به تمایل به مصرف بیشتر گوشت گاو نسبت به سایر دام‌ها در منطقه، میتوان احتمالاًً نقش بیشتری در انتقال آلودگی به انسان برای گاو در منطقه مورد مطالعه در نظر گرفت، گرچه به نظر بعضی محققین احتمال انتقال آلودگی ازگاو به انسان بدلیل مرده بودن اکثر کیستهای نسجی در گاو،کمتر است (14).

اگرچه نتایج به دست آمده در این مطالعه در مورد گوسفند و بز در مقایسه با اکثر مناطق همخوانی دارد اما در مورد شیوع توکسوپلاسما در گاو در مقایسه با استان‌های همجوار نیز، میزان آلودگی بیشتر را نشان می‌دهد  همچنین با توجه به اینکه در مطالعه حاضر نمونه گیری از دام‌ها در فصل بهار انجام گردیده و با توجه به پوشش گیاهی تازه در این فصل در ارتباط با بز و گوسفند که در مرتع تغذیه می‌شوند درصدهای به دست آمده را می‌توان قابل قبول دانست.

از سایر دلایل احتمالی شیوع متفاوت در مناطق مختلف میتوان به تنوع روش‌های مختلف سرمی به کاررفته، حساسیت متفاوت حیوانات مختلف به انگل، سن متفاوت دام در هنگام بررسی، استاندارد‌های بهداشتی مناطق مختلف و فراوانی متفاوت گربه‌ها در این مناطق باشد(22).

اگرچه افزایش سن دام شانس ابتلا به این انگل را بالا می‌برد و در این مطالعه  نیز سن متوسط دام‌های  مولد بیش از دام‌های پرواری بود، و میزان آلودگی در گوسفندان ماده بیشتر ازجنس نر بوده اما در گاوهای ماده به طور معکوس این میزان کمتر از گاو نر بدست آمد. در هر حال با توجه به محدودیت مطالعه در تهیه تعداد دام‌های ماده، نتایج تست آماری، اختلاف معنی‌داری را در ابتلای بین دو جنس نشان نداد (جدول 2).

همچنین گرچه دام‌های مورد مطالعه اکثراً از منطقه کردستان بودند، اما نژاد دقیق آن‌ها تعیین نشد و در مورد تأثیر نژاد در میزان ابتلا به انگل توکسوپلاسما نیز گزارشی مشاهده نشد.

در مطالعه منتشر نشده که توسط مولفین مقاله در سال جاری در دختران دانشجوی این دانشگاه انجام گرفت نیز میزان شیوع آلودگی به توکسوپلاسما 5/18درصد بدست آمد که با متوسط شیوع آلودگی در دام‌های منطقه همخوانی دارد.

نتیجه گیری: باتوجه به اینکه یکی ازراه‌های مهم انتقال بیماری توکسوپلاسموز در انسان مصرف گوشت است و با توجه به شیوع توکسوپلاسما دردام‌های استان وبویژه در گاوها، آموزش‌های لازم مبنی برعدم مصرف گوشت وفرآورده‌های گوشتی نپخته و کم پخته، ارائه و مسئولان بهداشتی اقدامات لازم در جهت آگاهی نسبت به راه‌های پیشگیری و کنترل آلودگی به انگل ارائه دهند. همچنین با توجه به تنوع و حساسیت متفاوت روش‌های تشخیصی در دسترس و نتایج متغییر بدست آمده در دنیا پیشنهاد می‌شود مطالعات جامعی با بکارگیری همزمان روش‌های مختلف الایزا، PCR یا واکنش زنجیره پلیمراز، آگلوتیناسیون تغییر یافته و آنتی بادی فلورسنت غیرمستقیم در منطقه برای مقایسه درصد‌های بدست آمده انجام گیرد

تشکر و قدردانی

این پژوهش به عنوان طرح تحقیقاتی دانشجویی با حمایت مالی معاونت تحقیقات و فن آوری دانشگاه علوم پزشکی کردستان با شماره ثبت 232 انجام شده است، و از کشتارگاه صنعتی دام سنندج و آقای سامان فریدی برای همکاری جامع با محققین این مطالعه نهایت تشکر و قدردانی می‌شود.

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.