بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک ناشی از تجویز عصاره منتا اسپیکاتا در پانکراس رتهای دیابتی شده با آلوکسان

*) نویسنده مسئول:  تلفن: 33654214-023  نمابر: 33654215-023   Email: ajavaheri@semnan.ac.ir

دیابت ملیتوس یک رخداد اپیدمیک در بزرگسالان است که در طی آن نقص در ترشح انسولین یا عملکرد آن منجر به افزایش قند خون  و متعاقب آن اختلالات کلیوی، حمله‌ قلبی، کوری و قطع اعضای حرکتی پایینی بدن می‌شود  این بیماری در بین مردم جهان از 171 میلیون نفر در سال 2000 به 366 میلیون نفر در سال 2030 رو به افزایش خواهد‌بود. در حال حاضر دیابت چهارمین علت اصلی مرگ در اغلب کشورهای پیشرفته می‌باشد (21). در ایران دو میلیون نفر مبتلا به دیابت تشخیص داده شده‌اند (14) ولی به نظر می‌رسد با توجه به نوع جیره غذایی و عدم تشخیص در سطح گسترده میزان ابتلا بسیار بیش از این تعداد باشد. دیابت ملیتوس به عنوان یک بیماری مزمن خود‌ایمن باعث تخریب پیش‌رونده‌ سلول‌های بتا جزایر لانگرهانس که تولید کننده‌ انسولین هستند می‌شود (26). علت اصلی مرگ و میر در دیابتی‌ها تجمع چربی در حاشیه رگ‌های بزرگ و کوچک و آترواسکلروز ناشی ار آن می‌باشد (32). عوارض دیابت شامل‌هایپرگلایسمی مزمن، پلی‌اوری، پلی‌دیپسی، پلی‌فاژی، ضعف و لاغری است (29،13). در دیابت افزایش محصولات استرس اکسیداتیو خطر اصلی برای سلول‌های بتا محسوب می‌شود (15). درمان اولیه این عوارض شامل کنترل رژیم غذایی، ورزش و استفاده از داروها و رژیم‌های کاهش دهنده‌ قند و چربی خون می‌باشد(6). داروهای مورد استفاده برای مقابله با دیابت شامل سولفونیل‌اوره‌آ‌ها، بایگوآنیدین‌ها، گلنیدها و مهارکننده‌های آلفا‌گلوکوزیداز هستند که عوارض جانبی متعددی نظیر بروز شوک‌هایپوگلایسمیک، افزایش ذخایر چربی و تخریب کبد و کلیه‌ها دارند (2،4،22،31،32). با توجه به عوارض نامطلوب هر کدام از روش‌های درمانی مدیریت دیابت با مضرات کمتر هنوز چالش برانگیز است (15). گلی‌بنکلامید به عنوان داروی مؤثر در درمان دیابت ملیتوس از طریق افزایش ترشح انسولین به واسطه‌ متوقف کردن کانال‌های پتاسیمی حساس به آدنوزین تری فسفات در سلول‌های پانکراس مورد استفاده قرار می‌گیرد (9). مصرف دراز مدت این دارو منجر به بروز عوارض قلبی‌عروقی و تغییراتی در عملکرد اندوتلیوم عضله صاف و تحریک سلول‌های اندوتلیال به پرولیفراسیون می‌شود. اثر کاهش‌دهندگی قند خون در بسیاری از گیاهان داروئی از جمله جنس منتا در مدل‌های حیوانی و مطالعات بالینی بررسی شده و مورد تایید قرار‌گرفته است (3،8،25).  منشأ منتا اسپیکاتا از خانواده‌ لامیاسه‌آ و از شرق آسیاست. دو نوع منتا در این خانواده وجود دارد که به نام‌های منتا اسپیکاتا و منتا پایپریتا می‌‌باشند (27،28). ترکیبات به‌دست ‌آمده از منتا شامل: کارونه، لیموننه، سیس‌‌کاروئول، 1و8‌ سینئول، سیس‌دهیدروکاروئول، کارویل‌استات، سیس‌سابیننه‌ هیدرات عموما از روغن‌‌های فرار هستند. منتا دارای آنتی‌اکسیدانی قوی به نام اسید ‌رزمارینیک می‌باشد که در درمان بیماری‌های التهابی ریه، آرتریت اتوایمیون و بیماری‌های قلبی کاربرد دارد. تجویز خوراکی منتا پایپریتا اثر هیپوگلایسمیک معنی‌داری را در موش‌های دیابتی‌شده با آلوکسان می‌تواند ایجاد کند(2). آلوکسان از اکسیداسیون اسید‌اوریک حاصل شده و قادر به تخریب سلول‌های بتا جزایر لانگرهانس از طریق تولید رادیکال‌های آزاد سوپر-اکسید و هیدروژن‌پراکسید و القاء آپوپتوز و ایجاد دیابت است (10،11،19،24). این مطالعه بر مبنای تکیه بر ظرفیت بالای آنتی-اکسیدانی عصاره منتا اسپیکاتا جهت بررسی تأثیر مصرف این عصاره در مقایسه با داروی گلی‌بنکلامید بر تغییرات هیستوپاتولوژیک ناشی از اثر آلوکسان بر پانکراس رت‌های دیابتی انجام شده است.

مواد و روش کار

عصاره منتا اسپیکاتا به روش استاندارد از برگ‌های این گیاه تهیه شده و LD50 آن با گایدلاین OECD به شماره 423  به مقدارmg 1500  به ازای هر کیلوگرم وزن بدن محاسبه شد.20 % از این مقدار عصاره به میزان mg 300 به ازای هر کیلوگرم وزن بدن برای انجام مطالعه در نظر گرفته شد. تعداد 24 قطعه رت نر نژاد ویستار به وزن g 20±180 انتخاب شده و به صورت تصادفی در چهار گروه شش تایی دسته‌بندی شدند.گروه اول رت‌های سالم (کنترل منفی) بودند که به این گروه در طی آزمایش سرم فیزیولوژی به مقدار ml/kg 10 تزریق ‌‌شد. گروه دوم رت‌های دیابتی شده با آلوکسان (کنترل مثبت)، گروه سوم رت‌های دیابتی و درمان شده با گلی‌بنکلامید به مقدار mg/kg  2 و گروه چهارم گروه دیابتی و درمان شده با عصاره آبی منتا اسپیکاتا به مقدار mg/kg 300 بودند. القاء دیابت در گروه‌های 4و3و2  از طریق تزریق داخل صفاقی محلول آلوکسان‌ مونوهیدرات به میزان mg/kg 140 انجام شد. پس از تثبیت قند‌خون ناشتای رت‌ها در بالای mg/kg 130 گروه‌های مذکور تحت درمان‌های مورد نظر قرار گرفتند. اندازه‌گیری قند‌ خون ناشتا در روزهای 7 و14 و21 نیز تکرار شد. به گروه سوم از روز ششم به بعد به مدت 15 روز گلی‌بنکلامید و به گروه چهارم نیز عصاره منتا اسپیکاتا به مدت 15 روز به صورت خوراکی تجویز شد. در روز 22 پانکراس همه نمونه‌ها طی کالبد گشایی خارج شده و  از هرکدام از پانکراس‌ها 2 قطعه نمونه مناسب انتخاب شده و از هرکدام از نمونه‌ها 4 برش‌ به ضخامت 6 میکرون و با رعایت فاصله مناسب برش‌ها از هم تهیه شد. نیمی از این برش‌ها با H&E و نیم دیگر با روش گومری برای تفریق سلول‌های α و β رنگ‌آمیزی شدند. ‌مقاطع رنگ‌آمیزی شده با  H&E در گروه‌های مختلف از نظر تعداد و اندازه جزایر لانگرهانس، تراکم سلولی در این جزایر، مقایسه نسبت اندازه جزایر به اندازه بافت پانکراس و همچنین حضور تغییرات التهابی و تغییرات آپوپتوتیک مورد توجه قرار گرفتند. در مقاطع رنگ‌آمیزی شده با رنگ‌ آمیزی افتراقی گوموری‌ تغییرات ایجاد شده در تعداد و نسبت سلول‌ها در نواحی مختلف جزایر بر اساس محل‌های کلاسیک حضور سلول‌های آلفا و بتا مورد توجه قرار گرفتند. مقایسه آماری بین گروه‌های مختلف نمونه‌ها از نظر وسعت جزایر، تراکم سلولی در جزایر، نسبت سلول‌های آلفا و بتا به مساحت جزایر با استفاده از آزمون‌های آنالیز واریانس یک طرفه و تعقیبی توکی در نرم افزار آماری SPSS انجام گرفت. اندازه‌گیری وسعت جزایر و مساحت فیلد‌های میکروسکوپی با استفاده از نرم افزار AxioVision LE انجام گرفت. در این تحقیق سعی شده است با مشاهده تعداد هرچه بیشتری از جزایر  در نمونه‌های متنوع تهیه شده از نواحی مختلف پانکراس نمونه‌ها امکان اشتباه را به حداقل رساند.

نتایج

در جدول 1  اثر گلی بن کلامید با اثرعصاره منتا اسپیکاتا بر گلوکز خون رت‌های گروه‌های مختلف مقایسه شده است. در طی مصرف گلی‌بنکلامید در گروه 3 و عصاره منتا اسپیکاتا در گروه 4 تا روز بیست ویکم میزان گلوکز خون به شدت کاسته شده است. به طوری که در روز هفتم اختلاف میزان قند خون بین گروه کنترل دیابتی و گروه‌های 3 و 4  معنی‌دار بود (0.05>P). همچنین در روز‌های چهاردهم و بیست ویکم نیز بین گروه‌های 2 و 3 و 4 اختلاف معنی‌دار مشاهده شد.

مشاهده مقاطع رنگ‌آمیزی شده با H&E نشان ‌داد که اندازه سطح جزایر در گروه‌های مختلف و در نواحی مختلف یک شان میکروسکوپی تفاوت زیادی با هم دارند (تصویر 1). با توجه به احتمال برش و تهیه مقطع از نواحی مختلف جزایر این تفاوت می‌تواند ناشی از تفاوت اندازه واقعی جزایر بوده یا در اثر بریده شدن از مناطق مختلف ایجاد شده باشد. در این تحقیق برای جلوگیری از تأثیر این احتمال در نتایج در همه نمونه‌ها موارد متعددی برش میکروسکوپی با فواصل منظم از بلوک‌ها تهیه شده و در هر برش نیز چندین زمینه میکروسکوپی مورد ارزیابی قرار گرفتند. در زمینه تفاوت در اندازه جزایر، بخصوص در گروه کنترل دیابتی نسبت به گروه کنترل منفی اندازه‌ جزایر به وضوح کوچک‌تر بودند. برآیند کلی مشاهده مقاطع در گروه‌های مختلف نشان داد که اندازه سطح جزایر در گروه کنترل دیابتی نسبت به سایر گروه‌ها کوچک‌تر بوده و  بین لبول‌ها نیز فاصله بیشتری مشاهده می‌شود (تصویر2). با توجه به تفاوت پروتکل درمانی، اندازه جزایر موجود در گروه‌های 3 و 4  تفاوت معنی‌داری را با نمونه‌های گروه 1 نشان نمی‌دادند (تصاویر3،4) و (جدول 2).  محل حضور سلول‌های بتا به صورت غالب در مناطق مرکزی جزایر و محل استقرار سلول‌های آلفا بیشتر در حاشیه جزایر است. در رنگ‌آمیزی با روش گوموری نیز که در آن سلول‌های آلفا به رنگ قرمز و سلول‌های بتا  به رنگ آبی رنگ‌آمیزی می‌شوند (تصویر5). در مشاهدات میکروسکوپی در نمونه‌های کنترل دیابتی نسبت به موارد کنترل منفی تراکم سلولی کاهش یافته بود. ضمن اینکه در بخش‌های مرکزی جزایر بزرگ‌تر که اصولاً باید محل استقرار سلول‌های بتا باشد این کاهش تراکم بیشتر بود (تصویر6). در اغلب نمونه‌ها هسته‌های تعداد قابل توجهی از سلول‌ها به صورت پیکنوزه و با کروماتین فشرده خودنمایی می‌کردند. هم‌چنین بخش قابل توجهی از سلول‌های جزایر حاوی سیتوپلاسم کف‌آلود و غیر‌یکنواخت و بعضا فاقد هسته بودندکه می‌تواند بیانگر کاریولیز و حذف هسته‌ها و ادامه روند تحلیل سلولی باشد. در موارد متعددی از نمونه‌های کنترل دیابتی اطراف هسته‌های پیکنوزه را سیتوپلاسم متمایل به ارغوانی‌صورتی و با حجمی بسیار کمتر از سلول‌های طبیعی فرا گرفته بود که به عنوان اجسام آپوپتوتیک می‌تواند بیانگر وقوع آپوپتوز در بافت مورد مشاهده باشد (تصویر 6). در تعدادی از شان‌های میکروسکوپی در نمونه‌های کنترل دیابتی شواهدی از جایگاه‌های استقرار جزایر به صورت حفره‌های توخالی دیده می‌شد که بیانگر حذف و جدا شدن جزایر از متن بافت در روند تهیه مقطع بودند. این مسئله می‌تواند نشان‌دهنده کاهش اتصال جزایر با بافت اطرافی خود و بیانگر بروز آتروفی در جزایر و آغاز روند حذف آن‌ها باشد.(تصویر 7).

در هیچ‌کدام از نمونه‌ها نشانه‌ای از بروز التهاب و پرخونی شدید مشاهده نشد که نشان می‌دهد کاهش حجم جزایر و کاهش تراکم سلولی در آن‌ها می‌تواند به علت فعال شدن روند آپوپتوز ناشی از آزاد شدن رادیکال‌های آزاد باشد. افزایش تعداد هسته‌های پیکنوزه و قطعات متراکم کروماتینی در سطح جزایر در گروه کنترل دیابتی می‌تواند نشانه افزایش آپوپتوز  باشد. در مشاهده کلی بخش قابل ملاحظه‌ای از سطح شان‌ها را در گروه‌ کنترل دیابتی سطوح خالی موجود در بینابین لبول‌های پانکراس تشکیل می‌داد. به نظر می‌رسد این پدیده ناشی از تحلیل جزایر و جمع شدن لبول‌های پانکراس باشد.. همانطور که در جدول 2 نشان داده شده است براوردهای عددی در اندازه گیری دقیق سطح کلی جزایر در لام‌های رنگ‌آمیزی شده با H&E نشان ‌داد که اندازه کلی سطح این جزایر در گروه کنترل دیابتی نسبت به گروه کنترل منفی و گروه‌های درمان شده با گلی‌بنکلامید و عصاره منتا اسپیکاتا  کمتر است و بین اندازه این جزایر در گروه کنترل دیابتی با سایر گروه‌ها اختلاف معنی‌دار آماری وجود دارد(0.05>P) ولی با وجود بزرگ‌تر بودن اندازه متوسط این جزایر در گروه کنترل منفی نسبت به گروه‌های 3و4 تفاوت معنی‌داری بین آن‌ها مشاهده نمی‌شود. هم‌چنین متوسط اندازه جزایر در گروه 3 بیش از متوسط اندازه جزایر در گروه 4 و  البته بدون وجود اختلاف آماری معنی‌دار بود. گروه‌های مورد آزمون در این تحقیق از نظر تراکم سلول‌ها در هر میلی‌متر مربع از جزایر نیز مورد مقایسه قرار گرفتند. بررسی آماری نشان ‌داد که تراکم سلولی در نمونه‌های کنترل منفی(سالم) با اختلاف معنی‌دار (0.05>P) بیشتر از نمونه‌های دیابتی بود. در گروه‌های 3 و 4 نیز این تراکم کمتر از گروه کنترل منفی ولی بیش از گروه کنترل دیابتی بود ولی اختلاف آماری معنی‌داری بین گروه‌های اخیر مشاهده نشد. با توجه به تفریق سلول‌های آلفا از سلول‌های بتا در نمونه‌های رنگ‌آمیزی شده با گوموری، مشاهدات نشان ‌داد که تراکم سلول‌های آلفا در نمونه‌های مختلف از گروه‌های متفاوت اختلاف چندانی با هم ندارند. با توجه به کاهش کلی تعداد سلول‌ها در جزایر در نمونه‌های کنترل مثبت، این کاهش صرفا می‌تواند مربوط به کاهش سلول‌های بتا باشد. کاهش کلی تراکم سلولی و کاهش نسبی سلول‌های بتا در جدول 2 نشان داده شده است.

بحث

آلوکسان به طور گسترده در القاء دیابت وابسته به انسولین در مدل‌های مختلف حیوانی استفاده می‌شود و این اثر از طریق تولید رادیکال-های آزاد به ظهور می‌رسد(7). این ترکیب از طریق افزایش کلسیم آزاد سیتوزول سلول‌های بتا با افزایش نفوذ‌پذیری غشاء میتوکندری و در نتیجه خروج سیتوکروم C منجر به القاء آپوپتوز در این سلول‌ها می‌گردد (16). مطالعات گذشته نشان دادند که بسیاری از گیاهان اثرات سودمندی بر‌روی کنترل قند خون و سطح چربی پلاسما دارند(5،30). خانواده لامیاسه‌آ به علت خواص آنتی‌اکسیدانی خوبی که دارند به طور گسترده برای اهداف گوناگون مورد استفاده است. این گروه از گیاهان در ایران به عنوان جوشانده و چای گیاهی استفاده می‌شوند (23). منتا پایپریتا یکی از 10 گیاهی است که به طور گسترده در برزیل استفاده می‌شود (5). این گیاه در درمان کاهش اشتها، سرماخوردگی، برونشیت، تب و تهوع مورد استفاده قرار می‌گیرد (1). توان آنتی اکسیدانی منتا اسپیکاتا در مطالعه‌ای تو سط Jebeli  در سال 2013 انجام گرفته و بر بالا بودن این خصوصیت تاکید شده است ولی در مورد تأثیر آن بر کاهش اثرات نامطلوب ناشی از دیابت گزارشی مشاهده نشده است. El-Desouki و همکاران در سال 2015 در گزارشی از مشاهدات میکروسکوپی پانکراس رت‌های دیابتی شده با آلوکسان وجود مناطق نکروزه و تراکم فیبر در سطح جزایر و هم‌چنین واکوئله شدن سلول‌های جزایر و تراکم فیبر در اطراف رگ‌های خونی را گزارش کردند . در این مطالعه واکوئله شدن سلول‌ها به وضوح قابل مشاهده بود ولی تراکم فیبر در اطراف رگ‌های خونی و نکروز گسترده مشاهده نشد. از آن‌جا که تأثیر آلوکسان بر سلول‌ها منجر به بروز  آپوپتوز می‌گردد بروز نکروز  یا شروع روند فیبروز در این شرایط چندان محتمل به نظر نمی‌رسد. در این مطالعه همچنین در جزایر لانگرهانس رت‌های دیابتی کاهش تعداد سلول‌ها در واحد سطح و هم‌چنین واکوئله شدن سلول‌ها مشاهده شد. مطالعات Angel و همکاران در سال2013 نشان داد که پپرمینت اثر قابل توجهی در کاهش قند خون دارد. در این مطالعه نیز اثبات شد که عصاره منتا اسپیکاتا می‌تواند در بهبود آثار دیابت ملیتوس مؤثر واقع گردد. Kumar و Sai Sailesh در سال2014 اثرات خانواده منتا در درمان دیابت را مورد بررسی قرار دادند و نتیجه گرفتند که منتا به واسطه تحریک بیشتر سلول‌های بتا تخریب نشده و بازسازی سلول‌های تخریب شده سبب کاهش قندخون در رت‌ها می‌شود. در مطالعه  حاضر شاهدی مبنی بر توانایی تکثیر سلولی برای سلول‌های بتا از طریق وجود عصاره منتا اسپیکاتا مشاهده نشد. بنابر این به نظر می‌رسد  تنها اثری که عصاره منتا اسپیکاتا بر‌روی سلول‌های بتا جزایر لانگرهانس دارد این است که از طریق اعمال اثر آنتی‌اکسیدانی بالا از آثار مخرب رادیکال‌های آزاد بر‌روی سلول‌های بتا جلوگیری به عمل می‌آورد. Kumar و همکاران در سال 2011  در مطالعات هیستوپاتولوژیک بیان کردند که در رت‌های دیابتی شده با آلوکسان آسیب شدیدی به جزایر لانگرهانس وارد شده و کاهش ابعاد جزایر نیز مشاهده شد. همچنین افزایش سطح قند خون و تری‌گلیسیرید و کلسترول تام را به اثبات رساندند. Suni و همکاران در سال2009  نشان دادند که سطح قند خون نیز در رت‌های دیابتی شده با آلوکسان افزایش پیدا کرده و جزایر لانگرهانس پانکراس رت‌های دیابتی کاهش واضحی در تعداد سلول‌های بتا و آتروفی سلول‌های بتا داشته است. تغییرات دژنراتیو عروقی در جزایر در رت‌های دیابتی بیان گردید. هم‌چنین در رت‌های درمان شده با گلی‌بنکلامید افزایش قابل توجهی در تعداد جزایر در مقایسه با دیابتی‌های درمان نشده دیده شد. نتایج به دست آمده از تحقیق حاضر نیز تایید کننده اثر درمانی عصاره نعنا بر روی رت‌های دیابتی بوده و آثار درمانی عصاره نعنا را نزدیک به گلی بنکلامید معرفی می‌کند. البته با وجود این همخوانی در نتایج در این تحقیق آثاری از تغییرات دژنراتیو در عروق بافت پانکراس مشاهده نشد. در مطالعه Jelodar و همکاران در سال 2007 تراکم سلول‌های بتا، تراکم جزایر، نسبت سلول‌های بتا به کل سلول‌ها‌، تعداد جزایر در هر میلی‌متر مربع و اندازه متوسط جزایر بررسی شده و نتیجه این بود که در رت‌های دیابتی همه‌ این موارد کاهش یافته است. تغییرات هسته اعم از پیکنوز و کاریولیز، بخصوص در اطراف رگ‌های بزرگ و کاهش شدید در تعداد سلول‌های بتا نیز توسط این محقق گزارش شده است این مطالعه نیز با استفاده از رنگ‌آمیزی تفریقی گومری نشان داد که نسبت سلول‌های بتا به کل سلول‌ها‌  سلول‌ها در بافت جزایر نمونه‌های دیابتی کاهش معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل منفی دارد در حالی که این تفاوت بین گروه‌های درمان شده با گلی‌بنکلامید و عصاره نعنا فاقد اختلاف معنی‌دار است.. در مقاطع رنگ‌آمیزی شده با H&E در این تحقیق نیز کاهش تراکم سلول‌های بتا و کاهش اندازه جزایر در رت‌های دیابتی دیده شده و هم‌چنین تغییرات هسته مانند پیکنوز و کاربولیز  هسته در رت‌‌های دیابتی شده بررسی و اثبات گردید. در نتایج این طرح شواهد کافی مبنی بر بروز آپوپتوز نیز در این جزایر مانند تراکم و خرد شدن هسته‌ها و وجود سیتوپلاسم ائوزینوفیلی در اطراف قطعات هسته ارائه شده است.. در مطالعه حاضر نشانه‌ای مبنی بر توانایی القاء تکثیر سلولی برای سلول-های بتا از طریق عصاره منتا اسپیکاتا مانند حضور مراحلی از تقسیمات میتوزی مشاهده نشد.

نتیجه گیری: در واقع اثری که عصاره منتا اسپیکاتا  بر‌روی سلول‌های بتا جزایر لانگرهانس از خود نشان داد ناشی از اثر آنتی‌اکسیدانی زیاد آن بوده که در مطالعات قبلی بر آن تاکید شده است و به نظر می‌رسد که از این طریق از گسترش آثار مخرب رادیکال‌های آزاد بر-روی سلول‌های بتا جلوگیری به عمل می‌آورد و استفاده از آن در طول مدت انجام این تحقیق توانسته است باعث بازیافت توانایی این سلول‌ها در تولید انسولین کافی بشود. با توجه به نتایج حاصل از این تحقیق و با عنایت به اثر  آنتی‌اکسیدانی و آنتی‌دیابتیک این عصاره به نظر می‌رسد در صورت انجام تجربیات بیشتر به‌خصوص در زمینه تخلیص مواد مؤثر آنتی‌اکسیدان موجود در این عصاره و در صورت اثبات کمتر بودن اثرات جانبی نامطلوب این عصاره در مصرف دراز مدت در مقایسه با داروی گلی‌بنکلامید و داروهای شیمیایی با اثرات مشابه میتوان نسبت به تهیه داروی کاربردی مناسب برای کاهش قند خون و تعدیل اثرات نامطلوب دیابت از این گیاه امیدوار بود

تشکر و قدردانی

نویسندگان از معاونت و پرسنل محترم پژوهشی دانشگاه سمنان، همکار گرامی آقای دکتر اشکان جبلی جوان و آقای مهندس مرتضی صابری کارشناس آزمایشگاه تهیه مقاطع و خانم دکتر مهسان بیانی جهت همکاری در اجرای این پژوهش تقدیر و تشکر به عمل می‌آورند.

                                                                                                     تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.