مقدمه

پاروویروس سگ‌سانان از مهم‌‌ترین عوامل گاستروآنتریت شدید در سگ‌سانان اهلی و وحشی سراسر جهان می‌باشد که به‌طور قابل‌توجهی سلامت و بقای آن­ها را تحت تأثیر قرار می‌دهد(1). این ویروس کوچک و بدون پوشینه متعلق به خانواده پاروویریده و دارای دو تیپ CPV-1 و CPV-2 است. از سال ۱۹۷۲ و همه‌گیری CPV-2، این ویروس دچار تغییرات آنتی‌ژنیک متعددی شد. در حال حاضر سه تحت تیپ CPV-2a، CPV-2b و CPV-2c جانشین واریانت آنتی‌ژنیک اصلی شده‌اند. در ایران نخستین گزارش جداسازی پاروویروس سگ­سانان در سال 2002 توسط Hemmatzadeh و Jamshidi انجام شد (2). در حال حاضر طبق مطالعات انجام‌شده سویه غالب در گردش ایران CPV-2a گزارش شده است (3، 4). این بیماری که با علائمی، از‌جمله استفراغ شدید، اسهال خونی، دهیدراتاسیون و حتی سرکوب ایمنی شناخته می‌شود، به‌طور خاص در سگ‌های غیر‌واکسینه و توله‌ها، مرگ‌و‌میر بالایی را رقم می‌زند (5، 6). پاروویروس به‌علت فقدان پوشینه، در برابر مواد ضد‌عفونی‌کننده مقاومت بالایی دارد و در محیط بسیار پایدار است (7). همگامی این ویژگی با دفع مقادیر زیاد ویروس توسط توله‌های مبتلا، انتقال آن را به‌ویژه در محیط‌هایی مانند مراکز پرورش و نگهداری بسیار میسر کرده است. تشخیص زود‌هنگام این بیماری می‌تواند در مدیریت درست و به‌موقع آن مؤثر واقع شود. روش‌های آزمایشگاهی متعددی برای تشخیص این بیماری از‌جمله جداسازی ویروس، روش مولکولی (PCR) و روش‌های ایمنی‌شناختی (الایزا و ایمونوفلورسانس) و میکروسکوپ الکترونی به کار گرفته می‌شود. با‌این‌حال این روش‌های تشخیصی با محدودیت‌های قابل‌توجهی، از‌جمله نیاز به تجهیزات پیشرفته، زیرساخت‌های آزمایشگاهی تخصصی، نیروی انسانی مجرب و فرایندهای زمان‌بر و تحمیل هزینه‌های زیاد همراه می‌باشند (8). البته روش‌های دیگری، از‌جمله ایمونوکروماتوگرافی، هماگلوتیناسیون و ممانعت از آن، آزمون آگلوتیناسیون لاتکس و آزمون آگلوتیناسیون همراه نیز برای تشخیص سریع این ویروس طراحی شده‌اند. باوجوداین، گاه عدم دسترسی به مواد مورد‌نیاز و یا نبود صرفه اقتصادی در جمعیت زیاد، در بسیاری از موارد به عدم مدیریت به‌موقع و شیوع مقطعی این ویروس، به‌خصوص در مراکز پرورش و نگهداری سگ­ها منجر شده است (8، 9). روش‌ آگلوتیناسیون روی لام که از روش هماگلوتیناسیون اقتباس شده است، با تکیه بر توانایی پاروویروس در آگلوتینه کردن گلبول‌های قرمز به تشخیص آن می‌پردازد (10). گلبول‌های قرمز تازه خوک بالاترین حساسیت و سازگاری را برای آزمایش آگلوتیناسیون ارائه می‌دهند، اما به‌علت محدودیت‌ دسترسی در کشور‌های اسلامی، انجام مطالعه روی آن‌ها میسر نیست (11). از‌آنجا‌که در بسیاری از کشورها محدودیتی برای استفاده از خون خوک در آزمون آگلوتیناسیون وجود ندارد، مطالعات اندکی در‌زمینه به‌کارگیری اریتروسیت سایر پستانداران انجام شده است. برای رفع این محدودیت، در مطالعه حاضر از اریتروسیت گربه که به‌مراتب در دسترس‌تر است، به‌منظور انجام آگلوتیناسیون روی لام استفاده شده است.

مواد و روش کار

حیوانات تحت مطالعه: مطالعه حاضر بر روی 33 قلاده سگ زیر 1 سال، در نژاد‌های مختلف که با علائم بالینی مشکوک به عفونت پاروویروسی شامل استفراغ، اسهال، بی‌اشتهایی و بی‌حالی به بیمارستان ارجاع داده شده بودند، انجام گرفت. برای غربالگری اولیه، از کیت‌های سریع ایمونوکروماتوگرافی ساخت شرکت Quicking Biotech استفاده شد. آزمون بر‌اساس دستورالعمل کارخانه سازنده انجام شد. به این ترتیب که مقدار کمی از نمونه مدفوع تازه در بافر استخراج کیت، سوسپانسیون شده و سپس ۲ تا 3 قطره از محلول به چاهک تست ریخته شد. نتیجه آزمون پس از ۵ تا 10 دقیقه بر‌اساس ظاهر شدن خطوط رنگی در ناحیه کنترل و آزمون خوانده شد. نمونه‌هایی که در آن‌ها هر دو خط ظاهر شدند، به‌عنوان مثبت و نمونه‌هایی که فقط خط کنترل داشتند، به‌عنوان منفی در نظر گرفته شدند. تنها سگ‌هایی که نتیجه کیت تشخیص سریع آن‌ها مثبت بود، برای بررسی‌های بعدی با روش آگلوتیناسیون روی لام و آزمون ممانعت از آگلوتیناسیون وارد مطالعه حاضر شدند.

جمع­آوری نمونه­های بالینی: برای انجام آزمایش آگلوتیناسیون، نمونه مدفوع تازه به‌وسیله یک سواب استریل، از ناحیه راست‌ روده حیوانات مشکوک به عفونت جمع‌آوری شد و پس از تهیه سوسپانسیون 10 درصد با بافر فسفات سالین (2/7pH=)، به‌منظور حذف ذرات معلق سانتریفیوژ شد و مایع رویی از فیلتر سر سرنگی 45/0 میکرومتر عبور داده شد و نمونه حاصل در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. برای انجام آزمون ممانعت از آگلوتیناسیون‌ (SIT)‌، به سرم‌های دارای آنتی‌بادی اختصاصی نیاز بود. ازاین‌رو سرم از سگ‌هایی تهیه شد که عفونت آن‌ها به‌طور قطعی با روش PCR تأیید شده بود تا سرم‌های هایپرایمیون لازم برای انجام SIT با دقت کافی فراهم شود. نمونه‌های خون از ورید سفالیک در لوله‌های فاقد ماده ضدانعقاد جمع‌آوری، سپس با سرعت × g 1200 به‌‌مدت 3 دقیقه سانتریفیوژ شدند و سرم‌های حاصل تا زمان انجام آزمون در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

آزمایش آگلوتیناسیون روی لام: این آزمایش بر‌اساس روش کار پیشنهادی Marulappa و همکاران در سال 2009 انجام شد (10). بدین‌منظور در روز مورد‌نظر، 1 میلی­لیتر خون از 1 گربه و 1 میمون رزوس سالم که به بیمارستان مراجعه کرده بودند در لوله دارای ماده ضد‌انعقاد آلسور اخذ و برای جداسازی گلبول‏های قرمز، 3 مرتبه با سرم فیزیولوژی شست‌وشو و سانتریفیوژ شد. در هر مرتبه، نمونه‌ها به‌مدت 10 دقیقه با سرعت × g 2000 سانتریفیوژ شدند و پس از هر بار سانتریفیوژ، مایع رویی به‌دقت دور ریخته شد و رسوب گلبول‌های قرمز مجدداً با سرم فیزیولوژی مخلوط گردید و از رسوب حاصل از شست‌وشوی مرتبه سوم، سوسپانسیون 3 درصد از گلبول قرمز تهیه شد (11). رقت ۱:۲ از نمونه‌های مدفوعی مورد‌بررسی، در بافر فسفات سالین تهیه شد. برای ارزیابی آگلوتیناسیون، روی دو لام شیشه­ای مجزا 50 میکرولیتر از نمونه مدفوع، در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد (محیط) قرار داده شد و همه این مراحل در دماهای ۴ (یخچال) و ۳۷ درجه سانتی‌گراد (داخل انکوباتور) نیز برای تمام نمونه­ها تکرار شد. در هر سه حالت، به یکی از لام‌ها 50 میکرولیتر خون گربه سالم و به لام دیگر 50 میکرولیتر خون میمون رزوس سالم اضافه شد. نمونه مدفوع و خون قرارگرفته بر روی هر لام با استفاده از هم‌زن به‌مدت ۳۰ ثانیه به‌طور یکنواخت مخلوط شدند. زمان لازم از لحظه مخلوط شدن تا شروع آگلوتیناسیون برای هر نمونه خون در هر‌یک از دماها با دقت برحسب ثانیه ثبت و همچنین شدت آگلوتیناسیون نیز با نور چراغ مطالعه ارزیابی شد. در ثبت نتایج، مواردی به‌عنوان مثبت در نظر گرفته شدند که آگلوتیناسیون به‌صورت تشکیل ذرات غیرهمگن آشکار بود؛ در مقابل، نمونه‌هایی که خون ترکیب‌شده با نمونه مدفوعی پس از گذشت 10 دقیقه همگن باقی مانده و هیچ اثری از آگلوتیناسیون نشان ندادند، به‌عنوان موارد منفی در نظر گرفته ‌شدند (تصویر 1). نمایی شماتیک از روش انجام آزمون آگلوتیناسیون روی لام قابل‌مشاهده است (تصویر2-A‌).

آزمون ممانعت از آگلوتیناسیون: برای آزمایش ممانعت از آگلوتیناسیون، از سرم هایپرایمیون سگ‌های مبتلا به پاروویروس تأیید‌شده با روش مولکولی استفاده شد. نمونه خون دام‌های مورد‌نظر از ورید سفالیک در لوله‌های فاقد ماده ضدانعقاد جمع‌آوری شد. نمونه‌های مذکور به‌مدت ۱۵ دقیقه و با سرعت×g ۳۰۰۰ سانتریفیوژ شدند. سرم‌های جداشده در فریزر با دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند تا برای آزمایش استفاده شوند. برای بررسی ممانعت از آگلوتیناسیون، روی لام شیشه­ای ۵۰ میکرولیتر از نمونه مدفوع با محلول PBS به نسبت ۱:۲ رقیق شد و با ۵۰ میکرولیتر از سرم هایپرایمیون با رقت ۱:۲ مخلوط گردید. مخلوط به‌مدت ۵ دقیقه در دمای محیط انکوبه شد. سپس ۵۰ میکرولیتر از سوسپانسیون ۳ درصد اریتروسیت گربه و اریتروسیت رزوس به مخلوط اضافه شد. این ترکیبات در دماهای ۲۵، ۳۷ و ۴ درجه سانتی‌گراد برای مشاهده مهار آگلوتیناسیون توسط سرم هایپرایمیون بررسی شدند. عدم رخداد پدیده آگلوتیناسیون و باقی ماندن نمونه محلول به‌صورت هموژن، به‌عنوان نتیجه مثبت این آزمون تلقی شدند (تصویر 1). نمایی شماتیک از روش انجام آزمون ممانعت از آگلوتیناسیون روی لام قابل‌مشاهده است (تصویر 2-B‌).

برای ارزیابی صحت عملکرد و دقت نتایج، یک بار از PBS استفاده‌شده در رقیق‌سازی، به‌عنوان کنترل منفی و یک بار از نمونه‌ای که حضور پاروویروس تحت تیپ b2 در آن از‌طریق کشت سلولی و PCR تأیید شده بود، به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد. این کنترل‌ها به‌صورت هم‌زمان در هر دو آزمایش به کار گرفته شدند تا اعتبار آزمون تضمین شود.

کشت سلولی: سلول‌های دودمان MDCK (Madin-Darby Canine Kidney cell line) برای جداسازی ویروس استفاده شدند. این سلول‌ها که از بخش ویروس‌شناسی انستیتو پاستور ایران به شکل کرایوتیوب‌های مخصوص تهیه شده بودند، از تانک ازت دارای ازت مایع خارج و بلافاصله به انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد منتقل شدند تا از حالت انجماد خارج شوند. سپس سلول‌ها در محیط استوکر دارای 10 تا 15 درصد سرم جنین گوساله و کوکتل پنی‌سیلین + استرپتومایسین کشت داده شدند. پس از 48 تا 72 ساعت انکوباسیون، سلول‌ها به‌منظور تکثیر و پاساژ آماده شدند. محیط کشت قبلی تخلیه شد و سلول‌ها با تریپسین 25/0 درصد تیمار و پس از جداسازی، در فلاسک‌های جدید با تراکم مناسب کشت داده شدند. رشد سلول‌ها با استفاده از میکروسکوپ معکوس بررسی شد. حدود نیم تا 1 میلی‌لیتر از نمونه‌های ویروسی پس از سانتریفیوژ و عبور از فیلتر 22/0 میکرون در فلاسک‌های دارای سلول‌های MDCK و محیط کشت RPMI1640 تلقیح شدند. سپس فلاسک‌ها به‌مدت 1 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند تا ویروس به سلول‌ها متصل شود. پس از آن سلول‌ها شسته شدند و محیط نگهداری ارل ساخت مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی به آن‌ها اضافه شد. فلاسک‌ها در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. مدت‌زمان انکوباسیون هر پاساژ 48 ساعت بود و آسیب سلولی (CPE) هر 10 تا 15 ساعت با میکروسکوپ بررسی شد. نمونه‌هایی که طی سه پاساژ متوالی، هیچ‌گونه CPE‌، از‌جمله گرد شدن و جداشدگی نشان ندادند، به‌عنوان نمونه منفی در نظر گرفته شدند.

بررسی مولکولی: برای استخراج DNA، ابتدا سوسپانسیون ۲۰ درصدی از نمونه‌های مدفوع با استفاده از سرم فیزیولوژی در شرایط استریل تهیه شد و سپس با استفاده از کیت Bioneer ساخت کره جنوبی طبق دستورالعمل سازنده استخراج انجام شد. پرایمرهای مورد‌استفاده به‌منظور تشخیص و تعیین تیپ ویروس شاملp₂  برای تشخیص CPV-2،  p_bبرای تحت ‌تیپ CPV-2b و p_ab برای تحت ‌تیپ­های CPV-2a و CPV-2b  توسط شرکت سیناژن ایران طراحی شدند (جدول 1) (12، 13). در مرحله بعد 8 میکرولیتر از ONE STEP PCR PRE mix داخل میکروتیوب ریخته شد. سپس 2 میکرولیتر پرایمر فوروارد و Reverse داخل میکروتیوب ریخته شد و سپس 2 میکرولیتر از محصول به‌دست‌آمده از استخراج DNA اضافه شد و ترکیب حاصل با آب‌مقطر به حجم 20 میکرولیتر رسانده شد. واکنش PCR در دستگاه Thermal Cycler (BIO-RAD T100™) انجام شد. شرایط برنامه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت اولیه در 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 10 دقیقه، سپس 35 چرخه متوالی، شامل واسرشت (95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه)، اتصال (8/61 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 25 ثانیه) و طویل‌سازی (72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 45 ثانیه) بود. در پایان یک مرحله طویل‌سازی نهایی در 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 10 دقیقه انجام شد (5). محصولات نهایی PCR بر روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شد و پس از رنگ‌آمیزی با سایبرسیف، توسط دستگاه Trans eliminator بررسی شدند. اندازه قطعات تکثیرشده بر‌اساس پرایمرهای طراحی‌شده در جدول ۱، برای تیپ‌های مختلف ویروس مورد انتظار بود.

آزمون آماری: تجزیه‌و‌تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 16 انجام شد. برای یافتن رابطه بین متغیرهای کیفی با نتایج آزمون‌های تشخیصی از آزمون‌های مربع کای (Chi-square) و آزمون دقیق فیشر (Fisher’s Exact test) استفاده شد. مقایسه 

زمان آگلوتیناسیون بین دماهای مختلف در خون گربه و رزوس با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه (One-Way ANOVA) و آزمون تکمیلی (Post Hoc) توکی (Tukey) انجام شد. اختلاف زمان آگلوتیناسیون بین خون گربه و رزوس در دماهای مختلف با استفاده از آزمون t مستقل (Independent t test) انجام گرفت. حساسیت و ویژگی تست‌های تشخیصی نسبت به آزمون استاندارد طلایی (کشت) بررسی شد. برای مقایسه‌ درجه همخوانی روش‏های مختلف تشخیصی از ضریب توافق کاپا (Kappa value) استفاده شد و سطح معنی‌داری 05/0 در نظر گرفته شد.

نتایج

آزمون آگلوتیناسیون و ممانعت از آگلوتیناسیون: از مجموع ۳۳ نمونه‌ای که در بررسی با کیت ایمونوکروماتوگرافی مثبت تشخیص داده شده بودند، 13 نمونه در آزمون آگلوتیناسیون روی لام (SAT) مثبت تلقی شدند (جدول 2). در تمام این موارد به‌جز یک نمونه، گلبول‌های قرمز میمون رزوس و گربه در هر سه دمای 4، 25 و 37 درجه سانتی‌گراد در کمتر از 1 دقیقه آگلوتینه شدند و تنها در یک نمونه پیش‌تر اشاره‌شده، آگلوتیناسیون گلبول قرمز میمون رزوس طی 60 ثانیه و گلبول قرمز گربه طی 2 دقیقه رخ داد. در آزمون ممانعت از آگلوتیناسیون (SIT) نیز در هر 33 نمونه مورد‌بررسی، گلبول‌های قرمز به‌صورت هموژن و یکنواخت باقی ماندند و هیچ‌گونه آگلوتیناسیونی مشاهده نشد. تحلیل آماری نشان داد بین دماهای مختلف یا مدت‌زمان‌های آگلوتیناسیون، تفاوت معنی‌داری وجود ندارد (05/0<P).

کشت سلولی: کشت ویروس بر روی سلول‌های MDCK به‌عنوان روش استاندارد طلایی تشخیص انجام شد. از ۳۳ نمونه بررسی‌شده، ۱۳ نمونه آثار سایتوپاتیک نشان دادند. در این میان یک نمونه که نتیجه آزمون SAT آن منفی بود، اثرات سایتوپاتیک ایجاد کرد. همچنین یک نمونه که در آزمون SAT نتیجه مثبت داشت، در کشت ویروس هیچ‌گونه آثار سایتوپاتیکی نشان نداد.

بررسی مولکولی: در بررسی مولکولی با استفاده از PCR هیچ‌یک از نمونه‏های مورد‌آزمایش با پرایمر P_ab و P₂ هیچ‌گونه افزوده‏ای را نشان ندادند. 12 نمونه از ۳۳ نمونه و نمونه کنترل مثبت با واکسن Fortedog با پرایمر P_b افزوده‏هایی با سایز باند 427 جفت­باز تولید کردند (تصویر 3). تمام نمونه‌های مثبت در آزمون PCR، در آزمون SAT نیز موجب آگلوتینه شدن گلبول‌های قرمز شدند. تنها یک نمونه که در آزمون SAT نتیجه مثبت داشت، در PCR نیز مانند کشت سلولی نتیجه منفی ارائه کرد و هیچ باندی تولید نشد (تصویر 3. چاهک شماره 9). همچنین یک نمونه از 13 نمونه‌ مثبت در روش کشت سلولی، در روش مولکولی نتیجه منفی داشت. بدین ترتیب حساسیت و ویژگی آزمون PCR به‌ترتیب 92 و 100 درصد و ارزش‌های پیش‌گویی مثبت و منفی به‌ترتیب 100 درصد و 95 درصد برآورد شدند (جدول 2).

برآورد حساسیت و ویژگی SAT: با در نظر گرفتن روش کشت سلولی به‌عنوان روش استاندارد طلایی 36 درصد موارد مثبت کیت ایمونوکروماتوگرافی، مثبت حقیقی بودند. با‌توجه‌به این مهم، حساسیت و ارزش پیش‌گویی مثبت آزمون آگلوتیناسیون روی لام 92 درصد و ویژگی و ارزش پیش‌گویی منفی 95 درصد برآورد شدند (جدول 2). همچنین آزمون PCR که روش معمول مورد‌استفاده در تشخیص درمانگاهی است درجه همخوانی (ضریب توافق) بالایی با نتایج آزمون آگلوتیناسیون روی لام (936/0Kappa value=) داشت که بیانگر توافق عالی (Excellent agreement) بود و نشان داد با اطمینان خاطر در مواقع نیاز می‌توان این‌ دو روش را به‌جای یکدیگر به کار برد.

بحث

عفونت پاروویروسی سگ‌سانان به‌عنوان یک چالش جهانی شناخته می‌شود. این بیماری به‌‌شدت مسری و اغلب کشنده است و به‌دلیل شباهت علائم بالینی آن به سایر بیماری‌های گوارشی، تشخیص به‌موقع آن نقشی حیاتی در کنترل بیماری و نجات حیوان ایفا خواهد کرد (14، 15). در مطالعه حاضر، به توسعه و ارزیابی روش‌های سریع آگلوتیناسیون روی لام و ممانعت از آن، با استفاده از اریتروسیت گربه در تشخیص عفونت پاروویروسی سگ‌سانان، به‌عنوان روشی کارآمد و مقرون‌به‌صرفه پرداخته‌ شد (16).

روش‌های ایمونوکروماتوگرافی به‌صورت گسترده به‌عنوان ابزار تشخیصی اولیه عفونت‏های پاروویروسی سگ‌سانان استفاده می‏شوند (9، 17). یکی از در دسترس‌ترین انواع آن، کیت‌های ردیابی آنتی‌ژن پاروویروس در مدفوع می‌باشند که علاوه‌بر صرفه اقتصادی و ارائه سریع نتیجه، ویژگی بالایی دارند و به همین دلیل مورد توجه زیادی قرار گرفته­اند؛ اما با‌این‌حال فاقد حساسیت قابل‌قبول می‌باشند. از محدودیت‌های این کیت‌ها، کیفی بودن نتایج ارائه‌شده ‌است که گاهی متکی به استنباط فردی شخص انجام­دهنده نیز می‌باشد. علاوه‌بر‌آن طبق مطالعه Decaro و همکاران در سال 2009، این روش تنها قابلیت تشخیص نمونه‌هایی ‌را دارد که تیتر ویروسی آن‌ها بیش از 10⁵ در هر میلی‌گرم مدفوع باشد (18). این کیت‌ها با وجود هزینه نسبی پایین، در مواردی که تعداد نمونه‌های بسیار زیاد باشد، مانند محل پرورش و نگهداری سگ‌ها، هزینه بالایی را تحمیل می‌کنند.

کیت‌های الایزا برای تشخیص آنتی‌ژن و آنتی‌بادی پاروویروس سگ‌سانان به‌صورت گسترده تحت بررسی قرار گرفته‌اند. این کیت‌ها با وجود حساسیت و ویژگی تشخیصی بالا، محدودیت‌هایی برای استفاده در حجم بالا دارند. حتی کیت‌های الایزای سریع با دوره انکوباسیون کوتاه (5 تا 10 دقیقه) نیز به‌علت نیاز به مراحل شست‌وشوی متعدد و نیروی مجرب، هزینه‌بر و زمان‌بر می‌باشند.

آزمون PCR به‌عنوان یکى از حساس‌ترین روش‌ها برای شناسایى ویروس قلمداد شده است. این آزمون، به‌دلیل حساسیت و ویژگی بالا، به‌عنوان روش انتخابی برای تأیید پاروویروس سگ­سانان مطرح شده­ است. هر‌چند نیاز به وسایل و تجهیزات گران‌قیمت و پرسنل متخصص، استفاده روزمره از این روش را محدود به مراکز تحقیقاتى کرده است (19، 20).

کشت سلول از روش‌هاى دقیق براى تشخیص عفونت پاروویروس سگ‌ها محسوب مى‌شود و به‌عنوان تست استاندارد طلایى مورد استفاده قرار مى‌گیرد. روش کشت سلولى توانایى تشخیص کمترین مقادیر ویریون عفونى را نیز داراست. با‌این‌حال این روش نیازمند محیط‌هاى کشت اختصاصى و امکانات آزمایشگاهى خاص بوده و تنها توسط افراد مجرب انجام‌پذیر است. همچنین دوره انکوباسیون این روش ٥ تا 10 روز به طول مى‌انجامد و در استفاده بالینی کارآمد نیست.

آزمون‌های مبتنی بر آگلوتیناسیون برای تشخیص پاروویروس سگ‌سانان از سال 1978 مورد مطالعه قرار گرفته‌‌اند (11). هماگلوتینین نوعی پروتئین سطحی ‌است که در هر ویروس تمایل اتصال به گیرنده‏های سطحی اریتروسیت گونه‏های خاصی را دارد و سبب جمع‌شدگی گلبول‌های خونی آن می‌گردد (21). پاروویروس سگ‏سانان نیز توانایی اتصال به گیرنده‏های سطحی گلبول‏های قرمز خوک، میمون رزوس، گربه، سگ، موش صحرایی، گوسفند، همستر سوری، خرگوش و مرغ را دارد (22-26). دلیل این امر، احتمالاً وجود گیرنده‌های اختصاصی این ویروس بر سطح گلبول‌های قرمز گونه‌های مذکور و تمایل ذاتی ویروس برای اتصال و آگلوتینه کردن این سلول‌ها است. با عنایت به این ویژگی ذاتی پاروویروس سگ‌سانان، تست‌های مبتنی بر آگلوتیناسیون برای تشخیص پاروویروس سگ‌سانان مورد مطالعه قرار گرفته‌‌اند. ازجمله روش‌های مورد‌مطالعه، می‌توان به هماگلوتیناسیون و آگلوتیناسیون روی لام اشاره کرد. به‌منظور ساده‌سازی و افزایش سرعت، از ذرات لاتکس پوشیده‌شده با آنتی‌بادی‌های مونوکلونال نیز استفاده می‌شود (27). تمام این آزمون‌ها برای تشخیص آنتی‌ژن پاروویروس مفید ارزیابی شده‌اند، اما به‌صورت تجاری در دسترس نمی‎باشند یا قابلیت بازتولید برای تمام تحت تیپ‌ها را ندارند و تاکنون بیشتر به مصارف پژوهشی رسیده‌اند؛ بنابراین روش‌هایی نیاز است که بتوانند همه ژنوتیپ‌ها و انواع آنتی‌ژنی پاروویروس را به‌منظور استفاده‌های بالینی و میدانی، تشخیص دهند. عوامل متعددی می‌توانند حساسیت و ویژگی آزمون هماگلوتیناسیون و مهار هماگلوتیناسیون را تحت تأثیر قرار دهند؛ این عوامل شامل اسیدیته، دما، استفاده از گلبول‌های قرمز خون از گونه‌های مختلف جانوری، غلظت گلبول‌های قرمز و حضور آگلوتینین‌های غیر‌اختصاصی در سرم یا مهارکننده‌های هماگلوتیناسیون می‌باشند. علاوه‌بر‌این جهش‌های موجود در کپسید سویه‌های مختلف پاروویروس سگ می‌توانند فعالیت هماگلوتیناسیون را به شکل متغیری تحت تأثیر قرار دهند (22).

پاسخ‌دهی آزمون هماگلوتیناسیون (HA) به‌طور معمول 2 تا 4 ساعت زمان می‌برد. به همین منظور برای افزایش سرعت و سهولت در تشخیصی پاروویروس، آزمون هماگلوتیناسیون به روش سریع‌تر و ساده‌تری به نام آزمون آگلوتیناسیون روی لام (SAT) اصلاح شده است. این روش ضمن حفظ دقت و اعتبار، امکان دریافت سریع‌تر نتایج را فراهم می‌کنند (10).

یکی از مهم‌ترین ویژگی‌های آزمون آگلوتیناسیون روی لام، همانند تست هماگلوتیناسیون، توانایی ارائه نتایج کمّی با استفاده از آزمون‌های ممانعت از آگلوتیناسیون، در سنجش میزان آنتی‌بادی‌های ضد‌پاروویروس سگ‌سانان است. در دوره حساس 6 تا 8 هفتگی، زمانی که آنتی‌بادی‌های مادری به‌تدریج کاهش می‌یابند و توله‌سگ‌ها در برابر عفونت آسیب‌پذیر می‌شوند، این تست می‌تواند به‌طور مؤثری کاهش آنتی‌بادی‌ها را شناسایی کرده و زمان بهینه واکسیناسیون را تعیین کند. این ویژگی به‌خصوص در مراکز پرورش و نگهداری سگ‌ها که نیاز به پایش مداوم وضعیت ایمنی تعداد زیادی از توله‌سگ‌ها وجود دارد، بسیار کاربردی است و به اتخاذ تصمیمات دقیق‌تر در زمان‌بندی واکسیناسیون کمک می‌کند (10).

البته با‌توجه‌به اینکه روش آگلوتیناسیون روی لام، از آزمون هماگلوتیناسیون اقتباس شده است، استفاده از خون تازه خوک، به‌عنوان منبع اریتروسیت پیشنهاد شده است؛ با‌توجه‌به عدم‌ دسترسى به گلبول‌ قرمز خوک و به‌دلیل لزوم استفاده از اریتروسیت‌های تازه و عدم امکان منجمد و ذخیره‌سازی آن‌ها، در مطالعه حاضر براى نخستین بار از گلبول‌های قرمز گربه، که دسترسى به آن به‌مراتب راحت‌تر مى‌باشد، برای انجام آزمون آگلوتیناسیون روی لام در عفونت‌هاى پاروویروس سگ‌سانان استفاده شد. با‌توجه‌به نتایج مطالعه Senda و همکاران در سال 1986، خون رزوس توانایی آگلوتیناسیون مشابهی با خون خوک نشان می­دهد (23)؛ بدین منظور در مطالعه حاضر از خون رزوس، به‌عنوان اریتروسیت استاندارد، برای مقایسه با خون گربه استفاده شد. تمام موارد مثبت با خون رزوس در آزمون آگلوتیناسیون روی‌ لام، با خون گربه نیز نتایج مثبت داشتند. همچنین تمام نمونه‌های مثبت در مدت‌زمان کمتر از 1 دقیقه در هر 3 دمای مورد‌بررسی (4، 25 و 37 درجه سانتی‌گراد) آگلوتینه شدند و تفاوتى بین مدت‌زمان آگلوتیناسیون خون گربه و میمون رزوس وجود نداشت. این عدم تفاوت بیانگر قابلیت استناد به نتایج آزمون آگلوتیناسیون روی لام با استفاده از خون گربه در شرایط محیطی و امکانات مختلف است. با‌این‌حال در مطالعه Senda و همکاران در سال 1986 قدرت آگلوتیناسیون خون گربه یک‌چهارم خون رزوس اعلام شد که به‌علت کمی نبودن روش مورد‌استفاده در مطالعه حاضر، مقایسه امکان‌پذیر نبود (23).

در مطالعه Bayati و همکاران در سال 2010 و مطالعات مشابه، نشان داده ­شد گلبول‌های قرمز پرندگان به‌دلیل ساختار مناسب و حساسیت بالاتر، گزینه‌های بهتری برای تست هماگلوتیناسیون CPV می‌باشند. گلبول‌های قرمز سایر گونه‌های پستانداران، مانند خوک و میمون نیز عملکرد خوبی داشته‌اند، اما گلبول‌های قرمز اسب به‌دلیل رفتار متناقض، کاربرد محدودی در این آزمون دارند. این یافته‌ها اهمیت انتخاب مناسب گونه گلبول قرمز برای افزایش دقت و حساسیت آزمایش را نشان می‌دهد (11، 26). از منظر اعتبار روش‌های تشخیصی پاروویروس سگ‌سانان، طبق مطالعات Decaro و همکاران در سال 2009، کشت سلولی به‌عنوان استاندارد طلایی، بالاترین حساسیت و ویژگی را دارد. نتایج مطالعه حاضر حساسیت و ویژگی روش PCR را به‌ترتیب 92 و 100 درصد نشان داد. این در حالی است که مطالعات Mochizuki و همکاران در سال 1993 حساسیت و ویژگی این روش را در محدوده 98 تا 100 درصد گزارش کرده است. همچنین این روش را به‌عنوان یکی از دقیق‌ترین روش‌ها، در رتبه دوم پس از کشت سلولی معرفی کرده‌اند. مغایرت مشاهده‌شده بین نتایج قدرت تشخیصی PCR در مطالعه حاضر و مطالعات پیشین می‌تواند به عواملی همچون کیفیت نمونه‌ها، طراحی پرایمرها، شرایط انجام آزمایش یا تفاوت در جمعیت هدف مطالعه مرتبط باشد (28). همچنین در مطالعه Decaro و همکاران در سال 2009، در رتبه سوم روش الایزا با حساسیت 85 تا 95 درصد و ویژگی 90 تا 95 درصد در نظر گرفته­ شد. در‌نهایت روش ایمونوکروماتوگرافی با حساسیت پایین‌تر (60 تا 70 درصد) و ویژگی 90 تا 95 درصد کمتر به‌صورت گسترده استفاده می‌شود (18). مطالعه Saini و همکاران در سال 2024 نیز روش‌های ایمونوکروماتوگرافی (حساسیت 3/83 درصد و ویژگی 3/92 درصد) و تست پادتن درخشان (حساسیت 7/66 درصد و ویژگی 6/84 درصد) را با PCR مقایسه کردند (29). بر‌اساس مطالعه‌های صورت‌گرفته، آگلوتیناسیون روی لام نسبت به هماگلوتیناسیون ویژگی پایین‌تری دارد، اما از حساسیت یکسانی برخوردار است (10). در مطالعه حاضر، روش آگلوتیناسیون روی لام با حساسیت 92 درصد و ویژگی 95 درصد درجه، همخوانی بالایی با روش مولکولی ارائه داد و از کیت‌های تشخیص سریع ایمونوکروماتوگرافی نیز قابلیت اعتماد‌ بیشتری نشان داد (30، 31).

مطالعه حاضر علی‌رغم نتایج ارزشمند، دارای محدودیت‌هایی است که باید در تفسیر یافته‌ها مدنظر قرار گیرند. نخست آنکه حجم نمونه مورد‌استفاده نسبتاً محدود بود و تعمیم نتایج به جمعیت‌های وسیع‌تر نیازمند بررسی‌های آتی با تعداد بیشتری از نمونه‌ها است. دوم، تمام تحت‌تیپ‌های پاروویروس سگ‌سانان به‌طور کامل ارزیابی نشدند و کارایی آزمون در برابر سویه‌های متنوع ویروس نیازمند مطالعات تکمیلی است.

از نقاط ضعف در روش کار مطالعه حاضر این است که SAT و SIT به‌عنوان روش‌های قدیمی مبتنی بر آگلوتیناسیون، به‌طور بنیادین دارای محدودیت‌های ماهوی می‌باشند. این روش‌ها ازنظر حساسیت و دقت قابل‌مقایسه با PCR یا کشت سلولی نمی‎باشند، تکرارپذیری آن‌ها پایین است، به کیفیت نمونه و شرایط محیطی بسیار وابسته‌ می‌باشند و احتمال بروز خطا، به‌ویژه در موارد با بار ویروسی کم، قابل‌توجه است. همچنین آماده‌سازی اریتروسیت‌ها و انجام مراحل آزمون نیازمند دقت بالاست و در مقایسه با کیت‌های تجاری، ممکن است فرایندی وقت‌گیر و در برخی موارد خسته‌کننده تلقی شود. با‌توجه‌به اینکه تشخیص CPV در شرایط ایده‌آل با استفاده از روش‌های استاندارد دشوار نیست، اتکای صرف بر تکنیک‌های آگلوتیناسیونی نمی‌تواند نیاز تشخیصی کامل را برآورده کند. با‌این‌حال انگیزه اصلی استفاده از این روش‌ها در مطالعه حاضر، جایگزینی روش‌های مرجع نیست، بلکه ارزیابی ارزش عملی آن‌ها در محیط‌های کم‌امکانات است؛ شرایطی که در آن‌ها دسترسی به ‌PCR، کشت سلولی یا آزمایشگاه تخصصی ممکن نیست و ناچار باید از ابزارهای ساده‌تر استفاده شود؛ بنابراین ضعف‌های روش موجود بخشی از ماهیت کار است، اما همین ضعف‌ها ضرورت مطالعه حاضر را نیز توجیه می‌کند.

برای نخستین‌بار در ایران، مطالعه حاضر کارایی روش آگلوتیناسیون روی ‌لام را با بهره­گیری از اریتروسیت‌ گربه به‌طور جامع، به‌منظور تشخیص پاروویروس سگ‌سانان مورد ارزیابی قرار داد که پیشرفتی مهم در دامپزشکی محسوب می‌شود. از‌آنجایی‌که روش استاندارد انجام این آزمون با استفاده از خون خوک یا میمون، به‌­دلیل محدودیت‌های دسترسی و ملاحظات مذهبی، اجرای آن را در برخی کشورها با دشواری مواجه کرده است، نوآوری مهم مطالعه حاضر در به‌کارگیری اریتروسیت گربه بود که این مشکل را برطرف می­کند؛  یافته‌های مطالعه حاضر نشان داد اریتروسیت گربه می‌تواند جایگزینی مناسب با حساسیت و ویژگی مشابه با اریتروسیت­های مرجع باشد و این امر محدودیت‌های عملی روش‌های قبلی را مرتفع می‌کند. به­طور‌کلی مطالعه حاضر می‌تواند تحولی در روند تشخیصی بیماری‌های ویروسی ایجاد کند. به همین دلیل پیشنهاد می‌شود در مطالعه‌های آینده، امکان استفاده از این تکنیک بهینه‌سازی‌شده در سایر بیماری‌های ویروسی دامپزشکی نیز بررسی شود تا دامنه کاربرد آن گسترش یابد.

نتیجه­گیری نهایی: باتوجه‌به نتایج مطالعه حاضر، روش آگلوتیناسیون روی لام با بهره‌گیری از اریتروسیت گربه، تحولی کارآمد در تشخیص سریع و مقرون‌به‌صرفه عفونت پاروویروسی سگ‌سانان به شمار می‌آید. بدیهی است که روش‌های مورد‌استفاده در مطالعه حاضر مانند SAT و SIT در مقایسه با PCR و کشت سلولی از‌نظر حساسیت، دقت و قدرت تمایز محدودیت ساختاری دارند. این محدودیت‌ها به ‌معنای ضعف روش نیست، بلکه ماهیت ذاتی تکنیک‌های آگلوتیناسیونی است که اساساً برای تشخیص قطعی طراحی نشده‌اند. هدف از به‌کارگیری این روش‌ها در مطالعه حاضر، جایگزینی روش‌های استاندارد و مرجع نبود، بلکه ارزیابی توان آن‌ها به‌عنوان ابزارهای کمکی در شرایطی است که دسترسی به امکانات مولکولی یا کشت وجود ندارد. همچنین اصلی‌ترین نوآوری مطالعه حاضر معرفی اریتروسیت گربه به‌عنوان جایگزینی عملی برای اریتروسیت خوک یا میمون در روش آگلوتیناسیون روی لام است. این دستاورد ضمن رفع محدودیت‌های اجرایی در کشورهای اسلامی، امکانی فراهم می‌‌کند تا این آزمون به‌عنوان روشی سریع و مقرون‌به‌صرفه در تشخیص عفونت پاروویروس سگ‌سانان، در مراکز با امکانات محدود، مورد استفاده قرار گیرد. این دستاورد نه­تنها گامی مؤثر در مسیر کنترل شیوع این بیماری و بهبود مدیریت سلامت سگ‌سانان محسوب می­شود، بلکه زمینه‌ساز پیشرفت روش­های تشخیصی بیماری‌های ویروسی و مطالعات آتی است.

سپاسگزاری

از تمام همکاران ارجمند دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران و اساتید محترمی که با ارائه نقطه‌نظرات ارزشمند خود در پیشبرد این مطالعه یاری رسانیدند، صمیمانه قدردانی می­شود.

تعارض منافع

هیچ گونه تعارض منافعی در ارتباط با این مطالعه وجود ندارد.