تغییرات بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی و بیان برخی از ژن‌های تحمل به خشکی در عدس (Lens culinaris)

. مقدمه

عدس (Lens culinaris)، یکی از حبوبات دیپلوئیدی و به عنوان یکی از قدیمی‌ترین محصولات اهلی­شده بشر است
(Montejano-Ramírez & Valencia-Cantero, 2024). از نظر کشاورزی، این گیاه از اهمیت قابل­توجهی برخوردار است و بر اساس حجم تولید، ششمین محصول عمده حبوبات در سراسر جهان محسوب می‌شود (Erskine, 2009).

تنش خشکی یکی از فراگیرترین تنش‌های غیرزیستی است که بهره‌وری کشاورزی را در سراسر جهان محدود می‌کند
(Feng et al., 2021). پیش‌بینی می‌شود که فراوانی، شدت و مدت آن در بسیاری از مناطق به دلیل تغییرات اقلیمی افزایش یابد
(Ye et al., 2018). برای کشت عدس، به­ویژه در محیط‌های نیمه‌خشک و دیم که اغلب در آنها کشت می‌شود، خشکی یک محدودیت اصلی تولید است. در ایران، جایی­که کشاورزی با چالش‌های قابل­توجهی از کمبود آب و افزایش خشکی مواجه است، درک و کاهش اثرات خشکسالی یک اولویت ملی است (Ghochanian Haghverdi et al., 2025).

برای توسعه گونه‌های عدس که برای محیط‌های کم‌آب مناسب‌تر باشند، درک کامل سازوکارهای پاسخ گیاه ضروری است. تنوع ژنتیکی قابل­توجهی در ویژگی‌های سیستم ریشه، از جمله طول ریشه، مساحت سطح، حجم و قطر مشاهده شده است، و صفاتی که جذب آب را از عمق بیشتر موجب می‌شوند با عملکرد بهتر در شرایط تنش خشکی مرتبط هستند (Noor et al., 2024). تنش خشکی به طور مداوم منجر به کاهش هدایت روزنه‌ای، میزان تعرق و جذب کربن فتوسنتزی می‌شود (Zeroual et al., 2022). مطالعات مقایسه‌ای اغلب نشان می‌دهند که ژنوتیپ‌های مقاوم به تنش خشکی دارای ظرفیت آنتی‌اکسیدانی قوی‌تر و سطوح پایین‌تری از نشانگرهای آسیب اکسیداتیو نسبت به ژنوتیپ‌های حساس هستند (Öktem et al., 2008). خشکی آبشارهای سیگنالینگ پیچیده‌ای را ایجاد می‌کند که منجر به تغییر در بیان ژن می‌شود. تجزیه و تحلیل‌های رونویسی، ژن‌های متعدد پاسخ‌دهنده به خشکسالی را شناسایی کرده‌اند که فاکتورهای رونویسی (مانند bZIP)، آنزیم‌های دخیل در سنتز اسمولیت و دفاع آنتی‌اکسیدانی، پروتئین‌های کانال (آکواپورین‌ها) و پروتئین‌های محافظ (مانند دهیدرین‌ها، پروتئین‌های شوک حرارتی) را رمزگذاری می‌کنند (Noor et al., 2024). مطالعات مقایسه‌ای توالی‌یابی RNA بین ژنوتیپ‌های عدس مقاوم و حساس در شرایط خشکی، الگوهای بیان ژن متفاوت مربوط به فتوسنتز، محافظت اسمزی، سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی، مسیرهای انتقال سیگنال و متابولیسم ثانویه را برجسته کرده‌اند (Biju et al., 2023). برای درک چگونگی ترکیب مؤثر مکانیسم‌های مختلف توسط ژنوتیپ‌های متحمل، به­ویژه پیوند تاب‌آوری فیزیولوژیکی با مسیرهای بیوشیمیایی خاص و الگوهای بیان ژن‌های مربوطه، بررسی عمیق‌تری مورد نیاز است. در ایران به دلیل تنش خشکی انتهای فصل رشد که بر کشت عدس به­صورت دیم تاثیر دارد، مطالعه تغییرات صفات بیوشیمیایی و بیان ژن‌های شناسایی­شده موثر در تحمل به تنش خشکی در این گیاه دارای اهمیت بوده که سرانجام می­تواند به منظور غربالگری، اصلاح و انتخاب ژنوتیپ‌های متحمل به خشکی در عدس مورد استفاده قرار گیرد. هدف این تحقیق، بررسی تغییرات بیوشیمیایی بیان و نیز نقش برخی ژن‌های شناسایی­شده موثر در تحمل به تنش خشکی در دو ژنوتیپ‌ حساس و متحمل عدس، می‌باشد.

2. روش‌شناسی پژوهش

2-1. مواد گیاهی و صفات ریخت‌شناسی

در این مطالعه دو لاین FLIP2002-57L (متحمل به خشکی) و FLIP2002-55L (حساس به خشکی)، با توجه به مطالعات گذشته و عملکرد آن­ها در شرایط مزرعه­ای برای کشت در گلخانه انتخاب شدند (مکاتبه شخصی با دکتر چگینی، مرکز تحقیقاتی کوهین دانشگاه تهران). این دو لاین در حال خالص­سازی و انجام تحقیقات تکمیلی بوده و از جمله لاین­های امیدبخش عدس می­باشند. لاین‌هایی که مقاومت آنها به سرما به­خوبی شناسایی شده بود و جهت بررسی‌های بیشتر جهت آماده‌سازی آن‌ها به عنوان رقم در مرکز تحقیقاتی کوهین دانشگاه تهران مورد بررسی بودند؛ به همین جهت در این بررسی از این دو ژنوتیپ استفاده شد. بذر آن­ها از بانک ژن دانشکدگان کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران تهیه شد. در هر گلدان پلاستیکی به ارتفاع 10 و قطر 12 سانتی‌متر، تعداد شش عدد بذر کشت شد. خاک مورد استفاده در هر گلدان دارای ترکیب 2:1:1 خاک مزرعه، ماسه و خاک برگ بود. آزمایش در قالب فاکتوریل بر پایه طرح بلوک‌های کامل تصادفی در سه تکرار بود که در گلخانه دانشکدگان کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، اجرا شد. 12 گلدان برای هر واحد آزمایشی تعیین شد. در دوره رشد رویشی گیاهان، محلول‌ ریزمغذی (کود ریزمغذی میکروموند) (دو گرم در لیتر آب) در دو نوبت به­صورت محلول­پاشی و همچنین کود NPK (کود 20-20-20 هاروانا) (در سه گرم در لیتر آب همراه با آبیاری) در دو نوبت به گلدان‌ها داده ‌شد. با رشد گیاهان به مرحله 40 برگچه‌ای تنش خشکی آغاز شده و به­صورت آبیاری براساس 90، 60 و 30 درصد ظرفیت زراعی خاک گلدان، اعمال شد. ظرفیت زراعی خاک براساس روش وزنی تعیین شد. پس از اعمال تنش با مشاهده تشدید علائم تنش از جمله پیچیدگی، زرد شدن، خشکیدگی و ریزش برگچه‌ها، اعمال تنش خشکی پس از دو هفته پایان یافته و بعد از آن نمونه­‌برداری از بافت هوایی و ریشه گیاهان انجام شد. ارتفاع بوته، وجود یا فقدان کرک، شدت سبزینگی بوته قبل از نمونه‌برداری و در طول اعمال تنش، اندازه‌گیری شد (Lentil discriptors, IBPGR, 1985). همچنین وزن تر و خشک اندام هوایی، وزن تر و خشک ریشه (با ترازوی با دقت 001/0 گرم، 48 ساعت در دمای 70 درجه سانتی‌گراد) اندازه­گیری شد.

2-2. محتوای نسبی آب برگ [1]

وزن تر آخرین برگ‌های توسعه‌یافته بلافاصله پس از نمونه‌گیری، توسط ترازوی (001/0 گرم) اندازه‌گیری شد. سپس نمونه‌ها در داخل لوله‌های فالکون‌ 15 میلی‌لیتری قرار گرفته و به همه آنها میزان یکسانی آب مقطر اضافه شد تا برگ‌ها در آب شناور شوند. نمونه‌ها به مدت 24 ساعت در یخچال 4 درجه سانتی‌گراد قرار گرفته، سپس وزن اشباع آن‌‌ها اندازه‌گیری شد. بعد از آن نمونه­ها 24 ساعت در آون با دمای 70 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد؛ سپس وزن خشک آن­ها اندازه‌گیری شد. در نهایت، محتوی نسبی آب برگ محاسبه شد .(Kumar & Elston, 1992)

2-3. میزان نشت الکترولیتی [2]

آخرین برگ توسعه­یافته از بوته­ها جدا و در یک لوله فالکون قرار گرفته، سپس به آن آب مقطر اضافه و به مدت 24 ساعت در شیکر انکوباتور قرار داده شدند. بعد از آن با EC متر (ساخت WTW آلمان)، EC نمونه‌ها اندازه‌گیری شد (EC1). سپس نمونه‌ها در بن‌ماری با دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت یک ساعت قرار داده شده و به حمام آب یخ منتقل شدند و دوباره EC آن‌ها اندازه‌گیری شد (EC2). در نهایت میزان نشت الکترولیتی برای هر نمونه محاسبه شد (Valentovic et al., 2006).

2-4. شاخص سطح برگ [3]

برگ‌های سبز گیاه جدا و مساحت سطح آن‌ها با Leaf Area Meter (ساخت CID آلمان) اندازه‌گیری شد. سپس در آون با دمای 75 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت قرار گرفته و وزن خشک نمونه­ها اندازه‌گیری شد. در نهایت شاخص سطح برگ، برحسب سانتی‌متر مربع بر گرم (cm² g^-1) محاسبه ‌شد (Feng et al., 2013).

2-5. سنجش محتوای پرولین

نیم گرم (5/0 گرم) بافت اندام هوایی با استفاده از ازت مایع پودر شده، و به آن ۱۰ میلی‌لیتر اسیدسولفوسالیسیلیک سه درصد اضافه و در حمام یخ قرار داده شد. نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه و با سرعت 15000 دور سانتریفیوژ (Hettich آلمان) شد. دو میلی‌لیتر از عصاره حاصل برداشته و به لوله فالکون جدید منتقل شد. دو میلی‌لیتر نین‌هیدرین [4] و دو میلی‌لیتر اسیداستیک گلاسیال به عصاره نمونه­ها اضافه شد. نمونه‌ها به مدت یک ساعت در حمام آب گرم قرار گرفته و سپس در حمام یخ سرد شدند. پس از افزودن چهار میلی‌لیتر تولوئن و انجام ورتکس، جذب‌ آن در طول موج ۵۲۰ نانومتر خوانده شد. غلظت پرولین بر حسب میکروگرم بر میلی‌لیتر از روی منحنی استاندارد محاسبه و سپس به میکروگرم بر گرم وزن خشک بافت تبدیل شد (Bates et al., 1973).

2-6. مالون‌دی‌آلدهید [5]

مقداری برگ پودر شده با پنج میلی‌لیتر بافر فسفات­پتاسیم 1/0 مولار مخلوط و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای چهار درجه سانتی‌گراد و سرعت ۱۴۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. به یک میلی‌لیتر از عصاره رویی، یک میلی‌لیتر محلول تیوباربیتوریک­اسید حاوی تری‌کلرواستیک­اسید اضافه شد. مخلوط به مدت ۳۰ دقیقه در بن‌ماری ۹۵ درجه سانتی‌گراد قرار گرفته و سپس در حمام آب یخ، سرد شد. نمونه مجدداً به مدت ۱۰ دقیقه در سرعت ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. میزان جذب مایع رویی در طول موج‌های ۵۳۲ و ۶۰۰ نانومتر خوانده شد. در نهایت، مقدار MDA بر اساس نانومول بر گرم وزن تر با استفاده از رابطه مربوطه محاسبه شد
(Hodges et al., 1999).

2-7. پراکسید هیدروژن [6]

نیم گرم (5/0 گرم) نمونه برگ پودر شده با 5/2 میلی‌لیتر محلول TCA یک درصد مخلوط و به مدت ۱۵ دقیقه با سرعت ۱۲۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. ۲۵۰ میکرولیتر از عصاره رویی با ۲۵۰ میکرولیتر بافر فسفات­پتاسیم ۱۰ میلی‌مولار (pH=7) و ۵۰۰ میکرولیتر محلول پتاسیم­یدید یک مولار ترکیب شد. پس از انجام واکنش، میزان جذب در طول موج ۳۹۰ نانومتر خوانده شد. غلظت H₂O₂ در نمونه با استفاده از منحنی استاندارد تهیه­شده از محلول‌های پراکسیدهیدروژن با غلظت دو تا ۱۰ میلی‌مولار محاسبه شد
(Velikova et al., 2000).

2-8. کربوهیدرات

برای اندازه‌گیری کربوهیدرات، ابتدا نیم گرم (5/0 گرم) بافت خشک­شده کوبیده شده با ۷/۵ میلی‌لیتر اتانول ۸۰ درصد داغ مخلوط و به مدت ۲۴ ساعت در ۷۰ درجه سانتی‌گراد برای عصاره‌گیری قندهای محلول نگهداری شد؛ سپس مخلوط ورتکس و به مدت ۱۰ دقیقه در سرعت ۳۰۰۰ دور سانتریفیوژ شد. عصاره رویی حاوی قندهای محلول جدا شد، درحالی­که بافت باقی‌مانده پس از خشک­شدن، با افزودن مقدار مشخصی آب مقطر و جوشاندن در بن‌ماری، جهت استخراج نشاسته آماده شد. سپس، حجمی مشخص از عصاره برای واکنش رنگی استفاده شد؛ به این صورت که به یک میلی‌لیتر از نمونه آماده­شده، 5/0 میلی‌لیتر محلول فنل پنج درصد و ۲/۵ میلی‌لیتر اسیدسولفوریک ۹۸ درصد اضافه شد و پس از ۴۵ دقیقه برای تثبیت رنگ، میزان جذب در طول­موج ۴۸۵ نانومتر قرائت شد. در نهایت، غلظت کربوهیدرات بر حسب میکروگرم بر میلی‌لیتر با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه و به میکروگرم بر گرم وزن خشک نمونه تبدیل شد (Sturgeon, 1990).

2-9. کلروفیل a، b و کاروتنوئید

نیم گرم بافت پودر و سپس 10 میلی‌لیتر استون 70 درصد به آن اضافه شد. سپس نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه و با سرعت 6000 دور سانتریفیوژ (Hettich آلمان) شد. عصاره بخش بالایی جدا و به پلیت منتقل و جذب نمونه‌ در طول موج 663 نانومتر برای کلروفیل a، 645 نانومتر برای کلروفیل b و نیز 470 نانومتر برای کاروتنوئید خوانده شد. میزان کلروفیل a، b و کاروتنوئید محاسبه شد (Lichtenthaler & Wellburn, 1983).

2-10. پروتئین کل

برای سنجش پروتئین کل، 10 میکرولیتر از عصاره نمونه‌ها به 200 میکرولیتر بافر بردفورد آماده­شده (Bradford, 1976) در هر خانه پلیت اضافه شد. پس از 20 دقیقه انکوباسیون، جذب نوری در طول موج 595 نانومتر توسط دستگاه پلیت‌ریدر قرائت شد.

2-11. آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان

به 2/0 گرم بافت برگ، یک میلی‌لیتر از بافر استخراج Tris-Hcl یک مولار حاوی پلی‌وینیل‌پیرولیدون دو درصد اضافه و سپس هموژنیزه شد، نمونه‌ها سانتریفیوژ (در چهار درجه سانتی‌گراد، به‌مدت 30 دقیقه با دور 15000) شد. پس از سانتریفیوژ، عصاره بالایی برداشته و به تیوب جدید ریخته شد که به منظور سنجش فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، آسکوربات­پراکسیداز و پراکسیداز و همچنین غلظت پروتئین مورد استفاده قرار گرفت. جهت سنجش فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، آسکوربات­پراکسیداز و گایاکول­پراکسیداز به­ترتیب از روش‌های
Aebi  (1974)،Nakano & Asada  (1987) و Chance Maehly (1995) استفاده شد.

2-12. بیان برخی ژن‌های دخیل در تحمل به تنش خشکی

با بررسی منابع علمی، تعدادی ژن دخیل در تحمل به خشکی در برخی گیاهان خانواده بقولات، انتخاب و با مراجعه به پایگاه داده NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov))، شماره دسترسی [7] آن‌ها مشخص شد. سپس تعدادی از این ژن‌ها با کمک هم‌ردیفی [8] در گیاه عدس مشخص شدند. برای شناسایی توالی توافقی [9] ناحیه رمزکننده [10] ژن‌های انتخابی عدس، در آغاز توالی­های قطعات بیانی [11] و
خوانش [12] ژن‌های انتخابی )حاصل از پروژه‌های توالی‌یابی RNA عدس در پایگاه NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) با کمک توالی‌های ارتولوگ مشابه در سایر گیاهان با کمک BLAST Offline (v.2.7.0) شناسایی و مجموع این قطعات، با استفاده از نرم‌افزار Codon Code aligner (Ver. 5.0.1) با یکدیگر سرهم شد. در ادامه چارچوب قرائت ژن­های مذکور با بررسی توالی حاصل در ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) شناسایی و به‌منظور تأیید این چارچوب و ORF موردنظر آن­ها، از نرم‌افزار BLASTp استفاده شد. بیان ژن‌ها در تنش خشکی در دو ژنوتیپ متحمل و حساس در سطوح شاهد و تنش شدید، با استفاده از تکنیک qRT-PCR مورد بررسی قرار گرفت. به منظور طراحی آغازگر‌های مناسب برای تکثیر ژن‌های مورد نظر از نرم‌افزارهایOligo7  و PerlPrimer استفاده شد. بعد از آن آغازگرها از نظر تشکیل Self-dimer (بیش از 6- kcal mol^-1)، Hetero primer (بیش از 6-
kcal mol^-1) و Hairpin (بیش از 6- kcal mol^-1)، دمای ذوب و درصد GC، در نرم‌افزار آنلاین OligoAnalyzer3.1 مورد بررسی قرار گرفتند. جدول 1 آغازگرهای طراحی­شده را نشان می‌دهد. بعد از این کارایی آغازگرهای مختص هر ژن با آزمایش qRT-PCR چند نمونه بررسی شد و دمای مناسب برای اتصال هر جفت آغازگر بررسی شد.

2-13. استخراج RNA، سنتز cDNA و واکنش Real Time

RNA نمونه­ها به وسیله کیت شرکت دنازیست استخراج شد. با استفاده از نانودراپ (ساخت Thermo scientific آمریکا) و الکتروفورز (آگارز یک درصد) بررسی کمی و کیفی RNA استخراج­شده انجام شد. بعد از آن به وسیله کیت شرکت پارس‌توس، تیمار DNase اعمال و سنتز cDNA انجام شد. با استفاده از نانودراپ و الکتروفورز (دناژن ایران) (آگارز دو درصد) بررسی کمیت cDNA سنتز شده انجام و همچنین برای کنترل داخلی از آغازگر ژن 18srRNA استفاده شد. واکنش‌های ریل­تایم (ساخت Qiagene آلمان) در 40 چرخه (20 ثانیه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد، 20 ثانیه در دمای اتصال آغازگر و 20 ثانیه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد) انجام شد. در نهایت به منظور محاسبه میزان بیان هر ژن در نمونه‌های تحت تنش نسبت به نمونه‌های شاهد، از رابطه Livak استفاده شد
(Livak & Schmittgen, 2001). تجزیه و تحلیل داده‌های حاصل با نرم‌افزارهای SPSS 26 و SAS 9.4 انجام شد. از نرم­افزار 2013 Excel به منظور رسم نمودارهای مقایسه میانگین دانکن استفاده‌ شد. از آزمون Kolmogorov-Smirnov در Minitab17 استفاده شد تا اطمینان حاصل شود که خطای داده‌ها توزیع نرمال دارند.

جدول 1. اسامی و توالی آغازگرهای طراحی­شده.

Table 1. Names and sequences of designed primers.

3. یافته‌های پژوهش و بحث

نتایج نشان داد که تنش خشکی بر صفات مختلفی مانند ارتفاع گیاه، طول ریشه، وزن تر ریشه، نشت یونی، شاخص سطح برگ، محتوای کلروفیل، محتوای قندهای محلول موثر بوده است (جدول 2). فعالیت آنزیم‌های آسکوربات­پراکسیداز و گایاکول­پراکسیداز و نیز بیان ژن‌های HCF136، BA، DREB1، MIMP و ABA/WDS در ژنوتیپ‌های مختلف به تنش خشکی پاسخ داده‌اند.

3-1. ارتفاع بوته و تعداد برگ و برگچه

براساس نتایج تجزیه واریانس، اثر متقابل ژنوتیپ در تنش برای صفت ارتفاع بوته در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار شده است (جدول 2). همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، ارتفاع بوته در هر دو ژنوتیپ تحت تأثیر تنش خشکی کاهش یافته است؛ در ژنوتیپ متحمل از 27/31 سانتی‌متر به 79/21 سانتی‌متر و در ژنوتیپ حساس از 52/32 سانتی‌متر به 23/19 سانتی‌متر. با این حال، میزان این کاهش در ژنوتیپ حساس به­طور قابل­توجهی شدیدتر از ژنوتیپ متحمل بود. این مهار رشد، یک پاسخ تطبیقی اولیه به کمبود آب است که مستقیماً از کاهش فشار تورژسانس سلولی ناشی می‌شود (Zeroual et al., 2022). کاهش تورژسانس، فرآیندهای کلیدی تقسیم و طویل­شدن سلولی را متوقف می‌سازد (Noor et al., 2024). توانایی ژنوتیپ متحمل در حفظ ارتفاع نسبتاً بالاتر، نشان‌دهنده موفقیت آن در مکانیسم‌های حمایتی زیربنایی، به­ویژه تنظیم اسمزی کارآمد برای حفظ تورژسانس لازم برای رشد حداقلی است، در حالی که کاهش ارتفاع در ژنوتیپ حساس، نشان‌دهنده شکست در این سیستم‌ها است.

اثر متقابل ژنوتیپ در تنش برای صفات تعداد برگ و تعداد برگچه معنی‌دار نبود. با این حال، اثرات اصلی تنش (در سطح احتمال یک درصد) و ژنوتیپ (در سطح احتمال پنج درصد) برای هر دو صفت معنی‌دار بودند (جدول 2). داده‌ها (شکل 2) نشان می‌دهند که هر دو ژنوتیپ با افزایش شدت تنش، کاهش مشابهی را در تعداد برگ و برگچه تجربه کرده‌اند. تعداد برگ و برگچه در ژنوتیپ متحمل به­ترتیب از 14 و 112 به 12 و 97 و در ژنوتیپ حساس از 14 و 109 به 11 و 74 کاهش یافت. کاهش تعداد برگ و در نتیجه کاهش سطح کلی برگ یک استراتژی اجتناب از خشکی به منظور کاهش سطح کلی تعرق گیاه و حفظ آب محسوب می‌شود
(Khatun et al., 2021). این یک موازنه فیزیولوژیک است، به­عبارتی گیاه آب را حفظ می‌کند اما پتانسیل فتوسنتزی خود را قربانی می‌سازد (Feng et al., 2022).

3-2. تراکم کرک

اثر متقابل ژنوتیپ در تنش برای صفت تراکم کرک با سطح احتمال یک درصد معنی‌دار شد (جدول 2). تحت تنش خشکی، تراکم کرک در ژنوتیپ متحمل به­طور معنی‌داری افزایش یافت؛ در حالی که در ژنوتیپ حساس کاهش یافت (شکل 3). این یافته نشان‌دهنده یک استراتژی سازگاری کاملاً متفاوت است. افزایش تراکم کرک یک مکانیسم سازگاری فیزیکی شناخته‌شده برای بقا در محیط‌های خشک است (Shahzad et al., 2021). کرک‌ها با افزایش بازتابش پرتوهای خورشیدی و ضخیم‌تر کردن لایه مرزی هیدرودینامیکی در سطح برگ به حفظ آب سلول‌ها کمک می‌کنند (Chen et al., 2022). فعال‌سازی این دفاع فیزیکی در ژنوتیپ متحمل نشان‌دهنده یک پاسخ تطبیقی فعال است. در مقابل، کاهش کرک در ژنوتیپ حساس می‌تواند نشان‌دهنده ناتوانی در اجرای این پاسخ رشدی و آغاز فرآیندهای پیری و تخریب ساختاری در پاسخ به تنش شدید باشد (Abdel-Ghany et al., 2020).

3-3. وزن تر و خشک اندام هوایی و ریشه

تنش خشکی منجر به کاهش در وزن تر و خشک اندام هوایی و ریشه شد. اثر متقابل ژنوتیپ در تنش برای وزن تر ریشه (در سطح احتمال یک درصد) و وزن خشک اندام هوایی (در سطح احتمال یک درصد) معنی‌دار بود (شکل 4–الف و ب) اما اثر متقابل ژنوتیپ در تنش برای وزن خشک ریشه و وزن تر اندام هوایی معنی‌دار نشده است (جدول 2). از طرفی اثر اصلی تنش در صفت وزن خشک ریشه (شکل 4-ج) و اثر اصلی تنش و ژنوتیپ در صفت وزن تر اندام هوایی در سطح احتمال یک درصد معنی­دار شد (شکل 4–د و ز). وزن تر و خشک اندام هوایی در ژنوتیپ متحمل به­ترتیب از 47/11 و 6/2 گرم به 62/6 و 02/2 گرم کاهش یافت. در ژنوتیپ حساس نیز وزن تر و خشک ساقه به­ترتیب از 8/10 و 43/2 گرم به 06/6 و 72/1 گرم کاهش یافت. وزن تر و خشک ریشه نیز در شرایط شاهد در ژنوتیپ محتمل 41/2 و 6/0 گرم و در ژنوتیپ حساس 38/2 و 57/0 گرم اندازه‌گیری شد. وزن تر و خشک ریشه در ژنوتیپ متحمل تحت تنش شدید به 86/1 و 41/0 گرم کاهش یافت. در ژنوتیپ حساس نیز تحت تنش شدید 39/1 و 4/0 گرم اندازه‌گیری شد. کاهش زیست­توده پاسخ مورد انتظار به تنش خشکی به دلیل کاهش ظرفیت فتوسنتزی (ناشی از بسته­شدن روزنه‌ها و کاهش LAI) است (Nadeem et al., 2019). ژنوتیپ متحمل به دلیل حفظ بهتر کلروفیل و LAI، توانسته است نرخ فتوسنتز بالاتری را حفظ کرده و زیست­توده بیشتری را تثبیت کند. این یافته نشان می‌دهد که هر دو ژنوتیپ به­طور مشابهی تخصیص بیوماس به ریشه یا از­دست­دادن بیوماس ریشه را تجربه کرده‌اند و بر خلاف تصور رایج، ژنوتیپ متحمل لزوماً ریشه‌های بیشتری نساخته است (Ye Heng et al., 2018).

3-4. شدت سبزینگی و محتوای کلروفیل کل

در هر دو صفت شدت سبزینگی، محتوای کلروفیل کل و اثر متقابل ژنوتیپ در تنش در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار شد (جدول 2). همانطور که در شکل‌های 5–الف و ب مشاهده می‌شود، هر دو شاخص در شرایط تنش کاهش یافتند (محتوای کلروفیل در ژنوتیپ متحمل از 7/11 به 8/7 میکرومول بر گرم و در ژنوتیپ حساس از 4/11 به 34/9 مول برگ گرم). اگرچه هر دو ژنوتیپ کاهش کلروفیل را تجربه کردند، اما ژنوتیپ متحمل دچار کاهش بسیار شدیدتر و قابل توجه‌تری در محتوای کلروفیل نسبت به ژنوتیپ حساس، به­ویژه در تنش شدید شد (شکل 5-ب). این پدیده نشان می‌دهد که کاهش کلروفیل در ژنوتیپ متحمل، نه یک آسیب، بلکه یک استراتژی سازگاری فعال برای محافظت نوری است (Kalefetoǧlu Macar & Ekmekçi, 2008). در شرایط خشکی شدید، بسته­شدن روزنه‌ها منجر به کاهش شدید CO₂ در دسترس برای فتوسنتز می‌شود. اگر دستگاه فتوسنتزی با همان ظرفیت به جذب انرژی نوری ادامه دهد، این انرژی اضافی منجر به تولید عظیم گونه‌های فعال اکسیژن و آسیب اکسیداتیو شدید می‌شود (Qiao et al., 2024). بنابراین، ژنوتیپ متحمل با درک این خطر، به طور فعال دستگاه برداشت نور خود را تخریب می‌کند تا از جذب انرژی اضافی جلوگیری کرده و از آسیب نوری ممانعت به عمل آورد (Kalefetoǧlu Macar & Ekmekçi, 2008). در مقابل، ژنوتیپ حساس که فاقد این مکانیسم تنظیمی است، کلروفیل خود را حفظ می‌کند و به جذب نوری که قابل استفاده نیست ادامه می‌دهد و در نتیجه دچار تنش اکسیداتیو شدید و آسیب غشایی می‌شود.

3-5. شاخص سطح برگ

3-5. شاخص سطح برگ

در شاخص سطح برگ اثر متقابل ژنوتیپ در تنش در سطح احتمال پنج درصد معنی‌دار شد (جدول 2). شاخص سطح برگ در هر دو ژنوتیپ کاهش یافت، اما این کاهش در ژنوتیپ متحمل بسیار شدیدتر بود (شکل 6). این شاخص در ژنوتیپ متحمل از 24/154 به 57/138 سانتی‌متر مربع بر گرم کاهش یافت. در ژنوتیپ حساس نیز از 2/222 به 33/168 سانتی‌متر مربع بر گرم کاهش یافت.

این یافته که هم­راستا با نتایج محتوای کلروفیل است، نشان‌دهنده یک استراتژی دفاعی فعال در ژنوتیپ متحمل است. LAI ظرفیت کلی کانوپی برای جذب نور و تعرق را تعیین می‌کند (Khan et al., 2025). ژنوتیپ متحمل به­طور فعال سطح برگ خود را کاهش می‌دهد تا سطح تعرق را پایین آورده (Khatun et al., 2021) و مهم‌تر از آن، از جذب بیش از حد انرژی نوری جلوگیری کند. این یک مکانیسم محافظت نوری حیاتی است که از تولید ROS در زمانی که فتوسنتز به دلیل بسته­بودن روزنه‌ها محدود شده، ممانعت می‌کند (Qiao et al., 2024). در مقابل، ژنوتیپ حساس در اجرای این کاهش فعال شکست خورده و سطح برگ بیشتری را حفظ می‌کند که منجر به جذب انرژی اضافی، تنش اکسیداتیو شدید و در نهایت آسیب فتوسنتزی می‌شود.

3-6. نشت یونی

اثر متقابل ژنوتیپ در تنش در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار شد (جدول 2). نشت یونی در هر دو ژنوتیپ افزایش یافت، اما این افزایش در ژنوتیپ حساس به مراتب بیشتر بود (شکل 7)؛ به­طوری­که در ژنوتیپ متحمل از 71/49 درصد در نمونه‌های شاهد به 13/53 درصد در نمونه‌های تحت تنش شدید افزایش یافت. در ژنوتیپ حساس نیز از 48/55 درصد در شرایط بدون تنش به 16/75 درصد در تنش شدید افزایش یافت. نشت الکترولیتی به عنوان شاخص استاندارد برای سنجش یکپارچگی و پایداری غشای سلولی استفاده می‌شود (Ifeduba et al., 2024). تنش خشکی منجر به تولید گونه‌های فعال اکسیژن می‌شود که باعث پراکسیداسیون لیپیدهای غشا می­شود (El Haddad et al., 2023). این آسیب ساختاری، نفوذپذیری غشا را به­طور غیرقابل کنترل افزایش داده و باعث می‌شود یون‌ها از سیتوپلاسم به بیرون نشت کنند (Sehgal et al., 2017). اثر متقابل ژنوتیپ در تنش معنی‌دار در اینجا نشان می‌دهد که ژنوتیپ حساس آسیب غشایی بسیار شدیدتر و گسترده‌تری را متحمل می‌شود.

3-7. محتوای نسبی آب برگ

برای صفت محتوای نسبی آب برگ، اثر متقابل ژنوتیپ در تنش معنی‌دار نبود، اما اثرات اصلی تنش و ژنوتیپ در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار بودند. محتوای نسبی آب برگ به­ترتیب در ژنوتیپ متحمل و حساس از 65 و 33/63 درصد به 78/57 و 23/48 درصد کاهش یافت. محتوای نسبی آب یک شاخص کلیدی برای ارزیابی وضعیت آبی گیاه و توانایی آن در حفظ تورژسانس بافت است (Noor et al., 2024). همانطور که در شکل 8 مشاهده می‌شود RWC در هر دو ژنوتیپ تحت تنش کاهش یافت (اثر اصلی تنش)، اما ژنوتیپ متحمل به­طور مداوم و در تمام سطوح (شاهد، متوسط و شدید) RWC بالاتری را نسبت به ژنوتیپ حساس حفظ کرد (اثر اصلی ژنوتیپ).

3-8. محتوای کاروتنوئید

اثر متقابل ژنوتیپ در تنش در محتوای کلروفیل معنی‌دار نبود، اما اثرات اصلی تنش در سطح احتمال یک درصد و ژنوتیپ در سطح احتمال پنج درصد معنی‌دار بودند (جدول 2). برخلاف کلروفیل، محتوای کاروتنوئیدها در هر دو ژنوتیپ تحت تنش افزایش یافت (شکل 9–الف و ب). این افزایش در ژنوتیپ متحمل از 42/2 میکرومول بر گرم به 41/3، و در ژنوتیپ حساس از 25/2 میکرومول بر گرم به 12/3 بود. کاروتنوئیدها رنگدانه‌های کمکی هستند که نقش حیاتی در محافظت نوری ایفا می‌کنند
(Kalefetoǧlu Macar & Ekmekçi, 2008). هنگامی که به دلیل بسته­شدن روزنه‌ها در شرایط خشکی، CO₂ برای فتوسنتز محدود می‌شود، انرژی نوری اضافی جذب­شده توسط کلروفیل باید دفع شود. کاروتنوئیدها این انرژی اضافی را به­صورت گرما تلف می‌کنند و همچنین رادیکال‌های آزاد اکسیژن را خنثی می‌سازند، و بدین ترتیب از تخریب کلروفیل و غشاها جلوگیری می‌کنند

(Kalefetoǧlu Macar & Ekmekçi, 2008).

3-9. محتوای پرولین

تجمع پرولین فاقد اثر متقابل ژنوتیپ در تنش معنی‌دار بود، اما اثرات اصلی تنش و ژنوتیپ در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار بودند (جدول 2). پرولین در هر دو ژنوتیپ به شدت افزایش یافت، اما میزان تجمع در ژنوتیپ متحمل به­طور قابل توجهی بالاتر از ژنوتیپ حساس بود (شکل 10-ب). محتوای پرولین در ژنوتیپ متحمل و حساس تحت شرایط بدون تنش به­ترتیب 65/10 و 89/9 میکروگرم بر گرم اندازه‌گیری شد. این میزان تحت تنش شدید در ژنوتیپ متحمل و حساس به­ترتیب به 61/12 و 81/11 میکروگرم بر گرم افزایش یافت. پرولین یک اسمولیت سازگار چندکاره و کلیدی است که تجمع آن یکی از رایج‌ترین و مهم‌ترین پاسخ‌های گیاه به تنش‌های اسمزی (خشکی و شوری) است (Chun et al., 2018). نقش اصلی پرولین، تنظیم اسمزی است؛ با انباشته­شدن در سیتوپلاسم، پتانسیل اسمزی سلول را کاهش می‌دهد و به حفظ فشار تورژسانس و جذب آب از خاک خشک کمک می‌کند (Ghosh et al., 2021). علاوه­بر­این، پرولین به عنوان یک محافظ مولکولی و یک آنتی‌اکسیدان غیرآنزیمی عمل کرده و از ساختارهای پروتئینی و غشاها در برابر آسیب ناشی از کم‌آبی و ROS محافظت می‌کند (Zeroual et al., 2022). تجمع بیشتر پرولین در ژنوتیپ متحمل نشان­دهنده حفظ بهتر تورژسانس و پایداری بهتر غشا در ژنوتیپ متحمل است.

3-10. محتوای قندهای محلول

اثر متقابل ژنوتیپ در تنش برای محتوای قندهای محلول معنی‌دار (در سطح احتمال یک درصد) بود (جدول 2). قندهای محلول در هر دو ژنوتیپ افزایش یافتند، اما این افزایش در ژنوتیپ متحمل به­طور چشمگیری و به مراتب بیشتر از ژنوتیپ حساس بود (شکل 11). به­طوری­که در ژنوتیپ متحمل از 2/34 به 86/39 میکروگرم بر گرم و در ژنوتیپ حساس از 15/34 به 11/39 میکروگرم بر گرم افزایش یافت. قندهای محلول، در کنار پرولین، نقش اساسی در تنظیم اسمزی دارند و با کاهش پتانسیل آب سلولی، به حفظ تورژسانس کمک می‌کنند (El Haddad et al., 2023). آن‌ها همچنین به عنوان مولکول‌های سیگنالینگ حیاتی در مسیرهای پاسخ به تنش به عنوان پاک‌کننده ROS عمل می‌کنند (Ghosh et al., 2021). ژنوتیپ متحمل نه تنها پرولین بیشتری می‌سازد، بلکه به­طور تهاجمی مسیرهای بیوسنتز یا تجزیه نشاسته به قندهای محلول را نیز فعال می‌کند. این پاسخ هماهنگ یک پتانسیل اسمزی بسیار منفی و محافظت‌کننده ایجاد می‌کند که به ژنوتیپ متحمل اجازه می‌دهد در شرایط کمبود آب، آب را حفظ کرده و فرآیندهای متابولیکی حیاتی را ادامه دهد.

3-11. محتوای پروتئین کل

اثر متقابل ژنوتیپ در تنش با سطح احتمال یک درصد در صفت محتوای پروتئین کل معنی‌دار شد (جدول 2). پروتئین کل در هر دو ژنوتیپ تحت تنش کاهش یافت (در ژنوتیپ متحمل از 8/530 به 3/410 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، اما این کاهش در ژنوتیپ حساس بسیار شدیدتر بود (از 01/559 به 36/398 میکروگرم بر میلی‌لیتر) (شکل 12). کاهش پروتئین کل تحت تنش خشکی یک پدیده رایج است که به دو دلیل اصلی رخ می‌دهد: مهار ترجمه و سنتز پروتئین که فرآیندی بسیار پرانرژی است و در شرایط کمبود منابع متوقف می‌شود، و افزایش تخریب پروتئین به دلیل آسیب‌های اکسیداتیو یا نیاز به بازیافت اسیدهای آمینه برای تولید اسمولیت‌هایی مانند پرولین (Nadeem et al., 2019). نتایج نشان می‌دهد که ژنوتیپ حساس در حال از دست­دادن پروتئین‌های خود است. در مقابل، ژنوتیپ متحمل، اگرچه کاهش نشان می‌دهد، اما به­طور قابل­توجهی قادر به محافظت بهتری از پروتئین‌های عملکردی خود است.

3-12. نشانگرهای تنش اکسیداتیو

برای هر دو نشانگر کلیدی تنش اکسیداتیو، یعنی هیدروژن­پراکسید و مالون‌دی‌آلدهید، اثر متقابل ژنوتیپ در تنش معنی‌دار نبود، اما اثرات اصلی تنش (در سطح احتمال یک درصد) و ژنوتیپ (در سطح احتمال یک درصد) معنی‌دار بودند (جدول 2). هیدروژن­پراکسید یک مولکول سیگنالینگ کلیدی از خانواده ROS است، اما در غلظت‌های بالا به شدت سمی بوده و باعث آسیب سلولی می‌شود (Ibrahim & Jaafar, 2012). مالون‌دی‌آلدهید محصول نهایی و پایدار پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی است و به عنوان شاخص مستقیم آسیب اکسیداتیو به غشاها عمل می‌کند (Khatun et al., 2021). داده‌ها نشان می‌دهند که هر دو ماده تحت تنش در هر دو ژنوتیپ افزایش می‌یابند (محتوای H₂O₂ در ژنوتیپ متحمل و حساس به­ترتیب از 5/55 و 58/70 به 33/67 و 38/85 میکروگرم بر میلی‌لیتر افزایش و محتوای MDA در ژنوتیپ متحمل و حساس به­ترتیب از 89/4 و 99/4 به 34/6 و 86/6 نانومول بر میلی‌لیتر افزایش می‌یابد) که تأیید می‌کند هر دو گیاه دچار تنش اکسیداتیو شده‌اند (شکل 13). با این حال، اثر اصلی معنی‌دار ژنوتیپ یافته کلیدی است. این نشان می‌دهد که اگرچه هر دو گیاه تنش اکسیداتیو را تجربه می‌کنند، ژنوتیپ حساس تحت تنش اکسیداتیو بسیار بیشتری قرار دارد، زیرا سیستم دفاعی آن توانایی خنثی‌سازی هیدروژن­پراکسید را ندارد. این H₂O₂ اضافی به لیپیدهای غشا حمله کرده و MDA بیشتری تولید می‌کند که منجر به نشت یونی بیشتر می‌شود.

3-13. فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی

اثر متقابل ژنوتیپ در تنش در فعالیت آنزیم کاتالاز معنی‌دار نبود، اما اثرات اصلی تنش و ژنوتیپ (در سطح احتمال یک درصد) معنی‌دار بودند (جدول 2). فعالیت کاتالاز که عمدتاً در پراکسی‌زوم‌ها H₂O₂ با غلظت بالا را حذف می‌کند
(Cruz de Carvalho, 2008) در هر دو ژنوتیپ افزایش یافت، اما در ژنوتیپ متحمل به­طور مداوم بالاتر بود (شکل 14-الف و ب). فعالیت کاتالاز در دو ژنوتیپ متحمل و حساس در شرایط بدون تنش به­ترتیب µmolH₂O₂min^-1mgprot^-1 025/0 و 019/ اندازه‌گیری شد. میزان فعالیت آن در تنش شدید µmolH₂O₂min^-1mgprot^-1 035/0 و 024/0 بود. این نشان‌دهنده یک پاسخ دفاعی عمومی و پایه‌ای است که در ژنوتیپ متحمل قوی‌تر است (Sofo et al., 2015).

آسکوربات­پراکسیداز و گایاکول­پراکسیداز برخلاف کاتالاز، اثر متقابل ژنوتیپ در تنش معنی‌دار (در سطح احتمال یک درصد) نشان دادند (جدول 2). فعالیت این دو آنزیم در ژنوتیپ متحمل به شدت و به­طور چشمگیری افزایش یافت (فعالیت APX و GPX در ژنوتیپ متحمل از 062/0 و 93/0 به µmol Ascorbate min^-1mg prot^-1 094/0 و µmol Guaiacol min^-1mg prot^-1 52/1)، در حالی که در ژنوتیپ حساس افزایش بسیار ناچیزی در فعالیت APX داشت یا افزایش فعالیت GPX آن به مراتب کمتر بود (فعالیت APX و GPX در ژنوتیپ حساس از 041/0 و 89/0 به µmol Ascorbate min^-1mg prot^-1 06/0 و
µmol Guaiacol min^-1mg prot^-1 26/1) (شکل 14–ج و د).

آسکوربات­پراکسیداز و گایاکول­پراکسیداز آنزیم‌های با میل ترکیبی بالا برای H₂O₂ هستند که در اندامک‌های مختلف از جمله کلروپلاست و سیتوزول، وظیفه تنظیم دقیق و پاکسازی H₂O₂ را بر عهده دارند (Anjum et al., 2016). اثر متقابل معنی‌دار ژنوتیپ در تنش نشان­دهنده تفاوت اساسی بین دو ژنوتیپ و توانایی ژنوتیپ متحمل در فعال‌سازی اختصاصی این مسیرهای پاکسازی پیشرفته و با کارایی بالا است (Nadeem et al., 2019)؛ در­حالی­که ژنوتیپ حساس در این فعال‌سازی شکست می‌خورد. این پاسخ آنزیمی برتر در ژنوتیپ متحمل توضیح می‌دهد که چرا با وجود تولید ROS، سطوح H₂O₂ و MDA پایین‌تری دارد و در نتیجه آسیب غشایی و تخریب کلروفیل کمتری را تجربه می‌کند.

3-14. بررسی بیان ژن‌های موثر در تنش خشکی

3-14-1.High Cholorophyll Fluorescence 136

بیان نسبی ژن HCF136 در هر دو ژنوتیپ تحت تنش شدید افزایش یافت. این افزایش در ژنوتیپ متحمل 92/1 برابر و در ژنوتیپ حساس 53/1 برابر بود (شکل 15). ژن HCF136 برای مونتاژ، پایداری و تعمیر مرکز واکنش فتوسیستم II (PSII) حیاتی است (Meurer et al., 1998). فوتوسیستم II اولین و حساس‌ترین بخش زنجیره فتوسنتزی است که تحت تنش خشکی آسیب می‌بیند و به منبع اصلی تولید ROS تبدیل می‌شود (Zadražnik et al., 2019). افزایش بیان HCF136 در هر دو ژنوتیپ نشان‌دهنده یک مکانیسم فعال تعمیر و نگهداری است؛ گیاه در تلاش است تا واحدهای آسیب‌دیده PSII را جایگزین کند
(Plöchinger et al., 2016). بیان بالاتر در ژنوتیپ متحمل نشان‌دهنده ظرفیت تعمیراتی قوی‌تر است (Zadražnik et al., 2019). این موضوع نشان می‌دهد که چرا ژنوتیپ متحمل کلروفیل خود را بهتر حفظ کرده و آسیب اکسیداتیو کمتری را تجربه می‌کند.

3-14-2. بتاآمیلاز [13]

بیان نسبی ژن بتاآمیلاز (BA) در هر دو ژنوتیپ به­طور معنی‌داری کاهش یافت (شکل 15). این کاهش در ژنوتیپ حساس 14/0 برابر و در ژنوتیپ متحمل 31/0 برابر بود. این یافته در نگاه اول با افزایش شدید قندهای محلول متناقض است، زیرا BA نشاسته را به قند (مالتوز) تجزیه می‌کند (Yang et al., 2023). با این حال، برخی ایزوفرم‌های BA (مانند BAM1) به­طور خاص در سلول‌های نگهبان روزنه بیان می‌شوند و کاهش بیان آن‌ها منجر به تجمع نشاسته در این سلول‌ها و بسته­شدن روزنه‌ها می‌شود که یک مکانیسم کلیدی حفظ آب است. بنابراین، کاهش کنترل‌شده بیان این ژن در ژنوتیپ متحمل می‌تواند یک پاسخ تنظیمی فعال برای کمک به بستن روزنه‌ها باشد (Prasch et al., 2015). در مقابل، کاهش بسیار شدیدتر در ژنوتیپ حساس به احتمال زیاد نشان‌دهنده یک فروپاشی کلی در متابولیسم پایه است.

3-14-3. میواینوزیتول‌مونوفسفاتاز

بیان نسبی ژن MIMP نیز در هر دو ژنوتیپ کاهش یافت (شکل 15). این کاهش در ژنوتیپ متحمل 30/0 برابر و در ژنوتیپ حساس 49/0 برابر بود. میواینوزیتول‌مونوفسفاتاز آنزیمی در مسیر متابولیسم اینوزیتول است. این مسیر هم برای تولید اسمولیت‌ها و هم برای سیگنالینگ تنش حیاتی است (Nourbakhsh et al., 2015). میواینوزیتول‌مونوفسفاتاز و سایر فسفاتازها، این مولکول‌های سیگنالینگ (مانند InsP3) را تجزیه کرده و سیگنال تنش را خاتمه می‌دهند (Jia et al., 2019). بنابراین، سرکوب شدیدتر MIMP در ژنوتیپ متحمل یک مکانیسم بازخورد منفی پیشرفته است. این سرکوب باعث می‌شود سیگنال‌های InsP3 و Ca⁺² برای مدت طولانی‌تری فعال بمانند و پاسخ‌های دفاعی پایین‌دستی را قوی‌تر تحریک کنند. ژنوتیپ حساس، با سرکوب کمتر MIMP، سیگنال تنش را زودتر خاموش می‌کند و قادر به اجرای یک پاسخ دفاعی کامل نیست (Joshi-Saha & Reddy, 2015).

4-14-3. DREB1C

بیان نسبی این ژن در هر دو ژنوتیپ کاهش یافت (متحمل 52/0 برابر؛ حساس 17/0 برابر) (شکل 15). این یافته ممکن است در ابتدا متناقض به نظر برسد، زیرا DREBها به عنوان فعال‌کننده تحمل به خشکی شناخته می‌شوند (Joshi et al., 2016). با این حال، خانواده DREB بسیار بزرگ است. تشدید بیان DREB1 می‌تواند منجر به کوتولگی و کاهش محصول شود
(Singh & Laxmi, 2015). بنابراین، کاهش بیان DREB1 در هر دو ژنوتیپ (به­ویژه در ژنوتیپ متحمل) می‌تواند یک اقدام تنظیمی هوشمندانه برای اولویت‌بندی مسیرهای مرتبط با خشکی و جلوگیری از اتلاف منابع باشد (Kidokoro et al., 2009).

3-14-5. Abscisic acid/Water deficit stress (ABA/WDS)

این ژن یک پاسخ کاملاً واگرا و تعیین‌کننده نشان داد. بیان نسبی ABA/WDS در ژنوتیپ متحمل به شدت افزایش (59/2 برابر) و در ژنوتیپ حساس به شدت کاهش (09/0 برابر) یافت (شکل 15). این ژن که بخشی از خانواده پروتئین‌های ASR است، هسته مرکزی مسیر سیگنالینگ وابسته به ABA را تشکیل می‌دهد (Liu et al., 2023). این پروتئین‌ها دارای نقش دوگانه هستند: هم به عنوان فاکتور رونویسی و هم به عنوان چاپرون مولکولی برای محافظت فیزیکی از پروتئین‌ها و آنزیم‌ها در برابر تخریب ناشی از کم‌آبی (Yacoubi et al., 2021).

فعال‌سازی شدید این ژن در ژنوتیپ متحمل، برتری آن را در دو بخش نشان می‌دهد؛ فعال‌سازی سیگنالینگ ABA برای بستن روزنه‌ها و سایر دفاع‌ها، و محافظت چاپرونی از پروتئین‌های کلیدی و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان. کاهش شدید آن در ژنوتیپ حساس، دلیل اصلی ناتوانی آن در محافظت از پروتئین‌ها و آنزیم‌ها و در نتیجه، فروپاشی غشاء و مرگ سلولی است.

4. 
   نتیجه‌گیری

نتایج این تحقیق، تفاوت‌های مکانیسمی عمیقی را در استراتژی‌های پاسخ به تنش خشکی بین دو ژنوتیپ متحمل و حساس عدس آشکار می‌سازد. ژنوتیپ حساس یک پاسخ غیرفعال و فروپاشی متابولیکی را نشان داد. اگرچه این ژنوتیپ تلاش‌های اولیه‌ای برای سازگاری عمومی (مانند کاهش تعداد برگ و افزایش کاروتنوئید) نشان داد، اما در نقاط کلیدی تنظیم مولکولی شکست خورد. مهمتر از همه، این ژنوتیپ نه تنها نتوانست مسیر سیگنالینگ حیاتی وابسته به ABA (یعنی ژن ABA/WDS) را فعال کند، بلکه بیان این ژن دچار فروپاشی شد. این شکست مولکولی منجر به ناتوانی در فعال‌سازی سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی با میل ترکیبی بالا (APX و GPX) شد. در نتیجه، H₂O₂ تجمع یافته و منجر به آسیب اکسیداتیو گسترده، پراکسیداسیون شدید لیپیدی، از دست­دادن کامل یکپارچگی غشا و تخریب پروتئین‌ها شد. در مقابل، ژنوتیپ متحمل یک استراتژی دفاعی فعال، چندلایه و هماهنگ را اجرا کرد. این استراتژی در سطح ریخت‌شناسی با فعال‌سازی دفاع فیزیکی (افزایش کرک) و حفظ بهتر تورژسانس (حفظ ارتفاع) آشکار شد. این برتری فیزیولوژیکی توسط یک دفاع بیوشیمیایی قدرتمند پشتیبانی می‌شود که شامل تجمع همزمان و بیشتر اسمولیت‌ها (پرولین و قندهای محلول) برای تنظیم اسمزی و محافظت چاپرونی، و یک پاسخ آنتی‌اکسیدانی بسیار برتر از طریق فعال‌سازی شدید آنزیم‌های APX و GPX برای خنثی‌سازی ROS است. نکته قابل توجه، این ژنوتیپ به جای حفظ دستگاه فتوسنتزی، از یک استراتژی محافظت نوری فعال از طریق تخریب کلروفیل و کاهش شاخص سطح برگ برای جلوگیری از تولید ROS استفاده کرد. در نهایت، این دفاع هماهنگ توسط یک شبکه تنظیمی هوشمند مولکولی هدایت می‌شود که شامل افزایش شدید بیان ABA/WDS برای ایجاد محافظت چاپرونی و سیگنالینگ ABA، افزایش بیان HCF136 برای تعمیر فعالانه فتوسیستم II آسیب‌دیده، و تنظیم دقیق مسیرهای سیگنالینگ (مانند سرکوب MIMP) برای طولانی‌تر کردن سیگنال تنش است. در مجموع، تحمل در ژنوتیپ مورد بررسی نه از طریق یک مکانیسم واحد، بلکه از طریق یک پاسخ تنظیمی برتر، فعال‌سازی هماهنگ مسیرهای محافظت اسمزی و آنتی‌اکسیدانی، و توانایی حفظ یکپارچگی ساختاری و مولکولی در مواجهه با تنش اکسیداتیو حاصل می‌شود.

5. منابع

امینی، ز.، حداد، ر.، و مرادی، ف. (1387). بررسی اثر تنش کم­آبی بر نحوه فعالیت آنزیم‌های ضد اکسنده در مراحل رشد زایشی گیاه جو (Hordeum vulgare L.). علوم آب و خاک، 12(۴۶). ۶۵-۷۴. DOI: 20.1001.1.24763594.1387.12.46.7.6

حسینعلی­پور، ب.، راهنما, ا.، و فرخیان­فیروزی، ا. (1399). اثر تنش خشکی بر رشد و معماری ریشه‌ گندم در مرحله رشد رویشی. علوم گیاهان زراعی ایران، 51(1)، 75-63. DOI: 20.1001.1.20084811.1399.51.1.6.5

خزاعی، م.، گلوی، م.، دهمرده، م.، موسوی­نیک، س.م.، زمانی، غ.، مهدی­نژاد، ن.، و همکاران. (1397). تأثیر تنش خشکی بر فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانی در سه ژنوتیپ ارزن دم‌روباهی (Setaria italica L.). فرآیند و کارکرد گیاهی، ۷(۲۷)، ۲۶۹-۲۸۰.
DOI: 20.1001.1.23222727.1397.7.27.18.9

قوچانیان حق­وردی، ا.، خزیمه­نژاد، ح.، مقری­فریز، ع.، و خراشادی­زاده، ا. (1403).  Efficiency of Machine Learning Techniques for Predicting Vapor Pressure Deficit in Arid and Semi-Arid Regions (Case Study: South Khorasan Province ). مجله پژوهش­های خشکسالی و تغییراقلیم، 2(4)، 85-102. DOI: 10.22077/jdcr.2024.8327.1082

Abdel-Ghany, S.E., Ullah, F., Ben-Hur, A., & Reddy, A.S.N. (2020). Transcriptome analysis of drought-resistant and drought-sensitive sorghum (Sorghum bicolor) genotypes in response to PEG-induced drought stress. International Journal of Molecular Sciences, 21(3), 772.

Aebi, H. (1974). Catalase. In Methods of enzymatic analysis (pp. 673–684). Elsevier.

Anjum, N.A., Sharma, P., Gill, S.S., Hasanuzzaman, M., Khan, E.A., Kachhap, K., Mohamed, A.A., Thangavel, P., Devi, G.D., & Vasudhevan, P. (2016). Catalase and ascorbate peroxidase—representative H₂O₂-detoxifying heme enzymes in plants. Environmental Science and Pollution Research, 23(19), 19002–19029.

Bates, L.S., Waldren, R.P.A., & Teare, I.D. (1973). Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39, 205–207.

Biju, S., Fuentes, S., & Gupta, D. (2023). Novel insights into the mechanism (s) of silicon-induced drought stress tolerance in lentil plants revealed by RNA sequencing analysis. BMC Plant Biology, 23(1), 498.

Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1–2), 248–254.

Chance Maehly, A.C. (1995). Assay of catalases and peroxidases. Methods in Enzymology, 2, 764–775.

Chen, J.J., Sun, Y., Kopp, K., Oki, L., Jones, S.B., & Hipps, L. (2022). Effects of water availability on leaf trichome density and plant growth and development of Shepherdia× utahensis. Frontiers in Plant Science, 13, 855858.

Chun, S.C., Paramasivan, M., & Chandrasekaran, M. (2018). Proline accumulation influenced by osmotic stress in arbuscular mycorrhizal symbiotic plants. Frontiers in Microbiology, 9, 2525.

Cruz de Carvalho, M.H. (2008). Drought stress and reactive oxygen species: Production, scavenging and signaling. Plant Signaling & Behavior, 3(3), 156–165.

El Haddad, N., En-Nahli, Y., Choukri, H., Aloui, K., Mentag, R., El-Baouchi, A., Hejjaoui, K., Rajendran, K., Smouni, A., & Maalouf, F. (2023). Metabolic mechanisms underlying heat and drought tolerance in lentil accessions: Implications for stress tolerance breeding. Plants, 12(23), 3962.

Erskine, W. (2009). Global production, supply and demand. The Lentil: Botany, Production and Uses, 4–12.

Feng, R., Zhang, Y., Yu, W., Hu, W., Wu, J., Ji, R., Wang, H., & Zhao, X. (2013). Analysis of the relationship between the spectral characteristics of maize canopy and leaf area index under drought stress. Acta Ecologica Sinica, 33(6), 301–307.

Feng, S., Sikdar, A., Wang, J., Memon, M., Li, B., Ma, H., & Lv, G. (2021). Response of Amorpha fruticosa seedlings to drought and rewatering in arid and semi-arid environment. Pakistan Journal of Botany, 53(2), 419–424.

Feng, X., Zhong, L., Tian, Q., & Zhao, W. (2022). Leaf water potential-dependent leaflet closure contributes to legume leaves cool down and drought avoidance under diurnal drought stress. Tree Physiology, 42(11), 2239–2251.

Ghochanian Haghverdi, E., Khozeymeh Nezhad, H., Moghri Friz, A., & Khorashadizadeh, O. (2025). Efficiency of machine learning techniques for predicting vapor pressure deficit in arid and semi-arid regions (Case study: South Khorasan Province). Journal of Drought and Climate change Research, 2(4), 85–102. https://doi.org/10.22077/jdcr.2024.8327.1082.

Ghosh, U.K., Islam, M.N., Siddiqui, M.N., & Khan, M.A.R. (2021). Understanding the roles of osmolytes for acclimatizing plants to changing environment: A review of potential mechanism. Plant Signaling & Behavior, 16(8), 1913306.

Hodges, D.M., DeLong, J.M., Forney, C.F., & Prange, R.K. (1999). Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds. Planta, 207, 604–611.

Ibrahim, M.H., & Jaafar, H.Z.E. (2012). Primary, secondary metabolites, H₂O₂, malondialdehyde and photosynthetic responses of Orthosiphon stimaneus Benth. to different irradiance levels. Molecules, 17(2), 1159–1176.

Ifeduba, A.M., Zhen, S., Pandey, J., & Vales, M.I. (2024). Leaf membrane stability under high temperatures as an indicator of heat tolerance in potatoes and genome-wide association studies to understand the underlying genetics. Plants, 13(16), 2175.

Jia, Q., Kong, D., Li, Q., Sun, S., Song, J., Zhu, Y., Liang, K., Ke, Q., Lin, W., & Huang, J. (2019). The function of inositol phosphatases in plant tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences, 20(16), 3999.

Joshi, R., Wani, S.H., Singh, B., Bohra, A., Dar, Z.A., Lone, A.A., Pareek, A., & Singla-Pareek, S.L. (2016). Transcription factors and plants response to drought stress: Current understanding and future directions. Frontiers in Plant Science, 7, 1029.

Joshi-Saha, A., & Reddy, K.S. (2015). Repeat length variation in the 5ʹUTR of myo-inositol monophosphatase gene is related to phytic acid content and contributes to drought tolerance in chickpea (Cicer arietinum L.). Journal of Experimental Botany, 66(19), 5683–5690.

Kalefetoǧlu Macar, T., & Ekmekçi, Y. (2008). PSII photochemistry and antioxidant responses of a chickpea variety exposed to drought. Zeitschrift Für Naturforschung C., 63(7–8), 583–594.

Khan, A.A., Wang, Y.F., Akbar, R., & Alhoqail, W.A. (2025). Mechanistic insights and future perspectives of drought stress management in staple crops. Frontiers in Plant Science, 16, 1547452.

Khatun, M., Sarkar, S., Era, F.M., Islam, A.K.M.M., Anwar, M.P., Fahad, S., Datta, R., & Islam, A.K.M.A. (2021). Drought stress in grain legumes: Effects, tolerance mechanisms and management. Agronomy, 11(12), 2374.

Kidokoro, S., Maruyama, K., Nakashima, K., Imura, Y., Narusaka, Y., Shinwari, Z.K., Osakabe, Y., Fujita, Y., Mizoi, J., & Shinozaki, K. (2009). The phytochrome-interacting factor PIF7 negatively regulates DREB1 expression under circadian control in Arabidopsis. Plant Physiology, 151(4), 2046–2057.

Kumar, A., & Elston, J. (1992). Genotypic differences in leaf water relations between Brassica juncea and B. napus. Annals of Botany, 70(1), 3–9.

Lichtenthaler, H.K., & Wellburn, A.R. (1983). Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents. Portland Press Ltd.

Liu, H., Ding, Q., Cao, L., Huang, Z., Wang, Z., Zhang, M., & Jian, S. (2023). Identification of the abscisic acid-, stress, and ripening-induced (ASR) samily involved in the adaptation of Tetragonia tetragonoides (Pall.) kuntze to saline–alkaline and drought habitats. International Journal of Molecular Sciences, 24(21), 15815.

Livak, K.J., & Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods, 25(4), 402–408.

Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K.V, & Westhoff, P. (1998). A nuclear‐encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. The EMBO Journal.

Montejano-Ramírez, V., & Valencia-Cantero, E. (2024). The importance of lentils: An overview. Agriculture, 14(1), 103.

Nadeem, M., Li, J., Yahya, M., Sher, A., Ma, C., Wang, X., & Qiu, L. (2019). Research progress and perspective on drought stress in legumes: A review. International Journal of Molecular Sciences, 20(10), 2541.

Nakano, Y., & Asada, K. (1987). Purification of ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts; its inactivation in ascorbate-depleted medium and reactivation by monodehydroascorbate radical. Plant and Cell Physiology, 28(1), 131–140.

Noor, M.M.Al, Tahjib-Ul-Arif, M., Alim, S.M.A., Islam, M.M., Hasan, M.T., Babar, M.A., Hossain, M.A., Jewel, Z.A., Murata, Y., & Mostofa, M.G. (2024a). Lentil adaptation to drought stress: Response, tolerance, and breeding approaches. Frontiers in Plant Science, 15, 1403922.

Noor, M.M.Al, Tahjib-Ul-Arif, M., Alim, S.M.A., Islam, M.M., Hasan, M.T., Babar, M.A., Hossain, M.A., Jewel, Z.A., Murata, Y., & Mostofa, M.G. (2024b). Lentil adaptation to drought stress: Response, tolerance, and breeding approaches. Frontiers in Plant Science, 15, 1403922.

Nourbakhsh, A., Collakova, E., & Gillaspy, G.E. (2015). Characterization of the inositol monophosphatase gene family in Arabidopsis. Frontiers in Plant Science, 5, 725.

Öktem, H.A., Eyidoðan, F., Demirba, D., Bayraç, A.T., Öz, M.T., Özgür, E., Selçuk, F., & Yücel, M. (2008). Antioxidant responses of lentil to cold and drought stress. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 17, 15–21.

Plöchinger, M., Schwenkert, S., Von Sydow, L., Schröder, W.P., & Meurer, J. (2016). Functional update of the auxiliary proteins PsbW, PsbY, HCF136, PsbN, TerC and ALB3 in maintenance and assembly of PSII. Frontiers in Plant Science, 7, 423.

Prasch, C.M., Ott, K.V., Bauer, H., Ache, P., Hedrich, R., & Sonnewald, U. (2015). ß-amylase1 mutant Arabidopsis plants show improved drought tolerance due to reduced starch breakdown in guard cells. Journal of Experimental Botany, 66(19), 6059–6067.

Qiao, M., Hong, C., Jiao, Y., Hou, S., & Gao, H. (2024). Impacts of drought on photosynthesis in major food crops and the related mechanisms of plant responses to drought. Plants, 13(13), 1808.

Sehgal, A., Sita, K., Kumar, J., Kumar, S., Singh, S., Siddique, K.H.M., & Nayyar, H. (2017). Effects of drought, heat and their interaction on the growth, yield and photosynthetic function of lentil (Lens culinaris Medikus) genotypes varying in heat and drought sensitivity. Frontiers in Plant Science, 8, 1776.

Shahzad, M., Khan, Z., Nazeer, W., Arshad, S.F., Ahmad, F., Farid, B., Shahid, M.R., & Riaz, H. (2021). Effect of drought on trichome density and length in cotton (Gossypium hirsutum). Journal of Bioresource Management, 8(1), 15.

Singh, D., & Laxmi, A. (2015). Transcriptional regulation of drought response: A tortuous network of transcriptional factors. Frontiers in Plant Science, 6, 895.

Sofo, A., Scopa, A., Nuzzaci, M., & Vitti, A. (2015). Ascorbate peroxidase and catalase activities and their genetic regulation in plants subjected to drought and salinity stresses. International Journal of Molecular Sciences, 16(6), 13561–13578.

Sturgeon, R.J. (1990). Monosaccharides. In Methods in Plant Biochemistry, 2, 1–37. Elsevier.

Valentovic, P., Luxova, M., Kolarovic, L., & Gasparikova, O. (2006). Effect of osmotic stress on compatible solutes content, membrane stability and water relations in two maize cultivars. Plant Soil and Environment, 52(4), 184.

Velikova, V., Yordanov, I., & Edreva, A. (2000). Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants: Protective role of exogenous polyamines. Plant Science, 151(1), 59–66.

Yacoubi, I., Hamdi, K., Fourquet, P., Bignon, C., & Longhi, S. (2021). Structural and functional characterization of the aba-water deficit stress domain from wheat and barley: An intrinsically disordered domain behind the versatile functions of the plant abscissic acid, stress and ripening protein family. International Journal of Molecular Sciences, 22(5), 2314.

Yang, T., Li, H., Li, L., Wei, W., Huang, Y., Xiong, F., & Wei, M. (2023). Genome-wide characterization and expression analysis of α-amylase and β-amylase genes underlying drought tolerance in cassava. BMC Genomics, 24(1), 190.

Ye, H., Roorkiwal, M., Valliyodan, B., Zhou, L., Chen, P., Varshney, R.K., & Nguyen, H.T. (2018). Genetic diversity of root system architecture in response to drought stress in grain legumes. Journal of Experimental Botany, 69(13), 3267–3277.

Ye Heng, Y.H., Manish Roorkiwal, M.R., Babu Valliyodan, B.V., Zhou LiJuan, Z.L., Chen PengYin, C.P., Varshney, R.K., & Nguyen, H.T. (2018). Genetic diversity of root system architecture in response to drought stress in grain legumes.

Zadražnik, T., Moen, A., & Šuštar-Vozlič, J. (2019). Chloroplast proteins involved in drought stress response in selected cultivars of common bean (Phaseolus vulgaris L.). 3 Biotech, 9(9), 331.

Zeroual, A., Baidani, A., & Idrissi, O. (2022a). Drought stress in lentil (Lens culinaris Medik) and approaches for its management. Horticulturae, 9(1), 1.

Zeroual, A., Baidani, A., & Idrissi, O. (2022b). Drought stress in lentil (Lens culinaris Medik) and approaches for its management. Horticulturae, 9(1), 1.

1. Relative Water Content (RWC)
2. 2. Electrolyte Leakage Index (ELI)
3. 3. Leaf Area Index (LAI)
4. 4. Ninhydrin
5. 5. Malondialdehyde (MDA)
6. 6. Hydrogen peroxide (H₂O₂)
7. 7. Accession number
8. 8. Alignment
9. 9. Consensus
10. 1 Coding DNA Sequence
11. 1 Expressed Sequence Tag
12. 1 Reads
13. Beta amylase (BA)