. مقدمه

طی هزاران سال، طبیعت منبع اصلی مواد دارویی بوده و بسیاری از داروهای امروزی از منابع طبیعی استخراج شده‌اند. گیاهان از دیرباز برای درمان بیماری‌ها به‌عنوان داروهای سنتی مورد استفاده قرار گرفته‌اند و محصولات مختلف طبیعی آن‌ها الهام‌بخش توسعه داروهای نوین بوده است. با توجه به اینکه بخش عمده‌ای از تنوع زیستی جهانی هنوز کشف نشده است، محصولات طبیعی در تأمین نیازهای دارویی نقش حیاتی خواهند داشت (Chaachouay & Zidane, 2024). از­آنجایی­که داروهای گیاهی معمولاً اثرات جانبی کمی دارند، تمایل به استفاده از محصولات گیاهی در سراسر جهان به­طور قابل توجهی رشد کرده است (Coopoosamy et al., 2023).

با توجه به اهمیت روزافزون گیاهان دارویی در درمان بیماری‌ها و کاهش اثرات جانبی، گیاهان مختلفی همچون استبرق به‌عنوان منابع طبیعی دارویی، توجه زیادی را به خود جلب کرده‌اند. استبرق با نام علمی Calotropis procera، گونه­ای از گیاهان گلدار، چندساله و همیشه­سبز است که به خانواده Apocynaceae تعلق دارد و به‌طور طبیعی در مناطق وسیعی از ایران، از جمله خوزستان، سیستان و بلوچستان، کرمان، هرمزگان، فارس و بوشهر می‌روید (Avazzadeh et al., 2018; Kaur et al., 2021). استفاده از این گیاه دارویی ارزشمند در طب سنتی برای درمان سرماخوردگی، تب، جذام، آسم، روماتیسم، اگزما، سوء هاضمه، اسهال، بیماری­های پوستی و اسهال خونی گزارش شده است (Al-Rowaily et al., 2020).

عصاره آبی ریشه استبرق حاوی ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی با ویژگی­های آنتی‌اکسیدانی و ضدباکتریایی است و این ویژگی­ها پیش‌تر شناسایی شده‌اند (Kumar et al., 2013). پوست ریشه این گیاه حاوی ترکیبات فنولی نظیر بنزوئیلینولون، بنزوئیل­ایزولینولون و ترکیبات مادارالبان و مادار فلواویل است (Oloumi, 2014). فلاون‌ها و ترکیباتی مانند هسپریدین، روتین و نرینجنین به­عنوان عوامل ضدالتهاب به شمار می­روند و نمونه‌هایی از ترکیبات فعال زیستی موجود در شیره استبرق هستند (Farooq et al., 2017). تجزیه و تحلیل فیتوشیمیایی نشان داده است که ترکیباتی مثل وانیلین، اسیدکلروژنیک، اسیدگالیک و دایدزین، عمده ترکیبات فنولی موجود در عصاره‌ این گیاه هستند (Nofal et al., 2024). مطالعات کیفی و کمی با استفاده از روش HPLC نشان داده‌اند که در برگ‌ها و پوست ریشه گیاه استبرق چندین اسید فنولی از جمله اسیدسیناپیک، اسیدوانیلیک و اسیدپروتکاتچوئیک حضور دارند (Mehmood et al., 2020). همچنین، آنالیز GC-MS وجود ترکیبات تری‌ترپن حلقوی پنج‌تایی مانند لوپئول، α-آمیرین، β-آمیرین و اسیداورسولیک را در عصاره متانولی پوست ریشه این گیاه تأیید کرده است. این ترکیبات پلی‌فنولی و آنتی‌اکسیدانی در عصاره پوست ریشه با فعالیت آنتی‌اکسیدانی قوی همراه بوده و می‌توانند در محافظت از سلول‌ها در برابر آسیب‌های ناشی از رادیکال‌های آزاد نقش مهمی ایفا کنند (Kyada et al., 2023). ترکیبات فلاونوئیدی ۳-O-روتینوزید کامپفرول، ایزورامنتین-۳-O-روتینوزید، فلاونوئیدگلیکوزید ۵-هیدروکسی-۳، ۷-دی­متوکسی­فلاون-۴' O- بتا-D-گلوکوپیرانوزید و کوئرستین-۳-O-روتینوزید در بخش‌های هوایی لاتکس این گیاه گزارش شده است (Farooq et al., 2017). علاوه­براین این گیاه حاوی ترکیبات استروئیدی کاردینولید مانند کالوتروپین است که در مطالعات مقایسه‌ای کمی و کیفی نمونه‌های برگ و لاتکس شناسایی و بررسی شده‌اند (Seiber et al., 1982). پژوهش‌های مختلف نشان داده است که گیاه استبرق قادر به تولید گلیکوزیدهای قلبی است که این ویژگی در شرایط کشت بافت و سلول نیز مورد تأکید قرار گرفته است (Djerdjouri et al., 2024; EL-Bakry et al., 2011) و همچنین ژن‌های کاندید مسیر بیوسنتز این ترکیبات در این گیاه شناسایی شده‌اند (Pandey et al., 2016). علاوه‌براین، گلیکوزید جدید پروسرازید A [1]  از پوست ریشه این گیاه استخراج شده که در شرایط آزمایشگاهی اثرات ضدسرطانی نشان داده است (Ibrahim et al., 2014). برای بهره‌برداری مؤثر از خواص گیاهان دارویی مانند استبرق، استفاده از روش­های کشت­بافت گیاهی و دستکاری ژنتیکی می‌تواند به تولید بیشتر و با کیفیت‌تر متابولیت‌های ثانویه کمک کند. این روش‌ها به افزایش بهره‌وری داروهای طبیعی و کاهش اثرات جانبی درمان‌های شیمیایی کمک می‌کنند
 (Biswas et al., 2023). امروزه تولید متابولیت‌های ثانویه در شرایط درون­شیشه‌ای به­واسطه کشت­بافت گیاهی امکان‌پذیر بوده که این روش مستلزم دست­ورزی ژنتیکی گونه‌های حاوی ترکیبات هدف با استفاده از سیستم ناقل طبیعی به نام
 Rhziobium rhizogenes است. این باکتری دارای ‌‌‍Ri‍-پلاسمید (پلاسمید القاکننده ریشه) است که ادغام ناحیه ‌‌T-DNA[2]  آن به ژنوم گیاه میزبان باعث ظهور ریشه از قسمت آلوده گیاه شده که ریشه­مویین (Hairy Root) نامیده می‌شوند
 (Biswas et al., 2023; Gutierrez-Valdes et al., 2020). ریشه‌های مویین به دلیل ویژگی‌هایی مانند پایداری ژنتیکی، تولید زیاد زیست‌توده و توانایی بالای تولید ترکیبات زیستی، به عنوان گزینه‌ای مناسب‌تر نسبت به کشت سوسپانسیون سلولی و کالوس برای تولید متابولیت‌های خاص شناخته می‌شوند. علاوه­براین، ریشه‌های مویین دارای رشد بسیار سریع‌تر بوده و قادرند متابولیت‌های ثانویه را برای مدت زمان طولانی­تری تولید کنند (Gutierrez-Valdes et al., 2020). یکی از مزایای برجسته این نوع کشت، عدم وابستگی کامل آنها به شرایط فصلی و نوری است؛ به­طوری­که می‌توان کشت‌های ریشه­مویین را در شرایط کنترل­شده و بدون نیاز به نور طبیعی یا تغییرات اقلیمی انجام داد. این ویژگی، تولید مداوم و قابل پیش‌بینی ترکیبات زیستی را امکان‌پذیر می‌سازد و نیاز به برداشت گیاهان از محیط طبیعی را کاهش می‌دهد که به حفظ تنوع زیستی و پایداری منابع طبیعی کمک می‌کند (Murthy et al., 2014). همچنین ریشه‌های مویین می‌توانند متابولیت‌های ثانویه‌ای تولید کنند که به­طور معمول در ریشه‌های طبیعی گیاهان وجود ندارند (Stepanova et al., 2022).استفاده از الیسیتور یکی از کاربردی‌ترین و مؤثرترین روش‌ها برای افزایش تولید متابولیت‌های تخصصی در زیست­فناوری و کشت­بافت گیاهی است. الیسیتورها به دو گروه اصلی زیستی و غیرزیستی تقسیم می‌شوند. الیسیتورهای زیستی موادی با منشأ زیستی، مانند پلی‌ساکاریدهای دیواره سلولی گیاهی و میکروارگانیسم‌ها هستند. نمونه‌هایی از این گروه شامل کیتوزان و مخمر هستند. الیسیتورهای غیرزیستی نیز شامل عوامل فیزیکی (نور، تنش اسمزی، شوری، خشکی و دما) و شیمیایی (اسیدسالیسیلیک، متیل­جاسمونات، پراکسید هیدروژن و انواع هورمون‌ها) هستند. هر دو نوع الیسیتور زیستی و غیرزیستی برای تحریک تولید متابولیت‌های ثانویه در کشت­بافت و سلول‌های گیاهی به­کار می‌روند (Jalota et al., 2024; Rogowska & Szakiel, 2021).

کیتوزان یک پلی‌ساکارید است که از بسپارش [3]  گلوکوز­آمین و N-استیل­گلوکزآمین و از استیل‌زدایی کیتین، یعنی یکی از فراوان‌ترین بسپارهای زیستی در طبیعت، به‌دست می‌آید (Mukarram et al., 2023). کیتین در دیواره‌های سلولی سخت‌پوستان، قارچ‌ها، حشرات و همچنین در برخی جلبک‌ها، میکروارگانیسم‌ها و برخی جانوران بی‌مهره وجود دارد (Pellis et al., 2022). کیتوزان به­عنوان یک محرک زیستی، زیست‌سازگار، غیر سمی و زیست‌تخریب‌پذیر شناخته می­شود و دارای ظرفیت کاربردی گسترده‌ای است که با تقویت سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانی گیاه، قادر است تحمل گیاه را در برابر تنش‌های محیطی مختلف از جمله خشکی، دماهای شدید، شوری و سمیت فلزات سنگین افزایش دهد (Hidangmayum et al., 2019;
Mukarram et al., 2023).

متیل­جاسمونات، متیل­استر اسیدجاسمونیک به­عنوان یک مولکول فرار و پیام­رسان اصلی در تنش­های غیرزیستی و زیستی شناسایی شده و نقش مهمی در گیاهان ازجمله کارکردهای مولکولی و ریخت­زایی دارد. با توجه به ماهیت فرار بودن آن و همچنین ظرفیت نفوذ از طریق غشاهای بیولوژیکی، به عنوان یک تنظیم­کننده گیاهی مهم در نظر گرفته می­شود که می­تواند ارتباطات درون و بین سلولی گیاهان را تسهیل کند. این ترکیب برخی پاسخ­های دفاعی، به­ویژه سامانه­های مرتبط با دفاع آنتی­اکسیدانی را تنظیم می­کند (Jeyasri et al., 2023; Wang et al., 2021). مطالعات پیشین روی C. procera نشان داده‌اند که القای پاسخ دفاعی ناشی از زخم از طریق پیام­رسانی جاسمونات، موجب افزایش بیان ژن‌های مرتبط با مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌های ثانویه می‌شود (Pandey et al., 2016). همچنین در مطالعه دیگر روی کشت کالوس گونه استبرق بزرگ
 (C. gigantea)، تأثیر متیل­جاسمونات بر افزایش رونویسی ژن‌های مرتبط با متابولیسم ثانویه تأیید شده است
 (Singh et al., 2024). بر پایه بررسی‌های انجام­شده در سیستم کشت ریشه­مویین، متیل­جاسمونات به عنوان رایج‌ترین الیسیتور استفاده­شده شناخته می‌شود که بیشترین تأثیر را در افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه از جمله ترکیبات فنولی، ترپنی و آلکالوئیدی دارد. در این نوع سیستم کشت، بالاترین میزان تولید ترکیبات زیست­فعال نیز در حضور متیل­جاسمونات مشاهده شده است که این نشان‌دهنده نقش کلیدی این الیسیتور در تحریک تولید گسترده متابولیت‌های ثانویه می‌باشد (Alcalde et al., 2022).

هدف این مطالعه، بررسی تأثیر دو الیسیتور زیستی کیتوزان و متیل­جاسمونات بر افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل ریشه­مویین گیاه استبرق (C. procera) است. این پژوهش با تمرکز بر ارزیابی تغییرات کلی در محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی به‌عنوان شاخص‌های اصلی فعالیت آنتی‌اکسیدانی انجام می‌شود تا نقش این الیسیتورها در بهبود خواص آنتی‌اکسیدانی مشخص شود. همچنین، نتایج این مطالعه می‌تواند راه‌گشای کاربرد این ترکیبات برای افزایش تولید مواد مؤثره گیاهی و بهبود کیفیت گیاهان دارویی باشد.

3. روش‌شناسی پژوهش

3-1. ماده گیاهی

بذرهای استبرق (C. procera) از استان سیستان و بلوچستان (چابهار) جمع ­آوری و جهت به ­دست ­آوردن گیاهچه­ های سترون، به مدت دو تا سه دقیقه با آب لوله­ کشی شستشو داده شدند. در ادامه جهت انجام مراحل ضدعفونی در زیر هود لامینار، بذرها ابتدا به مدت 60 ثانیه با الکل 70% و سپس به مدت 10 دقیقه با هیپوکلریت سدیم (2 % کلر فعال) تیمار شدند. بین مراحل ذکر شده، بذرهای ضدعفونی­شده دو الی سه مرتبه با آب مقطر اتوکلاو شده شسته و در نهایت روی کاغذ صافی سترون، خشک و در محیط کشت MS (Murashige & Skoog, 1962) کشت و در اتاقک رشد نگهداری شدند (دمای °C 1± 25، شدت نور 3500 لوکس و دوره نوری 16-8 ساعت).

3-2. آماده­ سازی محیط تلقیح

تعداد سه سویه مختلف از باکتری Rhizobium rhizogenes شامل ATCC15834، A4 و LBA9402 در محیط کشت LB [4]  مایع حاوی mgL^-1 50 پادزی ریفامپیسین کشت و در انکوباتور با دمای °C 1± 28 با سرعت چرخش rpm 120 جهت رسیدن به OD_600nm برابر با 8/0-6/0، کشت شبانه شدند. سوسپانسیون حاصل از رشد باکتری با سرعت RCF 1792 به مدت پنج دقیقه سانتریفیوژ و بعد از حذف مایع روشناور در محیط تلقیح MS  مایع، مجدداً به مدت پنج ساعت تجدید کشت شدند.

3-3. پیش‌تیمار القای ریشه

جهت انتخاب بهترین شرایط القای ریشه در گیاه استبرق، به­عنوان آزمون پیش­تیمار، دو نوع محیط کشت MS کامل و MS  جامد (gL^-1 7 آگار)، سه سویه باکتری R. rhizogenes (ATCC 15834، A4 و LBA9402) با سه نوع ریزنمونه برگ، ساقه و ریشه مورد آزمایش قرار گرفت. ریزنمونه­های شاهد نیز در محیط تلقیح فاقد باکتری قرار گرفتند و با توجه به مشاهدات نتایج عینی این مرحله، آزمایش اصلی به­صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار جهت القای ریشه­مویین طراحی شد.

3-4. تراریزش گیاه استبرق با استفاده از R. rhizogenes

جهت تراریزش و با هدف القای ریشه­های مویین در استبرق، روش Sharafi et al. (2013) با اندکی تغییرات به­کار رفت. بدین ترتیب دو سویه باکتری R. rhizogenes (LBA9402، A4) و دو ریزنمونه (برگ و ساقه) استفاده شد. ریزنمونه‌ها ابتدا توسط تیغه اسکالپل، زخمی و در محیط تلقیح MS  مایع حاوی سویه­های مختلف باکتری R. rhizogenes مایه­کوبی شدند. بعد از گذشت حدود 10 الی 20 دقیقه، ریزنمونه­ها روی کاغذ صافی آبگیری و به مدت 48 ساعت در محیط هم­کشت MS جامد در شرایط تاریک و دمای °C 1± 25 قرار گرفتند.

بعد از گذشت 48 ساعت، به­منظور حذف آلودگی باکتری R. rhizogenes از ریزنمونه­ها، شستشو با آب مقطر اتوکلاو شده حاوی mgL^-1 500 پادزی سفوتاکسیم صورت گرفت. پس از آبگیری، ریزنمونه­ها توسط کاغذ صافی سترون خشک و سپس به محیط­کشت جامد حاوی پادزی سفوتاکسیم (mgL^-1 500) منتقل شدند (واکشت­ها تا لحظه حذف کامل باکتری در محیط کشت حاوی mgL^-1 300 و mgL^-1 200 سفوتاکسیم تکرار شد). طی مدت 21 روز، سرعت ظاهر شدن ریشه و پس از روز 21 اُم درصد القای ریشه به­عنوان صفات مورد مطالعه اندازه­گیری شدند.

5-3. اثبات مولکولی ماهیت تراریختی ریشه‌ها

اثبات ماهیت تراریختی ریشه­های ظاهرشده با آزمون واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)، برای ژن rolB با استفاده از آغازگر اختصاصی رفت با توالی 5'- ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCACGA -3' و آغازگر اختصاصی برگشت با توالی
 5'- TTAGGCTTCTTTCATTCGGTTTACTGCAGC -3' و همچنین از آغازگر اختصاصی رفت با توالی
 5'- ATGTCGCAAGGACGTAAGCCGA -3' و آغازگر اختصاصی برگشت با توالی
 5'- GGAGTCTTTCAGCATGGAGCAA -3' برای ژن virD (جهت تشخیص آلودگی به باکتری R. rhizogenes) انجام شد. بدین­منظور استخراج DNA ژنومی از ریشه­های ظاهر شده و ریشه معمولی استبرق به روش CTAB (Khan et al., 2007) انجام شد. چرخه PCR برای تکثیر ژن­های مورد نظر شامل یک چرخه واسرشت سازی اولیه در °C ۹۴ (پنج دقیقه)، ۳4 چرخه شامل 30 ثانیه مرحله واسرشت­سازی در دمای °C ۹۴، 45 ثانیه مرحله اتصال در دمای °C ۵۶، 45 ثانیه مرحله گسترش در دمای °C ۷۲ و یک چرخه تکثیر نهایی در °C ۷۲ (به مدت پنج دقیقه) بود. در نهایت مشاهده و عکس­برداری محصولات PCR، با استفاده از دستگاه ژل‌داک انجام شد.

3-6. اندازه‌گیری رشد

بعد از اثبات تراریختی ریشه­های مویین به­دست­آمده، به­منظور دست­یابی به کلون یکنواخت و تکثیر لاین منتخب، کشت در ظروف شیشه­ای حاوی mL 30 محیط مایع (MS ) شامل gL^-1 30 ساکارز (مرک، آلمان) انجام شد. به­منظور ترسیم نمودار سرعت رشد ریشه­مویین، مقدار اولیه یک گرم از لاین ریشه­مویین منتخب به محیط­کشت مذکور افزوده شد (توزین با استفاده از ترازوی دیجیتال در زیر هود لامینار انجام شد). اندازه­گیری وزن تر و وزن خشک، هشت روز بعد از شروع آزمایش با فاصله زمانی هر چهار روز یک­بار با استفاده از ترازوی دقیق صورت گرفت. سه تکرار آماری برای هر نمونه­برداری در نظر گرفته شد.

3-7. استعمال الیسیتورها

به منظور مطالعه اثر الیسیتورهای متیل­جاسمونات و کیتوزان بر تغییرات محتوای تام فنول و فلاونوئید و فعالیت آنتی­اکسیدانی (DPPH)، در ریشه­مویین استبرق، آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار طراحی و اجرا شد. پس از گذشت 24 روز از کشت، تیمار متیل­جاسمونات (دوخفا، هلند) در دو سطح 10 و 50 (µM) و غلظت کیتوزان (سیگما-آلدریچ، آلمان) در دو سطح 100 و 150 (mgL^-1) در شرایط تاریک اعمال و نمونه‌برداری پس از مدت زمان 24 و 48 ساعت انجام شد، بدین ترتیب که ابتدا ریشه­های مویین تازه برداشت و به آرامی با آب مقطر شستشو داده شدند و پس از گرفتن رطوبت اضافی با استفاده از کاغذ صافی داخل فویل آلومینیومی (شکل 9-ب) قرار گرفت و تا لحظه عصاره­گیری در یخچال °C 80- نگهداری شد.

3-8. اندازه‌گیری فنول تام

محتوای فنول تام با استفاده از روش (Soland & Laima, 1999)، با اندکی تغییرات تعیین شد. ابتدا g 1/0 ریشه‌­مویین تازه در mL 5 اتانول 95 % همگن و سپس به‌مدت 72 ساعت در دمای ºC 1± 25 و در تاریکی نگهداری شد. سپس، عصاره به مدت 10 دقیقه در RCF 1792 سانتریفیوژ شد. پس از آن، mL 1 از مایع رویی با mL 1 اتانول 95 %، mL 1 محلول کربنات‌سدیم 5%، mL 3 آب دوبار تقطیر و mL 5/0 محلول 50 % معرف فولین-سیوکالتو (شرکت مرک، آلمان) مخلوط و همگن شد و به مدت نیم ساعت در دمای ºC 1± 25 در شرایط تاریکی قرار گرفت. سپس، جذب نوری نمونه‌ها در طول موج nm 725 قرائت شد. نتایج بر اساس منحنی استاندارد تهیه­شده با استفاده از رقت­های مختلف اسیدگالیک به‌صورت µg GAE.g⁻¹ FW گزارش شد.

3-9. اندازه‌گیری فلاونوئید تام

محتوای فلاونوئید تام با تغییرات جزئی در روش Meda et al. (2005) با استفاده از رنگ­سنجی کلرید آلومینیوم بررسی شد. در این روش، g 2/0 بافت تازه ریشه­مویین با mL 3 متانول اسیدی (متانول: اسیداستیک گلسیال v:v 1:99) مخلوط و همگن شد. بعد از سانتریفیوژ در RCF 11200 به مدت 15 دقیقه، µL 500 از مایع رویی با µL 100 محلول کلرید آلومینیوم 10%، µL 100 استات پتاسیم M 1، mL 5/1 متانول 80 % و mL 8/2 آب دوبار تقطیر مخلوط و به مدت نیم ساعت در دمای ºC 1± 25 در تاریکی نگهداری و جذب نوری نمونه­ها در طول موج nm 415 نسبت به محلول تهی اندازه‌گیری شد. رسم منحنی استاندارد با استفاده از رقت­های مختلف کوئرستین (شرکت مرک، آلمان) حل­شده در متانول به‌صورت µgQE.g⁻¹ FW رسم شد.

3-10. اندازه‌گیری DPPH

بررسی میزان فعالیت آنتی­اکسیدانی با استفاده از 2، 2-دی فنیل-1-پیکریل هیدرازیل ^[5] (DPPH، سیگما) بر اساس روش
 Wu & Wang (2009) با تغییرات جزئی انجام شد. ابتدا، g 2/0 از ریشه­مویین با mL 3 متانول عصاره­گیری شد. سپس عصاره‌ها به مدت 20 دقیقه با سرعت RCF 16128 و در دمای ºC 4 سانتریفیوژ شدند. سپس، µL 20 از هر عصاره به µL 180 از محلول متانولی µM 100 از DPPH افزوده شد. محلول حاصل مخلوط و همگن و به مدت نیم ساعت در دمای ºC 1± 25 داخل فویل آلومینیوم نگهداری شد. جذب نمونه در طول موج nm 517 قرائت شد. میزان فعالیت آنتی­اکسیدانی برحسب درصد با استفاده از رابطه 1 به­دست آمد.

که  میزان جذب تهی و  جذب هر یک از نمونه­های تیمار­شده است.

3-11. تجزیه و تحلیل آماری

به منظور تجزیه­و­تحلیل نتایج از نرم‌افزار آماری SPSS نسخه‌ی 27 (IBM Corp., 2020) و جهت رسم نمودارها از نرم­افزار اکسل (Microsoft Corp., 2019) استفاده شد.

4. یافته‌های پژوهش و بحث

4-1. جوانه­زنی و تهیه ریزنمونه

بذرهای استبرق حدود 5-3 روز بعد از کشت در محیط MS جوانه زدند. گیاهچه‌های 30 روزه درون­شیشه­ای (شکل 1-الف) جهت تهیه ریزنمونه­های برگ، ساقه و ریشه استفاده شدند.

4-2. پیش­تیمار القای ریشه

در این پژوهش، نتایج پیش‌تیمارهای صورت­گرفته جهت القای ریشه در استبرق نشان داد که محیط MS کامل، دو سویه A4 و LBA9402 از باکتری R. rhizogenes و دو ریزنمونه برگ و ساقه بالاترین میزان القای ریشه را نشان دادند. ریزنمونه­های ریشه به دلیل از­بین­رفتن بافت از تیمارها حذف و همچنین در ریزنمونه­های شاهد هیچگونه القای ریشه مشاهده نشد.

4-3. القای ریشه­مویین

براساس نتایج طرح آزمایشی صورت­گرفته، حدود دو الی سه هفته پس از تلقیح، برخی از ریزنمونه­ها متورم و در نهایت از محل زخم، ریشه‌­های کرک­دار سفید رنگ ظاهر شد (شکل 1-ب). جهت حذف باکتری R. rhizogenes، واکشت­های متوالی در محیط جامد انجام شد (شکل 1-ج). براساس نتایج تجزیه واریانس (جدول 1)، تفاوت معنی­داری بین دو سویه باکتری (A4 و LBA9402) (شکل 2) در سطح 5 % و دو نوع ریزنمونه برگ و ساقه (شکل 3) در سطح 1% برای صفت القای ریشه­های مویین کاندید مشاهده شد، همچنین اثر متقابل سویه باکتری در ریزنمونه، تفاوت معنی­داری نشان داد (شکل 4). سویه LBA9402 بالاترین میانگین فراوانی القای ریشه (33/23 %) نسبت به سویه A4 (33/18 %) و ریزنمونه برگ نیز بالاترین میانگین درصد القای ریشه (5/27 %) را نشان داد. همچنین نتایج صفت سرعت ظاهر­شدن ریشه نشان داد که میانگین ظهور ریشه در ریزنمونه برگ (14 روز) سریع­تر از میانگین ریزنمونه ساقه (16 روز) است (شکل 5)، اما برای این صفت بین دو سویه باکتری (شکل 6) تفاوت معنی­داری مشاهده نشد و به­طور میانگین 15 روز پس از تلقیح، ریشه­ها از محل زخم ظاهر شدند (شکل 7).

شکل 1. گیاهچه‌های 30 روزه درون­شیشه‌ای استبرق (الف)، ظهور ریشه در محل زخم ریزنمونه‌ برگ. فلش قرمز ظاهر شدن ریشه سفیدرنگ را نشان می­دهد (ب)، رشد ریشه بعد از چندین بار واکشت در محیط MS کامل (ج).

جدول 1. تجزیه و تحلیل واریانس اثر سویه باکتری و نوع ریزنمونه بر سرعت ظاهرشدن و القای ریشه در استبرق.

^*، ^** معنی‌داری در سطح 5% و 1% است.

شکل 2. اثر نوع ریزنمونه بر میزان القای ریشه در محیط‌کشت MS.
 L: ریزنمونه برگ، S: ریزنمونه ساقه.

شکل 3. اثر نوع سویه باکتری R. rhizogenes بر میزان القای ریشه در محیط کشت MS.
 L: سویه LBA9402، A: سویه A4

شکل 4. نمودار اثر متقابل نوع ریزنمونه و سویه باکتری R. rhizogenes بر میزان القای ریشه در محیط کشت MS.

AL: سویه A4 و ریزنمونه برگ، AS: سویه A4 و ریزنمونه ساقه، LL: سویه LBA9402 و ریزنمونه برگ، LS: سویه LBA9402 و ریزنمونه ساقه.

شکل 5. اثر نوع ریزنمونه بر زمان ظاهر شدن ریشه در محیط کشت MS.

 L: ریزنمونه برگ، S: ریزنمونه ساقه.

شکل 6. اثر نوع سویه باکتری R. rhizogenes بر زمان ظاهر شدن ریشه در محیط کشت MS.

L: سویه LBA9402، A: سویه .A4

شکل 7. اثر متقابل نوع ریزنمونه و سویه باکتری R. rhizogenes بر زمان ظاهر شدن ریشه در محیط کشت MS.

AL: سویه A4 و ریزنمونه برگ، AS: سویه A4 و ریزنمونه ساقه، LL: سویه LBA9402 و ریزنمونه برگ، LS: سویه LBA9402 و ریزنمونه ساقه.

4-4. تایید تراریختی ریشه‌های مویین

اگرچه ریخت­شناسی خاص و رشد با انشعابات جانبی انبوه ریشه‌های مویین القا شده توسط rhizogenes R. در محیط کشت فاقد هورمون، تا حدی نشان از درج T-DNA به ژنوم سلول‌های گیاهی و تراریختگی آنها است، اما ارزیابی ماهیت تراریختگی ریشه‌ها با آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) ضروری است. در این پژوهش ماهیت تراریختگی ریشه‌های مویین استبرق با آزمون PCR و استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن rolB، تأیید شد. DNA استخراج‌شده از ریشه‌های مویین استبرق، برای rolB محصول PCR مورد انتظار به اندازه 780 جفت­باز را تکثیر کرد، اما برای ریشه‌های شاهد (DNA ریشه طبیعی)، هیچگونه قطعه­ای از rolB تکثیر نشد (شکل 8-الف)؛ بنابراین ماهیت تراریختی ریشه‌های مویین در گیاه دارویی استبرق با استفاده از تکثیر قسمتی از ژن rolB تایید شد. همچنین هیچ محصول PCR مربوط به ژن virD به طول ۴۳۸ جفت­باز در لاین­های ریشه­مویین استبرق مشاهده نشد که نشان‌دهنده عدم وجود آلودگی به باکتری R. rhizogenes است (شکل 8-ب).

 شکل 8. محصولPCR ژن rolB (الف) و virD (ب). چاهک‌های 3-1: لاین­های ریشه­مویین کاندید جهت اثبات تراریختی ریشه­های مویین،

 4: DNA ژنومی از ریشه طبیعی استبرق به­عنوان کنترل منفی، 5: آب مقطر، 6 و 7: Ri-پلاسمید، M: نشانگر اندازه (100-3000 جفت­باز، کیاژن، ایران).

4-5. اندازه‌گیری رشد

بمنظور تکثیر ریشه­های مویین تاییدشده استبرق، کشت لاین منتخب (شکل 9-الف) در محیط­کشت مایع MS  حاوی gL^-1 30 ساکارزبا چگالی تلقیح gL^-1 33/33 انجام شد. با توجه به اینکه ریشه­های مویین بعد از واکشت به دلیل برش­خوردن دچار کندی رشد می­شوند، اندازه­گیری­ها، از روز هشتم پس از شروع آزمایش به فاصله زمانی چهار روز با استفاده از ترازوی دقیق با سه تکرار صورت گرفت. براساس نتایج اندازه‌گیری وزن تر و وزن خشک، منحنی رشد لاین منتخب ریشه­مویین استبرق برای دوره کشت 32 روزه رسم شد (شکل 10). بر اساس میانگین اندازه­گیری­شده، بیشترین میانگین وزن خشک و وزن تر ریشه­مویین به­ترتیب مربوط به روز 24­ام (g 01/0 ± 24/0) و 28­ام (g 03/0 ± 48/2) بود.

شکل 9. رشد لاین منتخب ریشه­مویین استبرق در محیط کشت مایع MS  بدون هورمون در روز 20 ام (الف)، ریشه‌های مویین قبل از عصاره­گیری (ب).

شکل 10. نمودار رشد ریشه­مویین استبرق با اندازه‌گیری وزن تر (سمت چپ) و وزن خشک (سمت راست).

4-6. محتوای فنول تام

نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل واریانس اندازه­گیری محتوای فنول تام در کشت‌های ریشه­مویین C. procera تحت تیمار دو الیسیتور با دو غلظت متفاوت در دو زمان مختلف نشان داد که تفاوت‌ معنی­داری (01/0 p <) بین گروه‌های تیماری مختلف وجود دارد (جدول 2). بر اساس نمودار مقایسه میانگین (شکل 11-الف)، می‌توان گفت که متیل­جاسمونات در غلظت­های µM 10 و 50 (به­ترتیب با µg GAE/g FW 82/2681 و µg GAE/g FW 15/2115) تأثیر بیشتری نسبت به کیتوزان در تحریک تولید ترکیبات فنولی در هر دو زمان (24 و 48 ساعت) دارد. به‌ویژه، در 24 ساعت اول، میزان تولید در حضور µM 10 متیل­جاسمونات بالاتر از سایر گروه­ها در طی این مدت زمان بود. با گذشت زمان (48 ساعت)، غلظت mgL^-1 150 کیتوزان (µg GAE/g FW 66/2073) تأثیر کمتری نشان داد که نشان‌دهنده اثرات طولانی‌مدت کیتوزان در مقایسه با µM 50 متیل­جاسمونات
 (µg GAE/g FW 42/2142) است؛ ولی در نهایت گروه تیمار شده با µM 10 متیل­جاسمونات بعد از گذشت 48 ساعت بالاترین میزان فنول تام (µg GAE/g FW 22/2927) را به خود اختصاص داد.

جدول 2. تجزیه و تحلیل واریانس اثر زمان و نوع الیسیتور بر محتوای تام فنول و فلاونوئید و فعالیت آنتی­اکسیدانی (DPPH) در عصاره ریشه‌های مویین استبرق.

^*، ^** معنی‌داری در سطح 5% و 1% است.

4-7. محتوای فلاونوئید تام

مطابق با نتایج جدول تجزیه واریانس (جدول 2) تفاوت‌های معنی‌داری در محتوای فلاونوئید تام بین گروه‌های تیمار مختلف وجود داشت (01/0 p <). بر این اساس در 24 ساعت اول، متیل­جاسمونات (µM 10) بالاترین مقدار محتوای فلاونوئید تام
(µg QE/ g FW 465/19720) را نشان داد که نسبت به دیگر گروه‌ها تفاوت قابل توجهی داشت. در همین مدت، کیتوزان
 ( mgL^-1100) نیز مقدار تولید قابل توجهی با µg QE/ g FW 4/15100 داشت، اما بیشتر از متیل­جاسمونات µM 50 (µg QE/ g FW 01/14293) و کیتوزان 150 (µg QE/ g FW 7/14382) بود. طی 48 ساعت، تفاوت‌ها افزایش یافته و مقادیر تولید در تمامی گروه‌ها به هم نزدیک‌تر شدند. به‌ویژه، کیتوزان mgL^-1 100 (µg QE/ g FW 10/12409) و متیل­جاسمونات µM 50
(µg QE/ g FW 47/14495) نتایج غیرمشابهی را به دست آوردند که نشان‌دهنده اثرات کندتر و پایدارتر این ترکیبات است (شکل 11-ب).

شکل 11. محتوای فنول (الف) و فلاونوئید (ب) تام در کشت­های ریشه­مویین استبرق تحت تیمار با الیستورهای کیتوزان و متیل­جاسمونات بعد از گذشت 24 و 48 ساعت از زمان اعمال تیمار (KIT100: کیتوزان (mgL^-1 100)، KIT150: کیتوزان (mgL^-1 150)، MJ10: متیل­جاسمونات (µM 10) و
MJ50: متیل­جاسمونات (µM 50)).

4-8. اندازه‌گیری فعالیت آنتی‌اکسیدانی

نتایج تجزیه و تحلیل واریانس (جدول 2) برای فعالیت آنتی‌اکسیدانی با استفاده از روش DPPH نشان‌دهنده تفاوت‌ معنی­دار بین گروه‌های مختلف تیمار شده است (01/0 p <). نتایج به‌دست‌آمده بعد از گذشت 24 و 48 ساعت نشان‌دهنده تأثیر متفاوت غلظت‌های کیتوزان و متیل­جاسمونات بر فعالیت آنتی‌اکسیدانی کل است. در مدت 24 ساعت، متیل­جاسمونات (µM 50) بالاترین مقدار فعالیت آنتی‌اکسیدانی یعنی 2/62 % نشان داد که نسبت به دیگر تیمارها به‌ویژه کیتوزان mgL^-1 100 (96/49 %) قابل توجه بود. این نشان‌دهنده اثر بیشتر متیل­جاسمونات نسبت به الیسیتور کیتوزان در مدت زمان مشابه است. در طی 48 ساعت، به‌طور کلی، تمامی تیمارها افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانی را تجربه کردند. طی این مدت، متیل­جاسمونات (µM 50) همچنان بالاترین میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی را با مقدار 14/68 % ثبت کرد که به وضوح بیشتر از کیتوزان mgL^-1 150 (62/56 %) و دیگر غلظت­های کیتوزان mgL^-1 100 (14/55 %) و متیل­جاسمونات µM 10 (04/67 %) بود (شکل 12).

شکل 12- فعالیت آنتی­اکسیدانی کل در عصاره حاصل از کشت­های ریشه­مویین استبرق تحت تیمار با الیستورهای کیتوزان و متیل­جاسمونات بعد از گذشت 24 و 48 ساعت از زمان اعمال تیمار. (KIT100: کیتوزان (mgL^-1 100)، KIT150: کیتوزان (mgL^-1 150)، MJ10: متیل­جاسمونات (µM 10) و
 MJ50: متیل­جاسمونات (µM 50)).

نتایج تحقیق حاضر با بررسی بهینه‌سازی سیستم القای ریشه­مویین در گیاه C. procera از طریق استفاده از سویه‌های مختلف باکتری R. rhizogenes انجام شد. براساس نتایج آزمایش­ها، پس از دو الی سه هفته از زمان تلقیح و پس از انجام واکشت‌های متوالی برای حذف باکتری، ریشه‌های مویین از برخی ریزنمونه‌ها در محل زخم ظاهر شدند. در این پژوهش، برای اولین بار سویه LBA9402 بالاترین میانگین فراوانی القای ریشه را نشان داد و ریزنمونه برگ نیز عملکرد بهتری در درصد القای ریشه از خود نشان داد. نتایج این تحقیق با نتایج سایر مطالعات مقایسه و مورد بررسی قرار گرفت. در پژوهش
 Adabavazeh et al. (2023) به بررسی بهینه‌سازی سیستم القای ریشه‌­مویین در گیاه C. procera پرداخته شده و تأثیر سه سویه مختلف R. rhizogenes (k599، A4 و ATCC 15834)، دو ریزنمونه گیاهی (ساقه و برگ) بر القای ریشه‌ مورد بررسی قرار گرفته است. نتایج آن‌ها نشان داد که غوطه‌وری ریزنمونه برگ در سوسپانسیون حاوی باکتری سویه A4 بالاترین نرخ القای ریشه را نشان داد که با نتایج پژوهش حاضر مغایرت داشت. با این حال، نتایج مربوط به نوع ریزنمونه برگ در این پژوهش با یافته‌های تحقیق فعلی تطابق داشت. در مطالعه Dardan & Jafari (2023)، تأثیر عوامل مختلف بر القای ریشه‌­مویین در گیاه C. procera مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آنها نشان داد که تنها در برخی از سویه‌های R. rhizogenes شامل A4، A7، A13، ATCC 15834، ATCC 11325 و K599 القای ریشه‌ موفقیت‌آمیز بود. از بین این سویه‌ها، سویه‌ K599 بهترین درصد القا را از خود نشان داد. همچنین نتایج آنها نشان داد که نوع ریزنمونه گیاهی (برگ و ساقه) تأثیر زیادی بر القای ریشه‌ دارد؛ به‌طوری‌که بالاترین درصد القای ریشه (50 %) در برگ‌های 18 روزه در زمان تماس 30 دقیقه‌ای با مایه تلقیح باکتری K599 به­دست آمد. علاوه­براین، مدت زمان مایه­کوبی (15 و 30 دقیقه) و سن اندام‌های گیاهی نیز بر میزان موفقیت­آمیز بودن القا تأثیرگذار بودند. در کل این یافته‌ها نشان می‌دهند که انتخاب سویه مناسب R. rhizogenes، نوع اندام گیاهی، زمان تلقیح و محیط کشت می‌توانند تأثیرات قابل‌توجهی بر موفقیت در القای ریشه‌ در C. procera داشته باشند.

ریشه­های مویین توسط آلوده­شدن بافت گیاهی با باکتری خاکزی و گرم­منفی rhizogenes R. ایجاد می­شوند. در واقع باکتری در پاسخ به ترشح ترکیباتی مانند استوسیرینگون از محل زخم در گیاه میزبان، از پلاسمید القا­کننده ریشه (Ri) خود ناحیه­ای انتقالی با نام T-DNA که حاوی ژن­های rol و ژن­های بیوسنتز ترکیبات اوپین­^[6] است را با کمک آنزیم­های تولیدشده توسط ژن­های بیماری­زایی vir ^[7] و chv ^[8] که خارج از ناحیه T-DNA هستند در ژنوم گیاه میزبان درج می­کند (Biswas et al., 2023; Zhu et al., 2024). پژوهشگران معتقدند که در میان ژن­های rol موجود در rhizogenes R.، rolB نقش ضروری در القای ریشه­مویین دارد در­حالی­که ژن­های rolC، rolA و rolD در القای ریشه­های مویین نقش جانبی دارند. ژن rolB برای القای ریشه­مویین به­طور کامل ضروری بوده و حتی زمانی­که این ژن به تنهایی بیان شود، می‌تواند تولید ریشه­مویین قابل توجهی داشته باشد (Mauro & Bettini, 2021; Shvets et al., 2024). این واقعیت که نه تمام سویه‌های باکتری R. rhizogenes قادر به انتقال ژن‌های القای ریشه­مویین هستند و نه تمامی گیاهان قابلیت پذیرش ژن بیگانه از این باکتری را دارند، دلایل شناخته­شده­ای ندارد. این پدیده را می‌توان به اثرات متقابل بین گیاه و پاتوژن نسبت داد، به این معنا که یک رقم گیاهی ممکن است به نژادهای مختلف یک گونه بیماری‌زا واکنش‌های متفاوتی نشان دهد. در واقع ظرفیت سویه‌های مختلف باکتری R. rhizogenes به ساختار ژن‌های vir آن‌ها وابسته است (Yazdanpanah et al., 2017).

یافته‌های ما نشان می‌دهد که تیمار متیل­جاسمونات موجب افزایش معنی‌دار در محتوای تام فنول و فلاونوئید شده است. این نتایج با گزارش‌های قبلی هم‌راستا است که نشان داده‌اند متیل­جاسمونات می‌تواند به‌عنوان یک الیسیتور زیستی، با ایجاد تنش اکسیداتیو و افزایش گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)، پاسخ‌های دفاعی گیاه را تحریک کرده و تولید متابولیت‌های ثانویه از جمله ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی را افزایش دهد (Nabi et al., 2021). در این مطالعه، فعالیت آنتی‌اکسیدانی در کشت‌های ریشه­مویین استبرق با استفاده از روش اندازه­گیری DPPH ارزیابی شد. فعالیت آنتی‌اکسیدانی گیاهان به‌عنوان یکی از ویژگی‌های کلیدی در مقابله با تنش‌های محیطی مورد توجه قرار دارد. در مطالعه (Adabavazeh et al., 2022) بیشترین میزان فلاونوئید با افزایش 165 % در ریشه‌های مویین استبرق تحت تیمارهای هم­زمان mgL^-1 100 نانوذره Fe₃O₄ و µM 10 اسیدسالیسیلیک گزارش شده است. مطالعات متعدد نشان داده‌اند که متابولیسم ترکیبات فلاونوئید و فنول می‌تواند تحت تأثیر تنش‌های زیستی و غیرزیستی فعال شود. ترکیبات فنولی به عنوان بازیگران اصلی در سازوکار‌های دفاعی گیاهان عمل می‌کنند و اثرات چندوجهی آن‌ها به انعطاف‌پذیری گیاهان در برابر چالش‌های محیطی کمک می‌کند. این ترکیبات، خواص آنتی‌اکسیدانی، ضدمیکروبی و ساختاری دارند و فیتوالکسین‌های فنولی از فنیل­پروپانوئیدها برای مقابله با عوامل بیماری‌زا مفید هستند. به­طور کلی، ترکیبات فنولی در تنظیم مسیرهای سیگنال‌دهی و پاسخ‌های تنش گیاهی دخالت دارند (Adabavazeh et al., 2022; Saini et al., 2024).

درک جامع از نقش ترکیبات فنولی در زیست­شناسی گیاهی برای بهبود انعطاف‌پذیری گیاهان در شرایط محیطی پویا ضروری است. الیسیتورهای کیتوزان و متیل­جاسمونات، به‌عنوان محرک‌های زیستی شناخته می‌شوند که قادر به تحریک تولید ترکیبات فنولی در گیاهان هستند. متیل­جاسمونات و کیتوزان به‌طور خاص می‌توانند به‌عنوان الیسیتور عمل کرده و با افزایش تولید ترکیبات فنولی فرآیندهای متابولیکی گیاهان را تغییر دهند (Mukarram et al., 2023; Wang et al., 2021). در نتایج مطالعه Adabavazeh et al. (2022) ذکر شده است که تیمار ریشه­های مویین استبرق با mgL^-1 150 و 200 نانوذره Fe₃O₄ به­همراه µM 10 اسیدسالیسیلیک (SA) باعث افزایش محتوای فنولی و تاثیر بر فعالیت آنزیم­های پاداکسنده شد. علاوه­براین، این اثر به­طور قابل توجهی در ریشه‌های مویین که بطور همزمان تحت تیمار نانوذرات Fe₃O₄ و SA قرار گرفته بودند، نسبت به کشت­های ریشه­مویین که به­طور جداگانه تحت این تیمارها قرار داشتند، بیشتر بود (Adabavazeh et al., 2023). به­طور کلی، نتایج پژوهش حاضر نشان داد که متیل­جاسمونات بالاترین میزان تولید فنول و فلاونوئید تام را در مقایسه با سایر تیمارها ایجاد کرد. این نشان‌دهنده اثر فوری و قوی این ترکیب در تحریک تولید ترکیبات فنولی است. هرچند متیل­جاسمونات در ابتدا تأثیر قوی‌تری بر تولید فنول‌ها نشان داد، اما کیتوزان در طول زمان ممکن است تأثیر بیشتری از خود نشان دهد.

5. نتیجه‌گیری

با توجه به نقش حیاتی متابولیت‌های گیاهان دارویی و نیاز فزاینده به این ترکیبات، پژوهشگران در حال بررسی روش‌های نوآورانه برای افزایش میزان تولید آن‌ها هستند. استبرق یکی از گیاهان دارویی مهم در ایران است. هدف از انجام این پژوهش، القا و کشت ریشه‌­مویین استبرق‎ به‌منظور ارزیابی منحنی رشد و کاربرد الیسیتور جهت تولید ترکیبات آنتی­اکسیدان این گیاه مهم بود. همچنین، اثر غلظت­های مختلف دو الیستور زیستی و غیر­زیستی کیتوزان (mgL^-1 150 و 100) و متیل­جاسمونات (µM 50 و 10) برای اولین بار در این پژوهش روی ریشه­های مویین استبرق بررسی شد. به­طور کلی نتایج نشان داد تیمار با متیل­جاسمونات منجر به بالاترین میزان تولید محتوای فنول و فلاونوئید تام شد که نشان‌دهنده تأثیر مثبت این تیمار بر افزایش فعالیت آنتی­اکسیدانی در عصاره ریشه­مویین گیاه استبرق بود. این یافته‌ها پیش‌نیازی مهم برای آزمایش‌های آتی در زمینه کشت ریشه‌های مویین با هدف تولید متابولیت‌های ثانویه در این گیاه دارویی ارزشمند هستند.

6. منابع

Adabavazeh, F., Pourseyedi, S., Nadernejad, N., & Razavizadeh, R. (2023). Hairy root induction in Calotropis procera and optimization of its phytochemical characteristics by elicitors. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 155, 567-580.

Adabavazeh, F., Pourseyedi, S., Nadernejad, N., Razavizadeh, R., & Mozafari, H. (2022). Evaluation of synthesized magnetic nanoparticles and salicylic acid effects on improvement of antioxidant properties and essential oils of Calotropis procera hairy roots and seedlings. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 151, 133-148.

Alcalde, M.A., Perez-Matas, E., Escrich, A., Cusido, R.M., Palazon, J., & Bonfill, M. (2022). Biotic elicitors in adventitious and hairy root cultures: A review from 2010 to 2022. Molecules, 27, 5253.

Al-Rowaily, S.L., Abd-ElGawad, A.M., Assaeed, A.M., Elgamal, A.M., Gendy, A.E.N.G.E., Mohamed, T.A., Dar, B.A., Mohamed, T.K., & Elshamy, A.I. (2020). Essential oil of Calotropis procera: Comparative chemical profiles, antimicrobial activity, and allelopathic potential on weeds. Molecules, 25, 5203.

Avazzadeh, A.M., Saeidi, H., & Bagheri, A. (2018). Leaf morphological study of Calotropis procera (Aiton) R.br. in Iran. Paper presented at the 20th National and 8th International Congress on Biology of Iran, Maragheh. https://civilica.com/doc/850409.

Biswas, D., Chakraborty, A., Mukherjee, S., & Ghosh, B. (2023). Hairy root culture: A potent method for improved secondary metabolite production of solanaceous plants. Frontiers in Plant Science, 14, 1197555.

Chaachouay, N., & Zidane, L. (2024). Plant-derived natural products: A source for drug discovery and development. Drugs and Drug Candidates, 3, 184-207.

Coopoosamy, R., Singh, K., Naidoo, K., & Nadasan, D.S. (2023). The role of phytomedicine: Bridging the gap between the past, present, and future. Journal of Medicinal Plants for Economic Development, 7, 7.

Dardan, E., & Jafari, M. (2023). Optimization of induction, culture conditions and phytochemical analysis of hairy roots in the medicinal plant giant milkweed (Calotropis procera). Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology), 39, 2383-2592.

Djerdjouri, A., Abbad, M., Boumrah, Y., Malik, S., Makhzoum, A., & Lakhdar, K. (2024). Tapping the potential of Calotropis procera hairy roots for cardiac glycosides production and their identification using UHPLC/QTOF-MS. 3, Biotech, 14, 199.

El-Bakry, A.A., Safia, M.G., & Abdrabou, H.A.A. (2011). Production of cardiac glycosides from Calotropis procera by cell suspension cultures. Journal of Applied Sciences Research, 1375-1385.

Farooq, U., Nisar, S., Merzaia, A.B., & Azeem, M.W. (2017). Isolation of bioactive components from Calotropis procera plant latex: A review. International Journal of Chemical and Biochemical Science, 11, 95-101.

Gutierrez-Valdes, N., Häkkinen, S.T., Lemasson, C., Guillet, M., Oksman-Caldentey, K.M., Ritala, A., & Cardon, F. (2020). Hairy root cultures: A versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science, 11.

Hidangmayum, A., Dwivedi, P., Katiyar, D., & Hemantaranjan, A. (2019). Application of chitosan on plant responses with special reference to abiotic stress. Physiology and Molecular Biology of Plants, 25, 313-326.

Jalota, K., Sharma, V., Agarwal, C., & Jindal, S. (2024). Eco-friendly approaches to phytochemical production: Elicitation and beyond. Natural Products and Bioprospecting, 14, 5.

Jeyasri, R., Muthuramalingam, P., Karthick, K., Shin, H., Choi, S.H., & Ramesh, M. (2023). Methyl jasmonate and salicylic acid as powerful elicitors for enhancing the production of secondary metabolites in medicinal plants: An updated review. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 153, 447-458.

Kaur, A., Batish, D.R., Kaur, S., & Chauhan, B.S. (2021). An overview of the characteristics and potential of Calotropis procera from botanical, ecological, and economic perspectives. Frontiers in Plant Science, 12, 1-13.

Khan, S., Qureshi, M. I., Alam, T., & Abdin, M. (2007). Protocol for isolation of genomic DNA from dry and fresh roots of medicinal plants suitable for RAPD and restriction digestion. African Journal of Biotechnology, 6, 175.

Kumar, S., Gupta, A., & Pandey, A.K. (2013). Calotropis procera root extract has the capability to combat free radical mediated damage. International Scholarly Research Notices, 1, 691372.

Kyada, A., Rahamathulla, M., Santani, D., Vadia, N., Baldaniya, L., Rana, M., Muqtader Ahmed, M., Farhana, S.A., & Pasha, I. (2023). Phytochemical analysis, in vitro free radical scavenging, and ldl protective effects of different solvent fractions of Calotropis procera (R.) br. root bark extract. Journal of Food Biochemistry, 6689595.

Mauro, M.L., & Bettini, P.P. (2021). Agrobacterium rhizogenes rolB oncogene: An intriguing player for many roles. Plant Physiology and Biochemistry, 165, 10-18.

Meda, A., Lamien, C.E., Romito, M., Millogo, J., & Nacoulma, O.G. (2005). Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their radical scavenging activity. Food Chemistry, 91, 571-577.

Mehmood, T., Arshad, H., Nawaz, S., Ullah, A., Hafeez, A., Anwar, F., Ahmad, M.M., & Iqbal, M. (2020). Pharmaceutical potential and phenolics profiling of leaves and bark of Calotropis procera in relation to extraction solvents. Pharmaceutical Chemistry Journal, 54, 631-641.

Mukarram, M., Ali, J., Dadkhah-Aghdash, H., Kurjak, D., Kačík, F., & Ďurkovič, J. (2023). Chitosan-induced biotic stress tolerance and crosstalk with phytohormones, antioxidants, and other signalling molecules. Frontiers in Plant Science, 14, 1-14.

Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15, 473-497.

Murthy, H.N., Lee, E.J., & Paek, K.Y. (2014). Production of secondary metabolites from cell and organ cultures: Strategies and approaches for biomass improvement and metabolite accumulation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 118, 1-16.

Nabi, N., Singh, S., & Saffeullah, P. (2021). Responses of in vitro cell cultures to elicitation: Regulatory role of jasmonic acid and methyl jasmonate: A review. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 57, 341-355.

Nofal, A.M., Hamouda, R.A., Rizk, A., El-Rahman, M.A., Takla, A.K., Galal, H., Alqahtani, M.D., Alharbi, B.M., Elkelish, A., & Shaheen, S. (2024). Polyphenols-rich extract of Calotropis procera alone and in combination with Trichoderma culture filtrate for biocontrol of Cantaloupe wilt and root rot fungi. Molecules, 29, 139-158.

Oloumi, H. (2014). Phytochemistry and ethno-pharmaceutics of Calotropis procera. Journal of Ethno-Pharmaceutical Products, 1, 1-8.

Pandey, A., Swarnkar, V., Pandey, T., Srivastava, P., Kanojiya, S., Mishra, D.K., & Tripathi, V. (2016). Transcriptome and metabolite analysis reveal candidate genes of the cardiac glycoside biosynthetic pathway from Calotropis procera. Scientific reports, 6, 34464.

Pellis, A., Guebitz, G.M., & Nyanhongo, G.S. (2022). Chitosan: Sources, processing and modification techniques. Gels, 8.

Rogowska, A., & Szakiel, A. (2021). Enhancement of phytosterol and triterpenoid production in plant hairy root cultures—simultaneous stimulation or competition? Plants, 10, 20-28.

Saini, N., Anmol, A., Kumar, S., Wani, A.W., Bakshi, M., & Dhiman, Z. (2024). Exploring phenolic compounds as natural stress alleviators in plants: A comprehensive review. Physiological and Molecular Plant Pathology, 133, 102383.

Sharafi, A., Sohi, H.H., Mousavi, A., Azadi, P., Razavi, K., & Ntui, V.O. (2013). A reliable and efficient protocol for inducing hairy roots in Papaver bracteatum. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 113, 1-9.

Seiber, J.N., Nelson, C.J., & Lee, S.M. (1982). Cardenolides in the latex and leaves of seven Asclepias species and Calotropis procera. Phytochemistry, 21, 2343-2348.

Shvets, D.Y., Berezhneva, Z., Musin, K.G., & Kuluev, B. (2024). Effect of rol genes of the A4, 15834, and K599 strains of Agrobacterium rhizogenes on root growth and states of the antioxidant systems of transgenic tobacco plants subjected to abiotic stress. Russian Journal of Plant Physiology, 71, 165.

Singh, P., Pandey, A., Bilung, C.J., Jeet, A., Nimoriya, R., Nandan, S., Kanojia, S., Mishra, D.K., & Tripathi, V. (2024). Identification of methyl jasmonate-induced cardiac glycosides and related biosynthetic transcripts from callus culture of Calotropis gigantea using transcriptome and metabolite profiling. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 60, 575-587.

Soland, S., & Laima, S. (1999). Phenolics and cold tolerance of Brassica napus. Plant Agriculture, 1, 1-5.

Stepanova, A.Y., Malunova, M.V., Gladkov, E.A., Evsyukov, S.V., Tereshonok, D.V., & Solov’eva, A.I. (2022). Collection of hairy roots as a basis for fundamental and applied research. Molecules, 27, 8040.

Wang, Y., Mostafa, S., Zeng, W., & Jin, B. (2021). Function and mechanism of jasmonic acid in plant responses to abiotic and biotic stresses. International Journal of Molecular Sciences, 22, 8568.

Wu, Y., & Wang, D. (2009). A new class of natural glycopeptides with sugar moiety-dependent antioxidant activities derived from Ganoderma lucidum fruiting bodies. Journal of Proteome Research, 8, 436-442.

Yazdanpanah, M., Sedaghati, E., Khodygan, P., Alaei, H., & Raghami, M. (2017). Optimizing of carrot hairy root induction and stabilization for monoxenic culture of arbuscular mycorrhizal fungi. Iranian Journal of Field Crop Science, 48, 945-959. (In Persian).

Zhu, Y., Zhu, X., Wen, Y., Wang, L., Wang, Y., Liao, C., Zhao, M., Li, T., Liu, D., & Li, B. (2024). Plant hairy roots: Induction, applications, limitations and prospects. Industrial Crops and Products, 219, 119104.

1. Proceraside A
2. Transfer-DNA
3. 3. Polymerization
4. 4. Luria-Bertani
5. 2, 2‐diphenyl‐1‐picrylhydrazyl
6. Opines
7. Virulence
8. Chromosomal virulence