مقدمه

بیماری‌های منتقله از غذا، بار اجتماعی و اقتصادی قابل‌توجهی ایجاد می‌کنند و خطرات بسیاری برای سلامت انسان به همراه دارند (1) مصرف غذای آلوده یکی از شایع‌ترین راه‌های ابتلا به سالمونلاهای غیرتیفوئیدی، از‌جمله سالمونلا انتریتیدیس است (2).

 سالانه حدود 153 میلیون مورد گاستروانتریت و 57000 مرگ در سطح جهان به سالمونلای غیرتیفوئیدی نسبت داده می‌شود. سالمونلا تیفی موریوم و سالمونلا انترتیدیس دو سروتیپ سالمونلا می‌باشند که بیشترین موارد گاستروانتریت را در انسان در سراسر جهان ایجاد می‌کنند (3). تقریباً 95 درصد از موارد سالمونلوز انسانی با مصرف غذاهای مختلف، مانند گوشت قرمز، گوشت طیور، تخم‌مرغ، شیر، غذاهای دریایی و محصولات تازه مرتبط است (4).

گوشت مرغ یکی از منابع شایع این آلودگی است و اخیراً توجهات زیادی به شناسایی میزان حضور سالمونلا در مراحل مختلف بسته‌بندی و فرآوری گوشت مرغ معطوف شده است (5). محصولات طیور به‌عنوان یکی از منابع مهم پروتئین ارزان‌قیمت، به‌دلیل مقرون‌به‌صرفه بودن نسبت به گوشت قرمز، از محبوبیت بالایی برخوردار است (6). در سال‌های اخیر صنعت طیور به‌دلیل آلودگی‌های میکروبی شدید و ازطرف‌دیگر تقاضای مصرف‌کنندگان بر عدم استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها با چالش‌های فراوانی روبه‌رو شده است (7). گوشت مرغ به‌دلیل فسادپذیری بالا و آلودگی متقاطع بین لاشه‌های مرغ و محیط تولید، ماندگاری نسبتاً کوتاهی دارد (8). بین سال‌های 1998 تا 2017، 298 مورد شیوع سالمونلوز مرتبط با مصرف مرغ گزارش شده است که به 881/7 عفونت و 4 مرگ منجر شد (9).

برای جلوگیری از آلودگی سالمونلا انتریتیدیس در غذاها و در‌نتیجه ارتقای ایمنی غذایی، روش‌های مختلفی مبتنی بر تکنیک‌های فیزیکی و شیمیایی تدوین شده‌اند. با‌این‌حال این روش‌ها معایبی، مانند اثرات ماتریکس غذایی، باقی‌مانده مواد شیمیایی و تأثیر بر طعم، عطر و بافت دارند که همگی بر کیفیت غذا اثر می‌گذارند (10). کنترل‌کننده‌های زیستی در چنین شرایطی به‌عنوان یک استراتژی عملی برای رفع این مشکلات مورد توجه قرار گرفته‌اند و علاقه فزاینده‌ای به استفاده از باکتریوفاژها به‌عنوان عوامل کنترل زیستی برای حذف مؤثر باکتری‌های مضر از غذا بدون تغییر کیفیت غذا در میان محققین شکل گرفته است (11).

باکتریوفاژها ویروس‌های باکتریایی و متنوع‌ترین و فراوان‌ترین شکل حیات زیستی را تشکیل می‌دهند. فاژها به‌دلیل وجود فراگیر، ویژگی اختصاصی و اثر باکتری‌کشی، به‌عنوان عوامل کنترل زیستی نویدبخش برای کنترل پاتوژن‌های منتقله از غذا مطرح شده‌اند (12). در چند سال گذشته شناخت مزایای فاژها به‌ویژه توانایی آن‌ها در تکثیر گسترده با استفاده از یک میزبان، افزایش یافته است. علاوه‌بر‌این فاژها به‌طور‌کلی تأثیر حداقلی بر اکولوژی میکروبی دارند و به‌عنوان موجودات نسبتاً ایمن در نظر گرفته می‌شوند. اختصاصیت فاژها‌ به شکل‌گیری مطالعات گسترده‌ای در راستای رسیدن به درک تعاملات میزبان ـ فاژ، روش‌های گسترش دامنه میزبانی و تأثیر آن بر کنترل زیستی منجر شده است (13).

در مطالعه حاضر، هدف از جداسازی فاژ بومی تمرکز بر استفاده بالقوه از فاژها برای کنترل زیستی سالمونلا انتریتیدیس به‌عنوان پاتوژن‌های رایج در گوشت مرغ خام بوده است. مطالعه حاضر برای پر کردن شکاف مهمی در جداسازی و شناسایی فاژهای بومی کشور و درک بیشتر پتانسیل فاژها در حوزه ایمنی غذا طراحی شده است.

 مواد و روش کار

سویه‌های باکتریایی و شرایط کشت: سویه‌های باکتریایی مورد‌استفاده در مطالعه حاضر در جدول ۱ نشان داده شده‌اند. سالمونلا انتریتیدیس، سالمونلا تیفی موریوم، اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس از کلکسیون باکتریایی دانشکدهدامپزشکی دانشگاه تهران تهیه شد. همه سویه‌ها در محیط کشت TSA (Quelab,Canada) در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد کشت داده شدند. کشت‌های تازه با گرمخانه‌گذاری کلنی‌های تک در محیط کشت لوریا ـ برتانی (‌LB‌) (Quelab,Canada) و نوترینت براث (‌Merck, Germany) در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد با تکان دادن در ۱۳۰ دور در دقیقه به‌مدت 1 شب تهیه شدند (14).

جداسازی، خالص‌سازی و تکثیر: تعداد 20 عدد نمونه 50 ‌میلی‌لیتری از آب فاضلاب کشتارگاه صنعتی طیور در شهر تهران به‌عنوان منابع اولیه برای جداسازی فاژ تهیه شد. به هر نمونه‌، 100 میکرولیتر سالمونلا انتریتیدیس تلقیح شد و با 100 میلی‌لیتر LB براث تکمیل شده با 10 میلی‌مولار منیزیم سولفات (قطران شیمی، ایران)، در یک کیسه استوماکر استریل همگن و به‌مدت 1 شب در 37 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شد. پس از آن‌، 10 میلی‌لیتر از کشت، در 12000 دور به‌مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ گردید و مایع رویی از‌طریق یک فیلتر غشایی (Membrane Solution,USA) با اندازه منافذ 45/0 میکرون فیلتر شد تا فاژ لیز‌شده خام به دست آید (15). بررسی نمونه‌های اخذ‌شده تا زمان جداسازی باکتریوفاژ ادامه یافت.

برای جداسازی فاژ لیتیک، 100 میکرو لیتر فاژ لیز‌شده خام به‌صورت متوالی در بافر منیزیم سالین (SM) رقیق شد و با 100 میکرولیتر از هر‌کدام از سویه‌های میزبان در 4 میلی‌لیتر آگار مذاب نوترینت (Merck, Germany) ترکیب گردید. سپس مخلوط روی TSA (‌Quelab,Canada) کشت داده و خالص‌سازی شد. محیط آگار دولایه به‌مدت 1 شب در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری گردید. در روز بعد، یک پلاک تک برداشته شد و دوباره در بافر SM معلق گشت تا سوسپانسیون فاژ تولید شود. سوسپانسیون به‌صورت سریالی با بافر  SM رقیق و با میزبان مربوطه مواجهه داده و روی صفحات TSA ریخته شد و 1 شب گرمخانه‌گذاری در دمای 37 درجه سانتی‌گراد برای تولید یک پلاک تک انجام گرفت. این فرایندها 5 بار تکرار گردید تا از خلوص فاژها اطمینان حاصل شود (15).

به‌منظور تولید ذخایر با تیتر بالا برای آزمایش‌های بیشتر، فاژهای جدا‌شده با میزبان اصلی خود تکثیر شدند. 1 میلی‌لیتر سوسپانسیون فاژ با 3 میلی‌لیتر کشت میزبان در فاز نمایی مخلوط شد و 1 شب در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری صورت گرفت. پس از آن، مخلوط در 12000 دور به‌مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد و مایع رویی از‌طریق فیلتر غشایی با اندازه منافذ 22/0 میکرومتر (‌Membrane Solution, USA) برای به دست آوردن استوک فاژ فیلتر شد. سپس استوک فاژ به‌صورت متوالی در بافر SM رقیق گردید. 100 میکرولیتر از رقت تهیه‌شده با 100 میکرولیتر میزبان باکتریایی درون 4 میلی‌لیتر آگار مذاب مخلوط شد. مخلوط بر روی پلیت TSA ریخته و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 1 شب گرمخانه‌گذاری شد. تیتر فاژ استوک به‌صورت تعداد پلاک در میلی‌لیتر (PFU/میلی‌لیتر) تعیین شد (15).

شناسایی ویژگی‌های فاژ (میکروسکوپ الکترونی عبوری) (TEM): مورفولوژی فاژ با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) (LEO 906 E TEM, ZEISS,Germany)  در ولتاژ شتاب 10۰ کیلوولت مشاهده شد. به‌طور خلاصه، ۱۰ میکرولیتر از فاژ خالص‌شده با غلظت تقریبی 10¹⁰×2‌ PFU / میلی‌لیتر روی شبکه‌های پوشیده‌شده با کربن ریخته شد و با ۲ درصد اورانیل استات  (Merck, Germany) رنگ‌آمیزی منفی شد. تصاویر فاژ با بزرگ‌نمایی ×60000 گرفته شدند (16).

دامنه میزبانی‌: دامنه میزبانی فاژهای خالص‌شده با آزمون لکه‌گذاری بر روی 20 جدایه سالمونلا انتریتیدیس تعیین شد (17). 10 میکرولیتر از فاژ (۱0⁸ PFU / میلی‌لیتر) روی سطح کشت چمنی کشت باکتری در پلیت ریخته شد و سپس به‌مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. تشکیل پلاک‌ها به‌صورت بصری تأیید و فعالیت لیتیک علیه هر باکتری بر‌اساس شفافیت پلاک تعیین شد (18). علاوه‌بر‌این بر روی 10 جدایه سالمونلا تیفی موریوم و 5 جدایه اشریشیا کلی و 2 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس نیز این تست جهت تعیین اختصاصیت انجام گرفت.

ضریب تعدد عفونت بهینه ‌(MOI): برای تعیین MOI بهینه در محدوده (PFU/CFU) 10³ - ^3-10 ، باکتری‌های میزبان در فاز میانی لگاریتمی با حجم برابر فاژ خالص‌شده (1۰۰ میکرولیتر) در محیط LB آلوده شدند و در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد با تکان دادن در ۱5۰ دور در دقیقه به‌مدت 5 ساعت انکوبه شدند. پس از سانتریفیوژ، قسمت رویی توسط فیلتر 22/0 میکرون فیلتر شد و سپس به‌صورت مناسب رقیق شد تا تیتر فاژ با روش آگار دولایه بررسی شود. MOI با بالاترین تیتر به‌عنوان MOI بهینه در نظر گرفته و برای آزمایش‌های بعدی استفاده شد (19).

فعالیت لیتیک: اثرات ضدباکتریایی باکتریوفاژها با ظرفیت لیتیک آن‌ها علیه سالمونلا انتریتیدیس ارزیابی شد. این آزمایش در یک صفحه میکروپلیت 96 چاهکی ته صاف انجام شد. هر چاه شامل ۱۰۰ میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی رقیق‌شده (۱۰5 CFU / میلی‌لیتر) و فاژ با ضریب عفونت (MOI) برابر با 01/0، 1/0 و 10 بود و محیط LB به‌عنوان کنترل منفی استفاده شد. ظرفیت لیتیک با پایش رشد باکتری میزبان (OD₆₀₀) طی 12 ساعت انکوباسیون در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد با استفاده از دستگاه میکروپلیت ریدر (‌Stat fax-2100,USA) تعیین شد (20).

آزمایش کارایی جذب: بر‌اساس MOI بهینه، سوسپانسیون باکتری میزبان (۵ میلی‌لیتر) با حجم برابر فاژ آلوده شد. سپس مخلوط در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد با تکان دادن در ۱۶۰ دور در دقیقه به‌مدت ۲۴ دقیقه انکوبه شد و هر ۲ دقیقه ۳۰۰ میکرولیتر از مخلوط برداشته شد و در حمام یخ به‌مدت ۳۰ ثانیه متوقف شد. سپس، مخلوط در 9000 دور در دقیقه به‌مدت ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ شد و تیتر فاژ سوپرناتانت با روش آگار دولایه تعیین شد (21). کارایی جذب به‌صورت فرمول شماره 1 محاسبه شد:

کارایی جذب (درصد) = (تیتر اولیه فاژ - تیتر آزمایشی فاژ) / تیتر اولیه فاژ × ۱۰۰   .1

آزمایش منحنی رشد یک‌مرحله‌ای: بررسی رشد یک‌مرحله‌ای فاژ اختصاصی سالمونلا انتریتیدیس طبق پروتکل توصیف‌شده توسط Hong و همکاران در سال 2014 با برخی تغییرات انجام شد (22). استوک فاژ رقیق‌شده حاوی 10³ PFU / میلی‌لیتر با میزبان باکتریایی حاوی‌ 10⁵ CFU / میلی‌لیتر مخلوط شد تا تعدد عفونت (MOI) 01/0 به دست آید. مخلوط در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در یک حمام آب به‌مدت 10 دقیقه گرمخانه‌گذاری شد تا امکان جذب فاژها فراهم شود و سپس در دور 10000 به‌مدت 30 ثانیه در دمای اتاق سانتریفیوژ انجام شد. گلوله حاوی فاژهای متصل به سلول‌های میزبان باکتریایی مجدداً در 10 میلی‌لیتر براث LB حل شد و سپس سوسپانسیون در حمام آب در دمای 37 درجه سانتی‌گراد با تکان دادن مداوم نگهداری گردید‌. بخشی از نمونه (100 میکرولیتر) برداشته شد و در دو نسخه با فاصله 10 دقیقه به‌مدت 90 دقیقه تحت آزمایش پلاک قرار گرفتند. دوره نهفته به‌عنوان دوره زمانی بین جذب فاژ و اولین رهاسازی نتایج فاژ تعیین شد‌. اندازه انفجار به‌عنوان نسبت تعداد نتایج فاژ آزاد‌شده به سلول‌های میزبان باکتریایی آلوده تخمین زده شد (23).

تحمل دمایی باکتریوفاژ: در این آزمایش، پایداری دمایی باکتریوفاژ در دماهای مختلف (18- تا 90 درجه سانتی‌گراد) بررسی شد. به‌طور خاص، 100 میکرولیتر از محلول باکتریوفاژ با تیتر 10⁸ PFU / میلی‌لیتر به 900 میکرولیتر بافر PBS (1×) اضافه شد و در دماهای مختلف (18-، 0، 4، 25، 37، 50، 60، 70، 80 و 90 درجه سانتی‌گراد) به‌مدت 1 ساعت انکوبه شد. سپس رقیق‌سازی گرادیان انجام شد و تیتر باکتریوفاژ با روش صفحه آگار دولایه تعیین شد. این آزمایش 3 بار تکرار شد (24).

تحمل pH باکتریوفاژ: در این آزمایش، تحمل pH باکتریوفاژ در مقادیر مختلف pH (1 تا 12) بررسی شد. پیش از آزمایش، pH محلول بافر PBS (1×) با استفاده از HCl و NaOH تنظیم شد. سپس 100 میکرولیتر از محلول 10⁸ PFU / میلی‌لیتر باکتریوفاژ به 900 میکرولیتر بافر PBS با pHهای مختلف اضافه شد و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 1 ساعت انکوبه شد. پس از آن، رقیق‌سازی گرادیان انجام شد و تیتر باکتریوفاژ با روش صفحه آگار دولایه تعیین شد. این آزمایش 3 بار تکرار شد (25).

درمان پیشگیرانه روی گوشت سینه مرغ: نمونه‌های گوشت سینه مرغ تازه (60 گرمی) با پرتودهی UV استریل شدند و فاژها در نسبت عفونت بهینه 01/0 پیش از تلقیح باکتری اعمال و سپس نمونه‌ها با سالمونلا انتریتیدیس (5 لگاریتم CFU / گرم) تلقیح در دمای 4 و 25 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. تعداد باکتری‌ها به‌مدت 6 ساعت با فواصل 1 ساعته و در ساعت 24 با هموژن‌سازی 10 گرم از نمونه‌ها در 90 میلی‌لیتر آب پپتونه استریل، رقیق‌سازی سریالی و کشت روی TSA تعیین شد. شاهدهای مثبت و منفی در نظر گرفته شدند و هر نمونه در 3 تکرار آزمایش شد (26).

درمان اصلاحی روی گوشت سینه مرغ: برای درمان اصلاحی، نمونه‌های گوشت سینه مرغ ابتدا با سالمونلا انتریتیدیس (5 لگاریتم CFU / گرم) تلقیح و در دمای 4 و 25 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 1 ساعت نگهداری شدند. سپس فاژها در نسبت عفونت بهینه 01/0 اعمال شدند و تعداد باکتری‌ها به‌مدت 6 ساعت با فواصل 1 ساعته و در ساعت 24 مطابق روش ذکر‌شده‌، اندازه‌گیری شد. شاهدهای مثبت و منفی در نظر گرفته شدند و هر نمونه در 3 تکرار آزمایش شد (26).

تجزیه‌و‌تحلیل آماری: همه آزمایش‌ها در 3 تکرار انجام شدند. نتایج به‌صورت میانگین±انحراف‌معیار بیان شدند. داده‌ها به مقادیر لگاریتمی تبدیل شدند و تحلیل واریانس یک‌طرفه (ANOVA) به دنبال تست توکی (Tukey's Test) با استفاده از نرم‌افزار آماری IBM SPSS  نسخه 27 برای تعیین اهمیت آماری تیمارها (در فاصله اطمینان ۹۵ درصد) استفاده شد. روند تکامل هر گروه در طول مطالعه با استفاده از آزمون اندازه‌گیری مکرر بررسی شد. تفاوت بین گروه‌های تیمار و کنترل در سطح (05/0>P) معنی‌دار در نظر گرفته شد (14).

نتایج

جداسازی و خالص‌سازی باکتریوفاژ VMUT_SIR1: در مطالعه حاضر، از سویه سالمونلا انتریتیدیس به‌عنوان سویه میزبان استفاده شد. باکتریوفاژ از فاضلاب جمع‌آوری‌شده از کشتارگاه طیور صنعتی در تهران، با روش صفحه آگار دولایه جداسازی شد. باکتریوفاژ خالص، به نام VMUT_SIR1، پس از پنج مرحله خالص‌سازی مداوم به دست آمد و پلاک‌های شفاف با اندازه یکنواخت و تقریباً به قطر 2 میلی‌متر در تصویر 1 نشان داده شد.

دامنه میزبانی باکتریوفاژ VMUT_SIR1: در‌مجموع، 20 سویه سالمونلا انتریتیدیس برای تعیین طیف میزبانی باکتریوفاژ استفاده شدند. همان‌طور که در جدول 1 نشان داده شده است، 18 نمونه لیز شدند و نرخ لیز کلی 90 درصد را نشان داد. این نتیجه نشان داد باکتریوفاژ VMUT_SIR1 دارای طیف لیز گسترده‌ای برای سالمونلا انتریتیدیس است. علاوه‌بر‌این، در 2 نمونه (10 درصد) لیز ناقص مشاهده شد. از 10 نمونه سالمونلا تیفی موریوم 3 (30 درصد) مورد تحت تأثیر فاژ لیز کامل و 1 مورد لیز ناقص نشان داد. در مطالعه بر روی اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس هیچ ناحیه لیز و عدم رشدی مشاهده نشد.

مورفولوژی باکتریوفاژ: همان‌طور که در تصویر 2 نشان داده شده است، VMUT_SIR1 دارای دم بلند و غیر‌انقباضی می‌باشد، طول دم و قطر سر ایکوزاهدرال آن به‌ترتیب 196 نانومتر و 89 نانومتر بود که به مورفولوژی معمول رده کوداویریده و خانواده سیفویریده تعلق دارد.

ضریب تعدد عفونت بهینه: پس از انکوباسیون VMUT_SIR1 با سلول‌های میزبان در MOI‌های مختلف (10³ - ^3-10) به‌مدت 5 ساعت، تیتر باکتریوفاژ مطابق تصویر 3 تعیین شد. در MOI برابر با ^2-10 ، تیتر فاژ افزایش یافت و به بالاترین مقدار (10⁹×5 PFU / میلی‌لیتر) رسید که نشان می‌دهد MOI بهینه VMUT_SIR1 آلوده‌شده با سالمونلا انتریتیدیس در محدوده 1/0 تا 01/0 بود.

فعالیت لیتیک: برای بررسی توانایی ضدباکتریایی باکتریوفاژ VMUT_SIR1، اثر لیتیک باکتریوفاژ بر باکتری میزبان در MOI‌های مختلف (01/0، 1/0 و 10) آزمایش شد. همان‌طور که در تصویر 4 نشان داده شده است، رشد باکتری میزبان تحت درمان با باکتریوفاژ VMUT_SIR1 در تمام MOIها در مقایسه با گروه کنترل به‌طور معنی‌داری مهار شد. تنها در MOI 01/0 بیش از 7 ساعت رشد باکتری مهار شد و تفاوت آشکاری در مهار باکتریایی در سایر MOIها پس از 7 ساعت مشاهده نشد.

کارایی جذب: همان‌طور که در تصویر 5 نشان داده شده است، کارایی جذب VMUT_SIR1 روی سالمونلا انتریتیدیس در 8 دقیقه اول به‌طور معنی‌داری افزایش یافت و در 12 دقیقه انکوباسیون به مقدار اوج (92 درصد) رسید و در دقیقه 20 با شدت زیاد افت نمود.

منحنی رشد یک‌مرحله‌ای: همان‌طور که در تصویر 6 نشان داده شده است، VMUT_SIR1 دوره نهفتگی کوتاهی (تقریباً 20 دقیقه) نشان داد. ذرات فاژ VMUT_SIR1 در 30 دقیقه به‌صورت نمایی تکثیر شدند و اندازه انفجار تقریباً 120 PFU / سلول محاسبه شد.

پایداری حرارتی و  pH: برای تعیین پایداری، تحمل باکتریوفاژ VMUT_SIR1 در برابر دماهای مختلف (18- تا 90 درجه سانتی‌گراد) و مقادیر pH (1 تا 12) بررسی شد. همان‌طور که در تصویر 7 نشان داده شده است، فعالیت باکتریوفاژ در دماهای بین 18- تا 70 درجه سانتی‌گراد پایدار باقی ماند. تیتر باکتریوفاژ به‌تدریج کاهش یافت و در دمای 80 درجه سانتی‌گراد همچنان تیتر تقریبی 4 لگاریتم PFU / میلی‌لیتر را حفظ کرد. باکتریوفاژ VMUT_SIR1پس از قرار گرفتن در معرض دمای 90 درجه سانتی‌گراد کاملاً غیرفعال شد.

همان‌طور که در تصویر 8 نشان داده شده است، تیتر باکتریوفاژ VMUT_SIR1 در محدوده pH 4 تا 12 در سطح اولیه باقی ماند. درpH  4 تا 8/1 لگاریتم PFU / میلی‌لیتر تیتر به‌تدریج کاهش یافت. در شرایط بسیار پایین (3pH ≤ )، هیچ باکتریوفاژ فعالی وجود نداشت. آزمایش‌های پایداری نشان داد این باکتریوفاژ دارای دامنه تحمل نسبتاً گسترده‌ای در برابر تنش‌های دمایی و pH است.

درمان پیشگیرانه روی گوشت سینه مرغ: در تمام آزمایش‌ها، سالمونلای طبیعی در نمونه‌های سینه مرغ پس از استریل کردن شناسایی نشد. در تصویر 9 نشان داده شده است در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد، تعداد باکتری‌های زنده سالمونلا انتریتیدیس در نمونه‌های تیمارشده به‌طور معنی‌داری در 6 ساعت اول به میزان 2 لگاریتم CFU / گرم کاهش یافت (05/0>P)؛ اما پس از 24 ساعت 47/2 لگاریتم CFU / گرم نسبت به تیتر اولیه باکتری افزایش یافت و به 10⁷ × 3 باکتری رسید. در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، پس از 6 ساعت 8/0 لگاریتم CFU / گرم و پس از 24 ساعت 76/1 لگاریتم CFU / گرم کاهش در تعداد باکتری‌های زنده، نسبت به میزان اولیه آن‎ها مشاهده شد. در نمونه‌های کنترل تعداد باکتری زنده پس از 24 ساعت به‌ترتیب در دمای 25 و 4 درجه سانتی‎گراد به‌ترتیب به 6/9 لگاریتم CFU / گرم و 4/5 لگاریتم CFU / گرم رسید.

درمان اصلاحی روی گوشت سینه مرغ: همان‌طور که در تصویر 9 نشان داده شده است در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد تعداد باکتری در نمونه‌های تیمار‌شده با باکتریوفاژ به‌طور معنی‌داری در 6 ساعت اول به میزان تقریبی 3 لگاریتم CFU / گرم کاهش یافت (05/0>P).‌ پس از 24 ساعت 25/1 لگاریتم CFU / گرم نسبت به تیتر اولیه باکتری افزایش یافت و به 25/6  لگاریتم CFU / گرم باکتری رسید. در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، پس از 6 ساعت 55/1 لگاریتم CFU / گرم و پس از 24 ساعت 4/2 لگاریتم CFU / گرم کاهش نسبت به میزان اولیه تعداد باکتری‌های زنده مشاهده شد.

بحث

مطالعه حاضر در راستای جداسازی و شناسایی جزئی باکتریوفاژهای خاص سالمونلا از فاضلاب کشتارگاه صنعتی طیور با هدف نهایی بررسی پتانسیل فاژها برای ایجاد یک عامل کنترل زیستی صورت گرفت. جداسازی فاژها با موفقیت انجام شد و نشان‌دهنده کاربردپذیری روش‌های مطالعه حاضر بود. از دیرباز ارتباط نزدیک باکتریوفاژها با میزبان‌های طبیعی خود شناخته شده است (27). سالمونلا به‌طور معمول در دستگاه گوارش حیوانات وجود دارد؛ از‌این‌رو فاضلاب کشتارگاه طیور به جهت پروسه‌های ذبح، شست‌وشو و تخلیه امعاواحشا مکانی مناسب برای جداسازی باکتریوفاژهای بومی می‌باشد (28).

پس از نمونه‌گیری و بررسی اولیه در‌مجموع از میان فاژهای موجود، فاژ VMUT_SIR1 به‌عنوان فاژ مورد‌آزمایش در مطالعه حاضر انتخاب گردید. مطالعات پیشین جداسازی فاژهای لیتیک علیه سالمونلای بیماری‌زای موجود در مواد غذایی را از منابع مختلفی، همچون مدفوع توسط Esmael و همکاران در سال 2021 (29)، گوشت مرغ توسط Parveen و همکاران در سال 2017 (30) یا محتوای روده‌ای جوجه‌های گوشتی توسط Augustine و همکاران در سال 2013 (31) و آب فاضلاب توسط Bryan و همکاران در سال 2023 (32) گزارش کرده‌اند.

مهم‌ترین و متداول‌ترین عامل برای طبقه‌بندی فاژها، در تمام مطالعات، ساختار میکروسکوپی بوده که در مطالعه حاضر، از میکروسکوپ الکترونی برای ارزیابی ساختار فنوتیپی باکتریوفاژ استفاده شد (33). فاژ جداسازی‌شده با استفاده از استانداردهای مورفولوژیکی تعیین‌شده توسط کمیته بین‌المللی طبقه‌بندی ویروس‌ها و پروتکل منتشرشده شناسایی و سپس با عنوان VMUT_SIR1 نام‌گذاری گردید (34). نتایج شناسایی مورفولوژیک نشان داد این فاژ به خانواده Siphoviridae تعلق داشته و دارای دم بلند و غیرقابل‌انقباض بود. این یافته با مطالعات پیشین که نشان داده‌اند فاژهای اختصاصی میزبان سالمونلا عمدتاً از اعضای راسته Caudovirales می‌باشند همخوانی دارد (35). خانواده Siphoviridae، از ویروس‌های DNA دو‌رشته‌ای، به‌دلیل طول بلند دم‌های غیرانقباضی خود متمایز می‌باشند. اعضای این خانواده دارای ژنوم‌های خطی و سرهای ایکوزاهدرال بوده که به‌دلیل ظرفیت ساختاری عمومی، کاندیدایی عالی برای آلوده کردن سویه‌های باکتریایی متعدد در مسیر کنترل زیستی مبتنی بر فاژ می‌باشند (36).

فاژ جداسازی‌شده، ویژگی‌های لیتیک خود را بر‌اساس توانایی در تشکیل پلاک روی لایه‌های باکتریایی میزبان‌هایش نشان داد. همگنی پلاک پس از خالص‌سازی مشاهده شد (37).

در طی بررسی‌های صورت‌گرفته بر روی فاژ VMUT_SIR1‌، دامنه میزبانی گسترده‌ و در‌عین‌حال اختصاصی برای آن مشخص شد. تعاملات مولکولی اختصاصی بین فاژ و باکتری میزبان، دامنه میزبانی باکتریوفاژ را تعیین می‌کند. باکتریوفاژهای با دامنه میزبانی اندک و گسترده وجود دارند. اختصاصیت بالای باکتریوفاژ به پروتئین‌های گیرنده اتصال‌ (RBPs)، مانند پروتئین فیبر دم و پروتئین اسپایک دم مرتبط است (38)‌. این پروتئین‌ها می‌توانند به باکتریوفاژ کمک کنند تا به‌طور خاص باکتری‌ها را شناسایی و به آن‌ها متصل شوند و برخی نیز می‌توانند ساختار سطح باکتری را مختل کنند تا به ورود اسیدهای نوکلئیک باکتریوفاژ به باکتری کمک کنند (39)، در‌حالی‌که فاژهای با طیف میزبانی وسیع می‌توانند در از بین بردن مجموعه‌ای از باکتری‌ها بسیار ارزشمند باشند‌، اما اختصاصیت این فاژها برای درمان‌های هدفمند مفید می‌باشد و ایجاد اختلال و اثرات خارج از هدف را در مقایسه با طیف میزبانی محدود که اختصاصی‌تر است کاهش می‌دهند (40). به‌عنوان مثال، فاژ VMUT_SIR1 توانست 90 درصد از جدایه‎های سرووار سالمونلا اینتریتیدیس و 30 درصد از جدایه‌های سالمونلا تیفی موریوم را لیز کند، اما بر روی باکتری اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس تأثیری نداشت.

Koskella و  Meadenدر سال 2013 با مطالعه درک اختصاصیت باکتریوفاژ‌ها در محیط طبیعی (41)، همچنین Akhtar و همکاران در سال 2014 در مطالعاتی در راستای جداسازی، شناسایی و تعیین خصوصیات فاژهای لیتیک مؤثر بر سرووارهای سالمونلا انتریکا بیان کردند فاژها می‌توانند در محیط‌های طبیعی با دامنه میزبانی محدود، اما با طیف اختصاصیت گسترده در سطح سرووار فعالیت کنند. مطالعه Akhtar و همکاران در سال 2014 تأکید کرد فاژSEA1  و SEA2 به‌شدت در برابر سایر باکتری‌ها اختصاصی می‌باشند. با‌این‌حال قادر به آلوده کردن طیف گسترده‌ای از سالمونلاها بودند. مشاهدات مطالعه حاضر با پژوهش‌های ذکر‌شده همخوانی داشت (42، 43).

ضریب چندگانگی عفونت (MOI) نسبت تعداد باکتریوفاژها به سلول‌های باکتریایی میزبان است (44). بالاترین تیتر باکتریوفاژ ممکن است با مخلوط کردن باکتریوفاژها با سلول‌های میزبان در MOI بهینه به دست آید. برای‌مثال، فاژ سالمونلا انتریتیدیس LSE7621 (45)، فاژ سالمونلا انتریتیدیس SaFB14 (46) و فاژ سالمونلا تیفی موریوم T156 (47) در مطالعات دیگر محققین دارای MOI بهینه مشابه (^1-10) بودند، در‌حالی‌که MOI بهینه فاژ T4 مانند QL01 برابر با ۱۰۰ (48) و فاژ استافیلوکوکوس اورئوس GH15 برابر با ^3-10 بود (49). ویژگی‌های باکتریوفاژها معمولاً بسته به سلول‌های میزبان و منابع آن‌ها متفاوت است.

فاژ VMUT_SIR1 پایداری در کاهش رشد باکتریایی و توقف آن در 12 ساعت اول در MOI 01/0 را نشان داد. MOI 001/0 فعالیت لیتیک کمتری نسبت به سلول‌های باکتریایی داشت و به افزایش تعداد باکتری‌ها منجر شد. نتایج فعالیت لیتیک فاژ مورد‌مطالعه با نتیجه مطالعات Dong و همکاران در سال 2025 (50)، Erol و همکاران در سال 2022 (51)، Haslinda و همکاران در سال 2024 (52) و Ge و همکاران در سال 2021 (53) همخوانی دارد.

جذب، اولین گام در آلودگی سلول‌های باکتریایی میزبان توسط فاژها است. VMUT_SIR1 زمان جذب کوتاه‌تر و کارایی جذب بالاتری داشت. گزارش شده است که فاژهای نوترکیب T3، T7 و ps3-1 کارایی جذب بهتری نسبت به فاژ مورد‌مطالعه نشان دادند (54). از‌نظر کاربرد، فاژ مورد‌مطالعه با زمان جذب کوتاه و نرخ جذب بالا می‌تواند نرخ لیز و فعالیت خود را افزایش دهد.

منحنی رشد یک‌مرحله‌ای برای تعیین ویژگی‌های باکتریوفاژها، مانند دوره نهفتگی، زمان انفجار و اندازه انفجار اهمیت زیادی دارد.

فاژهایی با دوره نهفتگی کوتاه ممکن است کاندیداهای خوبی برای کاربردهای کنترل زیستی در غذاها باشند (47). همان‌طور که در نمودار شماره 4 نشان داده شده است VMUT_SIR1 دوره نهفتگی کوتاهی (تقریباً 20 دقیقه) نشان داد مشابه باکتریوفاژهای لیتیک سالمونلا گزارش‌شده توسطLi  و همکاران در سال 2021 (47) و Duc و همکاران در سال 2018 (15) می‌باشد. ذرات فاژ در 30 دقیقه به‌صورت نمایی تکثیر شدند و اندازه انفجار تقریباً 120 PFU / سلول محاسبه شد. دوره نهفتگی کوتاه و اندازه انفجار بزرگ ویژگی‌های مثبتی می‌باشند که VMUT_SIR1 را برای کنترل آلودگی باکتریایی بالقوه مناسب می‌کنند که بالاتر از فاژ سالمونلا LPSTLL (۷۱ PFU / سلول) (55) و LPST144 (۶۲ PFU / سلول) (56) و نزدیک به LPST10 (۱۰۱ PFU / سلول) (57) بود.

در‌حالی‌که برخی فاژها ممکن است توانایی‌های لیتیک قوی نشان دهند، موفقیت آن‌ها در فاژدرمانی می‌تواند به‌دلیل عدم پایداری فیزیکی محدود شود؛ زیرا ممکن است تنها در دامنه‌های محدودی از شرایط محیطی زنده بمانند. با‌این‌حال فاژ VMUT_SIR1 دماهای بین 18- تا 70 درجه سانتی‌گراد را تحمل کرد که پتانسیل دوام آن‌ را به‌عنوان عوامل ضدعفونی‌کننده پایدار و سازگار با شرایط دمایی مختلف، ازجمله دماهای مشابه بدن حیوان تأیید می‌کند. این فاژ در شرایط اسیدی قوی زنده ماند. در مقابل مطالعه حاضر که پایداری در دماهای 70> درجه سانتی‌گراد را نشان داد، Kim و همکاران در سال 2020 پایداری به‌مدت 1 ساعت در دماهای 65> درجه سانتی‌گراد را گزارش کردند (58). نتیجه مطالعه حاضر با مطالعات دیگری نیز که پایداری مشابهی را در فاژهای سالمونلا SWJM-01 (59)، SWJM-02 (59)، PSDA-2 (60)، PS5 (61) وZCSE-9  (62) گزارش کرده‌اند سازگار است؛ بنابراین فاژهای جدا‌شده در مطالعه حاضر به‌دلیل پایداری گسترده pH (12-4) و پایداری دمایی (18- تا 70 درجه سانتی‌گراد) می‌توانند در غذاهای مختلف استفاده شوند.

اثرات فاژ بر زنده‌مانی سالمونلا انتریتیدیس در هر دو حالت پیشگیرانه و درمان اصلاحی باعث کاهش قابل‌توجه (05/0P<) میزبان‌های باکتریایی شد؛ اما در روش درمان اصلاحی، قدرت اثر فاژها نسبت به روش پیشگیرانه بیشتر بود که این مورد مرتبط با حضور میزبان‌های موجود در فاز لگاریتمی و کمک به اتصال و تکثیر بیشتر فاژ می‌باشد. تأثیر باکتریوفاژ در دمای 25 درجه به مراتب بیشتر از دمای 4 درجه سانتی‌گراد بود (63). در نمونه‌های تیمار‌شده با فاژ در دمای 25 درجه سانتی‎گراد طی 24 ساعت، رشد مجدد سالمونلا انتریتیدیس مشاهده شد، اما میزان زنده ماندن آن‌ها همچنان کمتر از نمونه کنترل بود (05/0>P). هنگامی که نمونه‌های گوشت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد تیمار شدند، تعداد زنده ماندن سالمونلا انتریتیدیس در نمونه‌های کنترل در طول زمان پایدار و نزدیک به تلقیح اولیه باقی ماند. در عوض، میزان زنده ماندن سالمونلا انتریتیدیس در نمونه‌های تیمار‌شده به‌طور قابل‌توجهی (05/0>P) در هر قطعه پس از 24 ساعت نگهداری کاهش یافت (64).

فاژها برای همانندسازی و تولید ذرات جدید به رشد میزبان باکتریایی خود وابسته‌اند. در دامنه دمایی بهینه، رشد سریع‌تر باکتری موجب تسریع همانندسازی فاژ می‌شود، در‌حالی‌که در دمای پایین، به‌دلیل کاهش نرخ رشد میزبان، سرعت همانندسازی فاژ به‌طور قابل‌توجهی کاهش یافته یا متوقف می‌شود (65)؛ بنابراین دما یکی از مهم‌ترین عوامل برون‌زاد مؤثر بر نتایج کاربرد فاژها در کنترل باکتری محسوب می‌شود. در مطالعه حاضر، تیمار سویه‌های سالمونلا انتریتیدیس در محیط LB در دمای ۲۵ درجه سانتی‎گراد کاهش بیشتری در شمار باکتری‌ها نسبت به تیمار در دمای 4 درجه سانتی‎گراد نشان داد که با گزارش‌های پیشین در‌زمینه بیوکنترل فاژی همخوانی دارد (66، 67).

نتیجه‌گیری نهایی: فاژ سالمونلای به‌دست‌آمده در مطالعه حاضر اطلاعات مفیدی جهت طراحی درمان‌های کنترلی زیستی مبتنی بر فاژ برای مقابله با سالمونلا انتریتیدیس در مراحل فرآوری و عرضه گوشت خام مرغ فراهم می‌کند و می‌تواند با هدف کاهش استفاده از ضدعفونی‌کننده‌های شیمیایی استفاده شود. به‌طور‌کلی فاژ VMUT_SIR1 به‌عنوان یک فاژ بومی با شاخصه‌های مهمی همچون اختصاصیت بالا‌، کارایی در MOI پایین و دوره نهفتگی کوتاه‌مدت می‌تواند جایگزین بالقوه‌ای برای کنترل گسترش سالمونلا انتریتیدیس در کشور، با‌توجه‌به تیتر آلودگی‌های گزارش‌شده باشد.

سپاسگزاری

از صندوق حمایت از پژوهشگران و فناوران کشور و بنیاد ملی علم به پاس حمایت از مطالعه حاضر، در قالب رساله دکتری به شماره ۴۰۱۴۱۲۸ و ستاد توسعه علوم و فناوری‌های زیست و سلول‌های بنیادی معاونت علمی و فناوری ریاست جمهوری به شماره طرح  11/127194سپاسگزاری می‌شود. از کلیه آزمایشگاه‌ها و کارشناسان دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران که در انجام مطالعه حاضر به ما یاری رساندند، قدردانی می‌شود. 

تعارض منافع

هیچ گونه تعارض منافعی در ارتباط با این مطالعه وجود ندارد.