اثر NPK پوشش‌دار با نانوذرات کیتوزان بر رشد و متابولیت‌های ثانویه نعناع گریپ‌فروتی (Mentha suaveolens × piperita) در شرایط کم‌آبیاری

. مقدمه

گیاهان دارویی به‌عنوان یکی از منابع طبیعی ارزشمند، نقش مهمی در تأمین نیازهای دارویی، غذایی و صنعتی ایفا می‌کنند
 (Aslani et al., 2023). این گیاهان به دلیل دارا بودن ترکیبات فعال زیستی مانند اسانس‌ها، آلکالوئیدها و فلاونوئیدها، در صنایع مختلف از جمله داروسازی، آرایشی-بهداشتی و غذایی کاربرد گسترده‌ای دارند (Haghaninia et al., 2024c;
Mumivand et al., 2021). همچنین، رشد روزافزون تقاضا برای محصولات گیاهی و طبیعی، اهمیت کشت و تولید پایدار گیاهان دارویی را دوچندان کرده است (Soltanbeigi et al., 2021).

نعناع گریپ­فروتی (Mentha suaveolens × piperita) یکی از گیاهان دارویی ارزشمند از خانواده نعناعیان(Lamiaceae)  است که به دلیل عطر و طعم منحصربه‌فرد و خواص درمانی متنوع، در صنایع دارویی، غذایی و عطرسازی کاربرد دارد
 (Jahanafrooz et al., 2024; Zhang et al., 2022). اسانس این گیاه که غنی از ترکیبات معطری مانند منتول، لینالیل­استات و لینالول است، به‌عنوان یک ماده مؤثر با خواص ضد باکتریایی، ضد التهابی و آنتی‌اکسیدانی شناخته می‌شود
 (Ludwiczuk et al., 2016; Ahmadi et al., 2022). این ویژگی‌ها، نعناع گریپ­فروتی را به یکی از گیاهان با پتانسیل بالا در بهبود سلامت انسان تبدیل کرده است (De Sousa Barros et al., 2015). همچنین، این گیاه در تنظیم تنش­های فیزیولوژیک، بهبود فرآیند گوارش و ایجاد آرامش نقش مؤثری دارد (Wang et al., 2016; Ahmadi et al., 2022). علی‌رغم اهمیت اقتصادی و دارویی این گیاه، سطح زیر کشت آن در ایران بسیار محدود بوده و تحقیقات اندکی در زمینه تولید و مدیریت این گیاه انجام شده است. با توجه به افزایش تقاضا برای محصولات طبیعی و دارویی در کشور، توسعه پژوهش‌هایی که بر بهبود عملکرد و کیفیت نعناع گریپ­فروتی در شرایط محیطی نامطلوب نظیر خشکی متمرکز باشند، امری ضروری است (Akbarzadeh et al., 2023). این امر به‌ویژه در شرایطی که تنش‌های زیستی و غیر زیستی مانند خشکی می‌توانند به‌طور قابل توجهی بر تولید و کیفیت گیاهان دارویی تأثیر بگذارند، اهمیت بیشتری پیدا می‌کند (Aslani et al., 2023).

تنش خشکی یکی از مهم‌ترین تنش‌های غیر زیستی است که در مناطق خشک و نیمه‌خشک به یکی از عوامل محدودکننده تولید کشاورزی تبدیل شده است (Haghaninia et al., 2024a). در این شرایط، گیاهان به دلیل کمبود آب، مجبور به کاهش فعالیت‌های فیزیولوژیکی مانند فتوسنتز و رشد می‌شوند (Amir et al., 2021). همچنین، خشکی باعث افزایش تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن شده که می‌تواند منجر به آسیب اکسیداتیو، تخریب سلولی و در نهایت کاهش عملکرد ماده خشک گردد
 (Asghari et al., 2023; Bayati et al., 2020). در پاسخ به خشکی، گیاهان تولید آنتی‌اکسیدان‌ها را افزایش می‌دهند تا رادیکال‌های آزاد را خنثی کنند (Babaei et al., 2021). در این راستا، تحقیقات مختلف نشان داده‌اند که تنش خشکی اثرات منفی قابل توجهی بر عملکرد، کیفیت و صفات فیزیولوژیکی گیاهان دارویی دارد. به­عنوان مثال، محققان با ارزیابی تأثیر تنش خشکی بر گیاه نعناعفلفلی (Mentha piperita) گزارش کردند که خشکی باعث کاهش رشد، وزن تر، تعداد برگ و سطح برگ شده و ترکیبات بیوشیمیایی مهم مانند فلاونوئیدها و آنتی‌اکسیدان‌ها به­طور منفی تحت تأثیر قرار گرفتند (Chiappero et al., 2019). در تحقیق دیگری که بر روی گیاه مریم‌گلی (Salvia officinalis) انجام شد، پژوهشگران اظهار داشتند که با افزایش شدت تنش خشکی، پارامترهای رشد، محتوای نسبی آب، شاخص کلروفیل، عملکرد اسانس و غلظت عناصر غذایی کاهش یافت (Aslani et al., 2023).

با توجه به افزایش جمعیت و نیاز روزافزون به امنیت غذایی، توسعه سطح زیرکشت یک ضرورت اجتناب‌ناپذیر در بسیاری از کشورها محسوب می‌شود (Haghaninia et al., 2025)؛ اما این گسترش سطح زیرکشت در حالی صورت می‌گیرد که منابع آب شیرین محدود بوده و بحران آب در بسیاری از مناطق تشدید شده است (Raza et al., 2023). بر اساس گزارش‌های بین‌المللی، بخش کشاورزی بیش از 70 درصد از منابع آب تجدیدپذیر جهان را مصرف می‌کند و در عین حال، تغییرات اقلیمی و کاهش بارندگی باعث کاهش منابع آب قابل‌ دسترس شده‌اند .(Haghaninia et al., 2024a) بنابراین، توسعه کشاورزی بدون درنظرگرفتن استراتژی‌های مدیریت منابع آب، نه‌تنها پایدار نخواهد بود، بلکه می‌تواند منجر به افت عملکرد محصولات کشاورزی و افزایش بحران‌های زیست‌محیطی شود (Jabeen et al., 2024). از این­رو، توسعه­ی راهکارهای علمی و پایدار به منظور کاهش اثرات منفی خشکی و افزایش بهره‌وری کشاورزی در مناطق خشک و نیمه‌خشک، از ضرورت­های اساسی به شمار می­رود
 (Haghaninia et al., 2024b; Das et al., 2023). یکی از روش‌های مرسوم استفاده از کودهای شیمیایی است که به‌طور معمول باعث افزایش رشد و عملکرد گیاهان می‌شوند (Mahmoud et al., 2020). با این حال، استفاده بی‌رویه از کودهای شیمیایی در شرایط خشکی، به‌ویژه در خاک‌های با محدودیت رطوبت، اثرات منفی قابل توجهی بر گیاهان خواهد داشت
 (Elshamy et al., 2020; Alhasan et al., 2019). در چنین شرایطی، کارایی جذب عناصر غذایی از خاک کاهش می‌یابد و گیاهان قادر به استفاده بهینه از منابع غذایی نخواهند بود (Haghaninia et al., 2023; Batool et al., 2023). علاوه بر این، مصرف زیاد کودهای شیمیایی موجب تغییرات منفی در ساختار خاک، آلودگی منابع آب و تهدید سلامت اکوسیستم‌ها می‌شود
 (Salem et al., 2024). به‌ویژه در شرایط خشکی، این کودها نمی‌توانند به‌طور مؤثر بر عملکرد گیاهان تأثیر بگذارند و حتی در برخی موارد می‌توانند تنش‌های فیزیولوژیکی را تشدید کنند (Haghaninia et al., 2024a; Ashraf et al., 2019). بنابراین، نیاز به جستجوی روش‌های جدید و سازگار با محیط ‌زیست برای بهبود عملکرد گیاهان در شرایط خشکی بیش از پیش احساس می‌شود (Asghari et al., 2023).

یکی از این روش‌ها، بهره‌گیری از نانوفناوری است که استفاده از آن می‌تواند به بهبود وضعیت گیاهان تحت تنش خشکی کمک کند (Raza et al., 2023). نانوذرات به دلیل اندازه بسیار کوچک و سطح فعال بالا، می‌توانند جذب مواد مغذی را تسهیل کرده و اثرات منفی خشکی را کاهش دهند (Razavizadeh et al., 2023). از جمله این نانوذرات می­توان به نانوذرات کیتوزان اشاره کرد. کیتوزان یک پلی‌ساکارید طبیعی است که از کیتین، ماده‌ای که در پوسته سخت‌پوستان مانند خرچنگ‌ها و میگوها و همچنین برخی از قارچ‌ها یافت می‌شود، استخراج می‌گردد (Attaran Dowom et al., 2022; Riseh et al., 2024). نانوذرات کیتوزان، به دلیل ویژگی‌های خاص خود همچون قابلیت‌های ضد میکروبی، زیست‌سازگاری بالا، قابلیت جذب آب و ویژگی‌های آنتی‌اکسیدانی، در کشاورزی به‌ویژه در مواجهه با تنش‌های محیطی، مورد توجه قرار گرفته‌اند (Sahu et al., 2023). علاوه­بر­این، پوشش‌دار کردن با نانوذرات کیتوزان به عنوان یک نوآوری در استفاده از نانوذرات کیتوزان در کشاورزی، به‌ویژه در شرایط تنش‌های محیطی مانند خشکی، توجه زیادی را به خود جلب کرده است (Hassanpouraghdam et al., 2023). این نانوذرات با استفاده از پوشش‌های اضافی مانند پلیمرها، نانوذرات معدنی یا ترکیبات زیستی بهبود یافته و ویژگی‌های خاصی را از خود نشان می‌دهند که به افزایش کارایی آن‌ها در مقابله با چالش‌های محیطی کمک می‌کند (Giglou et al., 2022; Gohari et al., 2023). پوشش‌دهی کودهای شیمیایی با نانوذرات کیتوزان به عنوان یک راهکار دوستدار محیط زیست و با کمترین اثرات منفی (Sami et al., 2022) باعث می‌شود که مواد به‌طور تدریجی و کنترل‌شده‌تری در محیط رها شوند که در نتیجه موجب بهبود جذب مواد مغذی
 (Elshayb et al., 2024)، کاهش تبخیر و حفظ رطوبت در گیاهان تحت تنش می‌گردد (Ashraf et al., 2022; Ha et al., 2019).

در تحقیقات مختلف، نانوذرات کیتوزان به عنوان نوعی راهکار مؤثر برای کاهش اثرات تنش خشکی و بهبود کمیت و کیفیت گیاهان، به‌ویژه گیاهان دارویی، معرفی شده است (Attaran Dowom et al., 2020; Khodadadi et al., 2022). به­عنوان مثال، در مطالعه‌ای با کاربرد نانوذرات کیتوزان پوشش­دار شده در نعناع (Mentha piperita L.) تحت شرایط خشکی، مشاهده شد تیمار مذکور به بهبود رشد رویشی، افزایش محتوای آنتی‌اکسیدانی و ارتقاء ترکیبات بیوشیمیایی مؤثر در نعناع انجامید. این بهبود به نقش نانوذرات کیتوزان در کاهش استرس آبی و بهبود فرآیندهای متابولیکی گیاه، مانند افزایش جذب آب و محافظت از سلول‌ها در برابر آسیب‌های ناشی از خشکی نسبت داده شد (Giglou et al., 2022). در تحقیق دیگری پژوهشگران گزارش کردند که محلول­پاشی کودهای شیمیایی پوشش­دار شده با نانوذرات کیتوزان پارامترهای رشد و عملکرد، رنگدانه‌های فتوسنتزی و عناصرغذایی در سیب­زمینی (Solanum tuberosum) را به­طور معنی­داری در مقایسه با شاهد افزایش داد (Elshamy et al., 2019). 

با توجه به تغییرات اقلیمی و کاهش منابع آب، این پژوهش به دنبال ارائه راهکارهایی نوآورانه و پایدار برای مقابله با تنش‌های محیطی نظیر خشکی در گیاهان دارویی است. از این­رو، این مطالعه با هدف ارزیابی کارایی NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان در بهبود عملکرد کمی و کیفی نعناع گریپ­فروتی در شرایط تنش خشکی اجرا شد.

2. روش­شناسی پژوهش

2-1. زمان و مکان انجام آزمایش

این پژوهش در گلخانه تحقیقاتی مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، واقع در دانشکده کشاورزی دانشگاه مراغه، استان آذربایجان شرقی، ایران، در بهار و تابستان سال 1403 انجام شد. برای انجام آزمایش­ها نیز از آزمایشگاه گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی و آزمایشگاه مرکزی دانشگاه مراغه استفاده شد.

2-2. ویژگی‌های محیطی گلخانه

شرایط محیطی در گلخانه تحقیقاتی به‌طور دقیق تنظیم و کنترل شد و شرایط رشدی بهینه برای گیاهان مورد مطالعه فراهم گردید. دمای گلخانه در محدوده 18 تا 25 درجه سانتی‌گراد و رطوبت نسبی در بازه 60 تا 70 درصد در طول دوره آزمایش نگهداری شد. نور طبیعی در طول روز به‌طور متوسط 12 تا 14 ساعت بر گیاهان تابش داشت. سیستم تهویه گلخانه به‌وسیله فن‌ها و سیستم‌های تهویه مکانیزه کنترل شد تا از تجمع رطوبت و گرمای اضافی جلوگیری و گردش هوای مناسب برای رشد گیاهان تأمین گردد. علاوه بر این، برای جلوگیری از ورود آفات به گلخانه، از توری‌های ضد حشره در ورودی‌ها و دریچه‌های تهویه استفاده شد.

3-2. آماده­سازی بستر کاشت

خاک مورد استفاده در این تحقیق از لایه فوقانی خاک زراعی تهیه و به­طور تصادفی نمونه‌برداری انجام شد. براساس نتایج تجزیه خاک، بافت خاک به صورت لوم رسی شنی بود که برخی از خصوصیات فیزیکوشیمیایی آن در جدول 1 ارائه شده است.

جدول 1. ویژگی­های فیزیکی و شیمیایی خاک مورد استفاده در پژوهش حاضر.

2-4. طراحی آزمایش و تیمارهای آزمایشی

آزمایش حاضر به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار انجام شد. عوامل آزمایش شامل سه سطح تنش آبی (آبیاری کامل با 90% ظرفیت زراعی، تنش آبی متوسط با 60% ظرفیت زراعی و تنش آبی شدید با 30% ظرفیت زراعی) و چهار تیمار کودی شامل شاهد (C)، کود شیمیایی کامل (NPK)، نانوذرات کیتوزان (CS) و NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان (NPKCS-C) بودند. در مجموع، 12 تیمار مختلف با چهار تکرار در هر تیمار و تعداد کل واحدهای آزمایشی 48 واحد مورد بررسی قرار گرفت.

2-5. اعمال رژیم­های آبیاری

در این تحقیق، اعمال تنش خشکی به‌روش وزنی صورت گرفت. ابتدا برای تعیین ظرفیت زراعی خاک، نمونه‌ای از خاک داخل گلدان‌های زهکش‌دار ریخته و سپس آبیاری گردید. پس از آبیاری، گلدان‌ها با پلاستیک پوشانده و به‌طور مرتب در فواصل زمانی مختلف وزن شدند. هنگامی که میزان رطوبت خاک در دو فاصله زمانی برابر شد، نمونه‌برداری از عمق مشخص خاک انجام و وزن نمونه‌ها ثبت شد. سپس نمونه‌ها به‌مدت 24 ساعت در آون با دمای 105 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند تا خشک شوند. پس از خشک­شدن، میزان رطوبت نمونه‌ها با استفاده از فرمول­های زیر محاسبه شد (Haghaninia et al., 2024b):

که در این فرمول w₁ وزن نمونه مرطوب وw₂  وزن نمونه خشک­شده و Ɵm درصد جرمی رطوبت بود. پس از تعیین درصد رطوبت و ظرفیت زراعی خاک، آبیاری گلدان‌ها بر اساس میزان رطوبت خاک انجام شد. به‌منظور ایجاد تنش خشکی، گلدان‌ها به‌طور مداوم وزن شدند تا رطوبت خاک به سطوح مختلف تنش خشکی برسد. آبیاری با توجه به کاهش 10%، 40% و 70% از ظرفیت زراعی خاک انجام شد. برای محاسبه مقدار رطوبت مورد نیاز برای هر سطح از تنش خشکی، میزان خاک گلدان در درصد رطوبت ظرفیت زراعی ضرب شده و مقدار رطوبت مورد نظر برای هر سطح از آبیاری مشخص شد.

6-2. نحوه تهیه و اعمال تیمارهای کودی

1-6-2. تهیه محلول کیتوزان/NPK

کیتوزان با وزن مولکولی پایین (100 کیلو دالتون) و درجه استیل­زدایی (DD) حدود 85 درصد از شرکت سبزگستر آذین ترکان- مراغه ایران و تری­پلی­فسفات (TPP) با درجه تحلیلی از شرکت مرک آلمان تهیه شد. محلول نانو کیتوزان با استفاده از روش گزارش­شده قبلی به­دست آمد (Haghaninia et al., 2023). پس از انحلال کامل، محلول کیتوزان (4/0 گرم TPP در 20 میلی­لیتر آب مقطر) در حالی که به­شدت هم زده می­شد، حاصل شد. برای تهیه محلول کیتوزانNPK/، ابتدا محلول دو در هزار از کود NPK تهیه شد. بدین منظور، دو گرم از کود NPK در یک لیتر آب حل و با همزن مکانیکی تا زمانی که محلول کاملاً همگن شود، مخلوط شد. سپس، یک گرم از کیتوزان با جرم مولکولی پایین (100 کیلو دالتون) به محلول اضافه شد. برای تسهیل انحلال کیتوزان، یک میلی‌لیتر از اسیداستیک خالص به محلول افزوده و اجازه داده شد تا کیتوزان کاملاً حل شود. پس از انحلال کامل، محلول در ظرف دربسته نگهداری و برای عملیات کودپاشی استفاده شد.

2-6-2. تهیه کود کپسول‌دار شده کیتوزان/NPK

برای تهیه نانوکپسول‌های کیتوزانNPK / از روش ژل‌شدن کیتوزان استفاده شد. ابتدا محلول کیتوزان/ NPK طبق دستورالعمل ذکر شده در بخش قبل تهیه شد. برای تشکیل نانوکپسول‌ها، از تری­پلی­فسفات به‌عنوان عامل ژل‌زای کیتوزان استفاده شد. غلظت تری­پلی­فسفات برابر با 25 درصد وزنی کیتوزان مصرفی بود. به این ترتیب، 25/0 گرم از تری­پلی­فسفات در 20 میلی­لیتر آب مقطر حل شد. در­حالی­که محلول کیتوزانNPK / با سرعت 1500 دور در دقیقه در حال هم­زدن بود، محلول تری­پلی­فسفات به آرامی و قطره‌قطره به داخل محلول کیتوزانNPK / افزوده شد. پس از افزودن محلول تری­پلی­فسفات، محلول به رنگ کدر درآمد که نشان‌دهنده تشکیل نانوکپسول‌های کیتوزان حاوی کود NPK بود. محلول نهایی در ظرف دربسته نگهداری و برای مصرف آماده شد.

3-6-2. نحوه کاربرد تیمار نانوذرات

در این مطالعه، پس از تهیه نانوذرات کیتوزان و همچنین کیتوزان پوشش­دار شده باNPK ، تیمارهای مختلف در سه مرحله رشدی نعناع گریپ‌فروتی به‌طور یکنواخت از طریق محلول‌پاشی روی برگ‌ها اعمال شد. این سه مرحله شامل مرحله استقرار گیاه، مرحله رشد رویشی و مرحله پیش از گلدهی بود. در هر مرحله، نانوذرات کیتوزان به کمک اسپری به‌طور یکنواخت روی سطح برگ‌ها پاشیده شد، به‌طوری که برگ‌ها به‌طور کامل با محلول پوشش داده شدند و رطوبت کافی برای جذب نانوذرات فراهم گردید. محلول‌پاشی در ساعات خنک صبحگاهی انجام تا از تبخیر سریع جلوگیری شود و جذب بهینه نانوذرات توسط برگ‌ها تضمین گردد. لازم به ذکر است پیش از انجام هر مرحله از آزمایش، فرایند کالیبراسیون دستگاه برای اطمینان از توزیع یکنواخت محلول روی سطح گیاهان انجام شد.

4-6-2. کاربرد تیمار NPK

کود NPK یکی از منابع اصلی تأمین عناصر غذایی ضروری برای گیاهان است که شامل نیتروژن (N)، فسفر (P) و پتاسیم (K)  می‌باشد. در این مطالعه، کود NPK با نسبت 20:20:20 به‌صورت محلول آبی آماده شد و در سه مرحله از دوره رشد گیاه نعناع گریپ­فروتی به‌کار گرفته شد. مرحله اول در هنگام کاشت گیاه، زمانی که گیاه هنوز در حال استقرار در خاک بود انجام شد تا نیازهای اولیه گیاه تأمین شود. مرحله دوم در آغاز دوره رشد رویشی (زمانی که گیاه شروع به تولید برگ‌های جدید کرد) و مرحله سوم در اوایل توسعه ریشه‌ها و شاخه‌ها اعمال گردید تا نیازهای تغذیه‌ای گیاه در این مراحل بحرانی به‌خوبی برآورده شود.

2-7. نمونه‌برداری برای اندازه‌گیری صفات بیوشیمیایی

نمونه‌برداری از برگ‌های گیاه نعناع گریپ­فروتی برای اندازه‌گیری صفات بیوشیمیایی در ابتدای گلدهی صورت گرفت. بدین منظور، برگ‌های سالم و جوان از هر گلدان به­طور تصادفی برداشت شد. سپس، نمونه­ها فریز شده و در دمای منفی ۸۰ درجه سلسیوس نگهداری شدند تا از تجزیه و تغییرات بیوشیمیایی جلوگیری شود (Haghaninia et al., 2024b).

8-2. رنگیزه­های فتوسنتزی

مقدار کلروفیل و کاروتنوئید موجود در برگ‌های گیاه نعناع گریپ­فروتی با استفاده از روش آرنون (Arnon, 1949) اندازه‌گیری شد. برای این منظور، 5/0 گرم از وزن برگ‌ها در هاون چینی با نیتروژن مایع هضم و سپس به داخل لوله‌های فالکون 15 میلی‌لیتری منتقل شد. پس از آن، 10 میلی‌لیتر استون 80 درصد به نمونه‌ها اضافه شد تا عصاره‌گیری صورت گیرد. سپس نمونه‌ها به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس از این مدت، محلول رویی از لوله‌های فالکون جدا شده و به لوله‌های جدید منتقل شد. غلظت کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. جذب نمونه‌ها در طول موج‌های 663 نانومتر (برای کلروفیل a)، 645 نانومتر (برای کلروفیل b) و 470 نانومتر (برای کاروتنوئید) ثبت شد.

9-2. آنزیم­های آنتی­اکسیدانی

برای اندازه‌گیری فعالیت GPX، ابتدا 1/0 میلی‌لیتر از عصاره آنزیمی گیاه به دو میلی‌لیتر محلول واکنش شامل 10 میلی‌مولار گایاکول و 10 میلی‌مولار هیدروژن­پراکسید اضافه شد. سپس تغییرات جذب نور در طول موج 470 نانومتر به مدت یک دقیقه اندازه‌گیری شد (Chance & Maehly, 1955). همچنین، فعالیت CAT از طریق اندازه‌گیری کاهش جذب نور در طول موج 240 نانومتر ناشی از تجزیه هیدروژن­پراکسید انجام شد. 1/0 میلی‌لیتر عصاره آنزیمی به دو میلی‌لیتر محلول هیدروژن­پراکسید 10 میلی‌مولار اضافه شد و سپس تغییرات جذب نور طی 30 ثانیه در 240 نانومتر اندازه‌گیری شد (Aebi, 1984). علاوه­بر­این، برای اندازه‌گیری فعالیت POX، 1/0 میلی‌لیتر عصاره آنزیمی به محلول واکنش شامل 10 میلی‌مولار گایاکول و 10 میلی‌مولار هیدروژن­پراکسید افزوده شد. تغییرات جذب نور در طول موج 470 نانومتر اندازه‌گیری شد (Beauchamp & Fridovich, 1971).

10-2. اندازه­گیری آنتوسیانین و آسکوربیک­اسید

برای اندازه­گیری آنتوسیانین، مقدار 5/0 گرم از برگ‌های گیاه در 10 میلی‌لیتر متانول اسیدی (متانول حاوی یک درصد اسیدکلریدریک) همگن شد. سپس نمونه‌ها به مدت 15 دقیقه در دمای چهار درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند. جذب محلول‌ها در طول موج‌های 520 و 700 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر قرائت شد (Giusti & Wrolstad, 2001). علاوه­بر­این، برای تعیین مقدار اسیدآسکوربیک، از روش رنگ‌سنجی با معرف 2,6-دی‌کلروفنول‌ایندوفنول استفاده شد (Omaye et al., 1979). بدین­منظور، 5/0 گرم از برگ‌ها در 10 میلی‌لیتر محلول سه درصد متافسفریک­اسید استخراج شد. پس از سانتریفیوژ، یک میلی‌لیتر از عصاره حاصل با نه میلی‌لیتر از محلول معرف مخلوط و کاهش جذب در طول موج 520 نانومتر اندازه‌گیری شد.

11-2. مالون­دی­آلدئید و پراکسید هیدروژن

برای تعیین غلظت مالون­دی‌آلدئید، نمونه‌های برگ گیاه با محلول یک درصد تری‌کلرواستیک­اسید هضم و سپس شدت جذب در طول موج 532 نانومتر اندازه‌گیری شد. غلظت مالون­دی‌آلدئید بر حسب نانو‌مول بر گرم وزن تر گیاه گزارش شد
 (Heath & Packer, 1968). همچنین برای اندازه‌گیری پراکسید هیدروژن، 50 میلی‌گرم از برگ‌های جوان فریز‌شده با پنج میلی‌لیتر محلول 1/0% تری‌کلرواستیک­اسید هضم شد و پس از سانتریفیوژ، 500 میکرولیتر از مایع رویی حاصل با 500 میکرولیتر بافر
 K-phosphate (100 میلی‌مولار) و دو میلی‌لیتر محلول یدید پتاسیم مخلوط گردید. میزان جذب در طول موج 390 نانومتر اندازه‌گیری شد (Alexieva et al., 2001).

2-12. استخراج اسانس

برای استخراج اسانس از دستگاه کلونجر طرح آپاراتوس (مدل فارماکوپه بریتانیا) استفاده شد. نمونه­های برگی و سر شاخه­های گلدار خشک­شده به­وسیله آسیاب آزمایشگاهی به قطعات ریز (جهت استخراج بهتر اسانس) خرد شدند و مقدار 30 گرم از هر نمونه جهت اسانس ­گیری با استفاده از ترازوی دیجیتالی (Sartorius, Germany) با دقت 001/0 گرم توزین شدند. فرآیند اسانس‌گیری به مدت سه ساعت انجام شد. پس از استخراج، اسانس‌های به‌دست­آمده با سولفات سدیم خشک و آبگیری شدند. سپس اسانس‌ها در ویال‌های شیشه‌ای در دمای چهار درجه سانتی‌گراد تا زمان آنالیز نگهداری شدند (Haghaninia et al., 2024b).

13-2. شناسایی ترکیبات اسانس

برای شناسایی ترکیبات اسانس نعناع گریپ­فروتی، از دستگاه کروماتوگرافی گازی متصل به طیف‌سنجی جرمی (GC-MS) مدل Agilent 5977A  ساخت ایالات متحده آمریکا و ستون HP-5 MS (پلی‌سیلوکسان با پنج درصد فنیل­متیل، طول 30 متر، قطر داخلی 25/0 میلی‌متر و ضخامت پوشش 25/0 میکرومتر) استفاده شد. شناسایی ترکیبات اسانس از طریق مقایسه شاخص‌های بازداری خطی با داده‌های مرجع (Adams, 2007) و طیف‌های جرمی ترکیبات استاندارد انجام شد. همچنین، برای جداسازی دقیق‌تر ترکیبات از دستگاه کروماتوگرافی گازی مدل Agilent 7990B با آشکارساز یونیزاسیون شعله‌ای (FID) و ستون VF-5MS بهره گرفته شد. دمای تزریق و آشکارساز به­ترتیب 230 و 240 درجه سانتی‌گراد تنظیم شد. جریان گاز هلیوم با سرعت یک میلی‌لیتر در دقیقه و نسبت تقسیم 1:24 استفاده شد. نمونه‌های اسانس به نسبت 1:100 در هگزان رقیق و یک میکرولیتر از آن‌ها برای تحلیل‌ها تزریق شد. شناسایی ترکیبات بدون استفاده از ضرایب اصلاح، تنها با نرمال‌سازی سطح پیک‌ها انجام شد
 (Haghaninia et al., 2024b).

2-14. تجزیه آماری 

برای تجزیه و تحلیل داده‌های به‌دست‌آمده از اندازه‌گیری پارامترهای مختلف، از نرم‌افزار SAS نسخه 9 استفاده شده و آزمون LSD  برای مقایسه میانگین‌ها به­کار گرفته شد. آنالیز واریانس داده‌ها با سطح اطمینان 95 درصد انجام و شکل­ها نیز با نرم‌افزار
 Excel 2013 رسم شد.

3. نتایج پژوهش و بحث

1-3. ارتفاع بوته

تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که ارتفاع بوته نعناع گریپ‌فروتی به­طور معنی‌داری تحت تأثیر تنش خشکی، تیمارهای کودی و اثر متقابل آن‌ها قرار گرفت (جدول 2). بیشترین ارتفاع بوته در شرایط بدون تنش و با استفاده از NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان به­دست آمد، در­حالی­که کمترین ارتفاع مربوط به تیمار تنش خشکی شدید و بدون مصرف کود بود (شکل 1). در شرایط تنش خشکی متوسط و شدید، ارتفاع بوته به­ترتیب 1/11 درصد و 4/35 درصد در مقایسه با شرایط بدون تنش کاهش یافت (شکل 1).

با این حال، استفاده از NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان در شرایط عدم تنش منجر به افزایش 8/70 درصدی ارتفاع بوته در مقایسه با تیمار تنش خشکی شدید و بدون مصرف کود شد (شکل 1). تنش خشکی از طریق کاهش جذب آب، اختلال در فتوسنتز و کاهش انرژی مورد نیاز برای تقسیم و کشیدگی سلولی، به کاهش ارتفاع گیاهان منجر می‌شود (Jafari et al., 2019). همچنین، محققان اظهار داشتند کاهش تورژسانس سلولی، کاهش محتوای کلروفیل و افت فعالیت آنزیم‌های فتوسنتزی نظیر روبیسکو از مهم‌ترین عوامل کاهش رشد طولی ساقه در شرایط تنش خشکی هستند (Soltanbeigi et al., 2021;
Abd Elbar et al., 2019). با این حال، کاربرد کودهای شیمیایی پوشش‌دار با نانوذرات کیتوزان می‌تواند این اثرات منفی را تعدیل کند (Salem et al., 2024; Alhasan, 2020). کیتوزان به‌عنوان یک پلیمر زیستی، با بهبود جذب آب و عناصر غذایی، افزایش سنتز اسمولیت‌های سازگار مانند پرولین، و تقویت سیستم آنتی‌اکسیدانی، توانایی گیاه در مقابله با تنش را افزایش می‌دهد
 (Sheikhalipour et al., 2021; Jabeen et al., 2024; Elshamy et al., 2019; Haghaninia et al., 2024c). تحقیقات روی گیاهان مختلف نشان داده‌اند که استفاده از کودهای پوشش‌دار با نانوکیتوزان، بهبود معناداری در ارتفاع گیاهان تحت تنش ایجاد کرده است (Ali et al., 2021; Gohari et al., 2023; Das et al., 2023).

جدول 2. تجزیه واریانس اثرات تنش خشکی و تیمارهای کودی بر ارتفاع بوته، عملکرد ماده خشک و محتوای اسانس نعناع گریپ­فروتی.

** و * به­ترتیب معنی­دار در سطح احتمال یک و پنج درصد.

2-3. ماده خشک

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که ماده خشک گیاه نعناع گریپ‌فروتی به­طور معنی‌داری تحت تأثیر تنش خشکی، تیمارهای کودی و اثر متقابل این دو قرار گرفت (جدول 2). بیشترین ماده خشک در شرایط بدون تنش و با کاربرد NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان مشاهده شد؛ در­حالی­که کمترین ماده خشک مربوط به تیمار تنش خشکی شدید و بدون مصرف کود بود (شکل 2). علاوه بر این، مقدار ماده خشک در شرایط بدون تنش در مقایسه با تنش خشکی متوسط 4/24 درصد و در مقایسه با تنش خشکی شدید 8/37 درصد افزایش یافت (شکل 2). همچنین، استفاده از NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان در شرایط بدون تنش، ماده خشک را به­ترتیب 7/28 درصد نسبت به شاهد و 3/84 درصد نسبت به تیمار بدون مصرف کود در شرایط تنش خشکی شدید افزایش داد (شکل 2). تنش خشکی از طریق کاهش فشار تورژسانس، اختلال در تقسیم سلولی و محدودیت تولید مواد فتوسنتزی، ماده خشک را کاهش می‌دهد (Rezaei-Chiyaneh et al., 2023; Asghari et al., 2021). مطابق با نتایج پژوهش حاضر، مطالعات پیشین نشان داده­اند تنش خشکی با افزایش تولید گونه‌های فعال اکسیژن و تخریب پروتئین‌ها و لیپیدهای غشایی، منجر به کاهش متابولیسم سلولی و در نهایت کاهش ماده خشک می‌شود (Mumivand et al., 2021; Aslani et al., 2023). در این شرایط، NPK پوشش‌دار با نانوذرات کیتوزان با تأمین تدریجی عناصر نیتروژن، فسفر و پتاسیم، نقش کلیدی در تولید پروتئین‌ها، سنتز ATP و تنظیم اسمزی دارند (Ha et al., 2019; Mohammadi et al., 2020). همچنین، نانوذرات کیتوزان موجود در پوشش این کودها با بهبود کارایی مصرف آب از طریق کاهش تبخیر و حفظ رطوبت خاک، به بهینه‌سازی استفاده از منابع محدود آب کمک می‌کنند (Kubavat et al., 2020; Giglou et al., 2022). همسو با این نتایج، محققان گزارش کردند نانوذرات کیتوزان با کاهش استرس اکسیداتیو و افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مانند سوپراکسیددیسموتاز و پراکسیداز، تخریب سلول‌ها را مهار کرده و انرژی بیشتری برای ساخت ماده خشک فراهم می‌کنند (Khodadadi et al., 2022).

3-3. محتوای اسانس

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که تنش خشکی، تیمارهای کودی و اثر متقابل آن‌ها تأثیر معنی‌داری بر محتوای اسانس نعناع گریپ‌فروتی داشتند (جدول 2). بالاترین محتوای اسانس در تیمار NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان تحت شرایط تنش خشکی متوسط مشاهده شد؛ در­حالی­که کمترین مقادیر این صفات به شاهد اختصاص داشت (شکل 3). در شرایط تنش خشکی متوسط، محتوای اسانس 5/98 درصد در مقایسه با شرایط بدون تنش افزایش یافت. همچنین، در تیمار NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان تحت تنش متوسط، محتوای اسانس 2/314 درصد نسبت به شاهد افزایش داشت. علاوه­بر­این، در مقایسه با شرایط تنش شدید و بدون مصرف کود، استفاده از NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان تحت تنش متوسط منجر به افزایش 7/146 درصدی محتوای اسانس شد (شکل 3).

محتوای اسانس به‌طور معمول در پاسخ به استرس‌های ناشی از خشکی افزایش می­یابد (Aslani et al., 2023). این ترکیبات به‌عنوان یک مکانیسم دفاعی در برابر آسیب‌های ناشی از گونه‌های فعال اکسیژن و استرس اکسیداتیو عمل می‌کنند
 (Bayati et al., 2020; Razavizadeh et al., 2023). به­طور مشابه، مطالعات نشان داده‌اند که در خشکی‌ متوسط، تولید اسانس در برخی گیاهان دارویی به‌عنوان یک واکنش تطبیقی به کاهش رطوبت و افزایش فشار اسمزی گیاه افزایش می‌یابد
 (Aslani et al., 2023; Mumivand et al., 2021). همسو با یافته­های پژوهش حاضر، محققان گزارش کردند عملکرد اسانس مریم­گلی با کاهش آبیاری از 80 درصد به 60 درصد ظرفیت زراعی افزایش یافت؛ اما با کمبود آب شدیدتر (40 درصد ظرفیت زراعی) محتوای اسانس و عملکرد اسانس کاهش یافت (Bidabadi et al., 2020). در همین حال، کاربرد NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان باعث افزایش تولید اسانس در شرایط تنش خشکی شد، زیرا این نانوذرات به افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی و کاهش اثرات رادیکال‌های آزاد کمک کردند (Ibrahim, 2019; Ashraf et al., 2022). همسو با نتایج ­آمده از این پژوهش، محققان مشاهده کردند استفاده از کودهای پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان می­توانند به بهبود جذب مواد مغذی و افزایش فعالیت متابولیکی در گیاه کمک کرده که به‌طور غیر مستقیم باعث تقویت تولید اسانس می‌شود (Giglou et al., 2022).

3-4. اجزای اسانس

بررسی ترکیبات اسانس نعناع گریپ‌فروتی منجر به شناسایی 21 ترکیب شد که مجموعاً 11/90 تا 15/99 درصد از کل ترکیبات را شامل می‌شوند (جدول 3). ترکیبات غالب اسانس شامل لینالیل­استات (74/45 تا 11/64 درصد)، لینالول (98/19 تا 67/28درصد)، ترپینول (22/3 تا 62/8 درصد)، تیمول (08/2 تا 96/4 درصد)، ژرانیل­استات (79/2 تا 89/4 درصد)، نریل­استات (67/0 تا 61/2 درصد)، n-دکان (62/0 تا 30/2 درصد)، نرول (68/0 تا 15/2 درصد) و 1,8-سینئول (82/0 تا 51/1 درصد) بودند (جدول 3). بیشترین مقادیر لینالیل­استات، ژرانیل­استات و 1,8-سینئول در شرایط تنش خشکی متوسط و با استفاده از NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان مشاهده شد؛ در­حالی­که بیشترین میزان لینالول در شرایط بدون تنش و با استفاده از همین تیمار حاصل شد (جدول 3). همچنین، بالاترین مقدار ترپینول با کاربرد NPK در شرایط بدون تنش ثبت شد. در شرایط تنش متوسط و با استفاده از نانوذرات کیتوزان، بیشترین میزان تیمول حاصل شد. علاوه­بر­این، حداکثر مقدار نریل­استات و نرول با کاربرد NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان در شرایط تنش خشکی شدید مشاهده شد و بیشترین مقدار  n-دکان نیز تحت تنش شدید و با استفاده از نانوذرات کیتوزان به­دست آمد (جدول 3). در شرایط تنش خشکی متوسط ممکن است گیاهان در پاسخ به استرس ترکیبات خاصی را برای مقابله با اثرات منفی خشکی تولید کنند که باعث افزایش غلظت برخی اسانس‌ها در گیاهان دارویی گردد
 (Babaei et al., 2021). با این­حال، تنش خشکی شدید منجر به کاهش رطوبت در بافت‌های گیاهی شده و در نتیجه موجب اختلال در فرآیندهای بیوشیمیایی گیاهان می‌گردد (Abd-Elbar et al., 2019) که این امر ممکن است در شرایط تنش شدید باعث کاهش میزان تولید ترکیبات اسانس شود (Mandoulakani et al., 2017; Haghaninia et al., 2024b). در مقابل، استفاده ازNPK  پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان به دلیل ویژگی‌های خاص خود، قابلیت بهبود شرایط تغذیه‌ای گیاه را در شرایط استرس خشکی دارد (Mahmoud & Swaefy, 2020). این نانوذرات به‌طور تدریجی و کنترل‌شده مواد مغذی مانند نیتروژن، فسفر و پتاسیم را به گیاهان ارائه می‌دهند که این عناصر برای فرآیندهای بیوشیمیایی و تولید ترکیبات اسانسی ضروری هستند
 (Mahmoud et al., 2023; Ashraf et al., 2022). علاوه­براین، کیتوزان به‌عنوان یک ماده طبیعی خاصیت ضد میکروبی و آنتی‌اکسیدانی دارد که می‌تواند به کاهش آسیب‌های ناشی از رادیکال‌های آزاد و تقویت فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مانند پراکسیداز و کاتالاز در گیاهان تحت تنش خشکی کمک کند (Khodadadi et al., 2022). این فعالیت‌ها باعث افزایش توان گیاه برای تولید ترکیبات اسانس تحت شرایط خشکی می‌شود (Attaran Dowom et al., 2022; Ali et al., 2021).

5-3. کلروفیل a و b

تجزیه واریانس نشان داد که محتوای کلروفیل a و b گیاه نعناع گریپ‌فروتی به‌طور معنی‌داری تحت تأثیر تیمارهای کودی، سطوح مختلف تنش خشکی و اثر متقابل این دو عامل قرار گرفت (جدول 4). بیشترین مقادیر کلروفیل a و b در تیمار NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان در شرایط بدون تنش خشکی مشاهده شد؛ در­حالی­که کمترین مقادیر این صفات به شرایط تنش خشکی شدید و عدم استفاده از کود اختصاص داشت (جدول 5). در شرایط بدون تنش، محتوای کلروفیل a و b به‌ترتیب 9/28 و 1/48 درصد نسبت به شرایط تنش خشکی شدید افزایش یافتند. علاوه­بر­این، در شرایط بدون تنش، استفاده از NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان موجب افزایش 5/71 درصدی کلروفیل a و 9/123 درصدی کلروفیل b نسبت به شرایط تنش شدید بدون کاربرد کود شد (جدول 5). کاهش محتوای کلروفیل در شرایط تنش خشکی ناشی از اختلال در سنتز آن به دلیل کاهش فعالیت آنزیم‌های دخیل در مسیر بیوسنتز کلروفیل (مانند آنزیم کلروفیلاز) و افزایش تخریب آن در اثر تولید گونه‌های فعال اکسیژن است
 (Raza et al., 2023; Mohasseli et al., 2019). این گونه‌ها از طریق اکسیداسیون لیپیدهای غشایی و تخریب ساختارهای فتوسنتزی مانند تیلاکوئیدها، به کاهش شدید محتوای کلروفیل منجر می‌شوند (Sharma et al., 2020). به­طور مشابه، پژوهشگران گزارش کردند بسته­شدن روزنه‌ها و کاهش جذب دی‌اکسید کربن در شرایط تنش خشکی، کارایی فتوسنتزی گیاه را کاهش داده و به تخریب بیشتر کلروفیل‌ها دامن می‌زند (Tashakorizadeh et al., 2022; Abd Elbar et al., 2019). در مقابل، کاربردNPK  پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان اثرات منفی تنش خشکی بر محتوای کلروفیل را تعدیل می­کند (Ibrahim, 2019). این کودها با تأمین تدریجی عناصر نیتروژن، فسفر و پتاسیم، به‌ویژه نیتروژن، به‌عنوان یکی از اجزای اصلی ساختاری کلروفیل، نقش کلیدی در حفظ سنتز کلروفیل ایفا می‌کنند (Balusamy et al., 2022; Elshayb et al., 2024). تحقیقات مشابه نشان داده‌اند که استفاده از کودهای پوشش‌دار با نانوکیتوزان از طریق تقویت سیستم دفاعی گیاه و افزایش تولید پروتئین‌های مرتبط با فتوسنتز، کاهش محتوای کلروفیل در اثر تنش را کاهش داده‌اند (Jabeen et al., 2024).

6-3. محتوای کاروتنوئیدها

بررسی اثرات متقابل تنش خشکی و تیمارهای کودی نشان داد که تنش خشکی، تیمارهای کودی و اثرات متقابل آن­ها تأثیر معنی­داری بر محتوای کارتنوئید نعناع گریپ‌فروتی دارند (جدول 4). نتایج حاکی از آن بود که بالاترین میزان کاروتنوئید در شرایط تنش متوسط و با استفاده از NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان به­دست آمد. در مقابل، شاهد کمترین میزان کارتنوئید را تولید کرد (جدول 5). در شرایط تنش متوسط، محتوای کاروتنوئید نسبت به شرایط بدون تنش و تنش شدید به­ترتیب 8/72 و 6/17 درصد افزایش یافت. از سوی دیگر، تیمار NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان تحت تنش متوسط، محتوای کارتنوئید را در مقایسه با تنش شدید بدون کود 2/48 درصد و نسبت به شاهد 9/122 افزایش داد (جدول 5). کارتنوئیدها به‌عنوان رنگدانه‌های محافظ در فتوسنتز، نقش کلیدی در مهار ROS و حفاظت از کلروفیل‌ها ایفا می‌کنند (Razavizadeh et al., 2023). در شرایط تنش خشکی، اگرچه در مراحل ابتدایی ممکن است محتوای کاروتنوئیدها افزایش یابد تا گیاه را در برابر تنش اکسیداتیو محافظت کند، اما در مراحل شدیدتر تنش به دلیل تخریب ساختارهای فتوسنتزی و کاهش سنتز این ترکیبات، محتوای کارتنوئیدها کاهش می‌یابد
 (Haghaninia et al., 2024b). این کاهش به دلیل اختلال در فعالیت آنزیم‌های دخیل در بیوسنتز کاروتنوئیدها و اکسیداسیون آن‌ها توسط ROS است (Abd Elbar et al., 2019; Nikzad et al., 2023). با این حال، کاربرد NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان می‌تواند محتوای کاروتنوئیدها را در شرایط تنش خشکی حفظ یا حتی افزایش دهد (Balusamy et al., 2022; Alhasan, 2020). این کودها با آزادسازی تدریجی عناصر نیتروژن، فسفر و پتاسیم، تعادل تغذیه‌ای گیاه را حفظ و از کاهش متابولیسم فتوسنتزی جلوگیری می‌کنند (Giglou et al., 2022; Sami et al., 2022). تحقیقات مشابه در گیاهانی مانند نعناع
 (.Mentha spicata L) نشان داده است که استفاده از کودهای پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان به دلیل کاهش تنش اکسیداتیو، حفاظت از ساختارهای فتوسنتزی و افزایش سنتز ترکیبات فتوسنتزی موجب افزایش محتوای کاروتنوئیدها تحت تنش شده است
 (Hassanpouraghdam et al., 2023).

3-7. فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی

فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی به­طور معنی‌داری تحت تأثیر تنش خشکی، تیمارهای کودی و اثر متقابل این دو قرار گرفت (جدول 4). بالاترین میزان فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز، کاتالاز و گایاکول­پراکسیداز در تیمار NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان در شرایط تنش خشکی متوسط مشاهده شد؛ در­حالی­که کمترین فعالیت مربوط به شاهد بود (جدول 5). در شرایط تنش خشکی متوسط، فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز، کاتالاز و گایاکول­پراکسیداز به­ترتیب 8/218، 7/136 و 2/165 درصد نسبت به شرایط بدون تنش افزایش یافت (جدول 5).

جدول 3. اثر تنش خشکی و تیمارهای کودی بر ترکیبات اسانس نعناع گریپ­فروتی.

جدول 4. تجزیه واریانس اثرات تنش خشکی و تیمارهای کودی بر صفات فیزیولوژیک نعناع گریپ­فروتی.

**، * و ^ns به­ترتیب معنی­دار در سطح احتمال یک درصد، پنج درصد و غیر معنی­دار.

جدول 5. مقایسه میانگین اثرات متقابل تنش خشکی و تیمارهای کودی بر صفات فیزیولوژیک نعناع گریپ­فروتی.

*میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون، بر اساس آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد تفاوت معنی­دار ندارد.

علاوه­بر­این، در شرایط تنش خشکی متوسط، کاربرد NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان در مقایسه با شرایط تنش خشکی شدید و بدون مصرف کود، به­ترتیب 2/133، 9/59 و 1/157 درصد افزایش فعالیت آنزیمی نشان داد (جدول 5). در شرایط تنش خشکی، گیاهان در معرض رادیکال‌های آزاد قرار می‌گیرند که می‌توانند باعث آسیب به غشاهای سلولی، پروتئین‌ها و DNA شوند (Chiappero et al., 2019). بنابراین، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی به‌طور قابل ‌توجهی افزایش می‌یابد تا این گونه‌های فعال اکسیژن خنثی شده و آسیب‌ها کاهش یابند (Batool et al., 2020). در این راستا، تحقیقات نشان داده است که تحت تنش خشکی، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در گیاه اسطوخودوس (Lavandula angustifolia L.) افزایش یافت تا تعادل اکسیداتیو گیاه حفظ شود (Haghaninia et al., 2024b). در این شرایط، استفاده از NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان به‌عنوان یک حامل برای انتقال تدریجی و پایدار مواد مغذی عمل می‌کنند که این امر باعث فراهم‌سازی تدریجی عناصر غذایی به گیاه می‌شود
(Balusamy et al., 2022; Sami et al., 2022). این مواد مغذی برای سنتز آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی ضروری هستند و باعث تقویت سیستم دفاعی گیاه در برابر استرس اکسیداتیو می‌شوند (Sadak et al., 2022)؛ به‌ویژه نیتروژن به‌عنوان عنصر کلیدی در سنتز پروتئین‌ها و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، فسفر در تشکیل و عملکرد سیستم‌های انرژی گیاه و پتاسیم در تقویت توان گیاه برای مقابله با خشکی مؤثر است (Haghaninia et al., 2024a). در تایید یافته­های ما، محققان گزارش کردند استفاده از کودهای پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان منجر به افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی از جمله کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز، آسکوربات­پراکسیداز در گیاهان تحت تنش شد (Jabeen et al., 2024).

3-8. محتوای اسید اسکوربیک و آنتوسیانین

تحلیل آماری نشان داد که تنش خشکی و تیمارهای کودی تأثیر معنی‌داری بر محتوای اسیداسکوربیک و آنتوسیانین نعناع گریپ‌فروتی داشتند (جدول 4). در شرایط تنش شدید، محتوای آسکوربیک­اسید نسبت به عدم تنش و تنش متوسط به‌ترتیب 4/50 و 7/21 افزایش یافت (شکل 4). مشابه این روند، محتوای آنتوسیانین نیز در شرایط تنش شدید نسبت به عدم تنش و تنش متوسط به‌ترتیب 9/202 و 1/59 افزایش نشان داد (شکل 4). در میان تیمارهای کودی،NPK  پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان بالاترین مقادیر آسکوربیک­اسید و آنتوسیانین را تولید کرد. این تیمار در مقایسه با شاهد، باعث افزایش 4/15 در محتوای اسکوربیک­اسید و 6/32 درصد در محتوای آنتوسیانین شد (شکل 4). اسید آسکوربیک به‌عنوان یکی از آنتی‌اکسیدان‌های کلیدی، با خنثی‌سازی ROS و تنظیم تعادل اکسیداتیو در سلول، نقش حیاتی در تحمل گیاه به خشکی دارد. مطالعات نشان داده‌اند در پاسخ به تنش خشکی محتوای آنتوسیانین و اسیدآسکوربیک افزایش می‌یابند (Li et al., 2022). این ترکیبات نه‌تنها به‌عنوان آنتی‌اکسیدان عمل می‌کنند، بلکه در تنظیم فشار اسمزی، کاهش تبخیر و محافظت از گیاه در برابر نور فرابنفش نقش دارند (Napar et al., 2022;
Haghaninia et al., 2025). به­طور مشابه، پژوهشگران گزارش کردند در شرایط تنش خشکی، تولید ترکیبات آنتی‌اکسیدانی مانند اسیدآسکوربیک و آنتوسیانین افزایش یافت (Amir et al., 2021). علاوه­بر­این، نانوذرات کیتوزان از طریق افزایش دسترسی گیاه به مواد مغذی و بهبود فعالیت آنزیم‌های دخیل در مسیرهای سنتز ترکیبات آنتی‌اکسیدانی مانند PAL و گالاکتونولاکتون­دهیدروژناز (Haghaninia et al., 2024c) باعث افزایش محتوای آنتوسیانین و اسیدآسکوربیک می‌شوند (Sheikhalipour et al., 2021;
Riseh et al., 2024). همچنین، نانوذرات کیتوزان به‌عنوان القاگر زیستی، بیان ژن‌های مرتبط با مسیرهای بیوسنتزی را تحریک کرده و با تقویت سیستم آنتی‌اکسیدانی از جمله بهبود اسیدآسکوربیک و آنتوسیانین مقاومت گیاه را در برابر تنش افزایش می‌دهند (Ashraf et al., 2022). تحقیقات انجام­شده در زمینه تنش خشکی و کودهای شیمیایی و نانوکیتوزان، یافته‌های مشابهی را گزارش کرده‌اند. پژوهشگران اظهار داشتند استفاده از کودهای شیمیایی و نانوذرات کیتوزان منجر به بهبود محتوای اسیدآسکوربیک و آنتوسیانین در شرایط تنش خشکی شدند (Haghaninia et al., 2023).

شکل 4. مقایسه میانگین تنش خشکی و تیمارهای کودی بر محتوای آسکوربیک­اسید و آنتوسیانین نعناع گریپ­فروتی. C: شاهد، NPK: کود شیمیایی کامل، CS: نانوذرات کیتوزان و NPKCS-C: NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان. FC 90%: 90 درصد ظرفیت زراعی (بدون تنش)، FC 60%: 60 درصد ظرفیت زراعی (تنش خشکی متوسط)، FC 50%: 50 درصد ظرفیت زراعی (تنش خشکی شدید). حروف مختلف نشان­دهنده تفاوت معنی­دار در سطح احتمال پنج درصد بر اساس آزمون LSD است.

3-9. محتوای مالون­دی­آلدئید و پراکسید هیدروژن

تجزیه واریانس نشان داد که تنش خشکی، تیمارهای کودی و اثر متقابل آن‌ها به­طور معنی‌داری بر محتوای مالون‌دی‌آلدئید و پراکسید هیدروژن در گیاه نعناع گریپ‌فروتی تأثیر داشت (جدول 4). بیشترین میزان مالون‌دی‌آلدئید و پراکسید هیدروژن در شرایط تنش خشکی شدید و بدون مصرف کود مشاهده شد. در مقابل، کمترین مقدار مالون‌دی‌آلدئید در تیمار NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان تحت شرایط عدم تنش و کمترین میزان پراکسید هیدروژن در شاهد به­دست آمد (شکل 5). در شرایط تنش خشکی شدید، محتوای مالون‌دی‌آلدئید و پراکسید هیدروژن به­ترتیب 8/74 درصد و 2/180 درصد نسبت به شرایط بدون تنش افزایش یافتند. در مقابل، استفاده از NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان در شرایط عدم تنش، محتوای مالون‌دی‌آلدئید را 3/62 درصد و پراکسید هیدروژن را 2/76 درصد در مقایسه با تنش خشکی شدید و بدون کاربرد کود کاهش داد (شکل 5). مالون­دی­آلدئید و پراکسید هیدروژن به‌عنوان شاخص‌های استرس اکسیداتیو شناخته می‌شوند و افزایش آن­ها نشان‌دهنده‌ آسیب به غشاهای سلولی و افزایش فعالیت گونه‌های فعال اکسیژن است (Mumivand et al., 2021; Haghaninia et al., 2025). علاوه­بر­این، مالون­دی­آلدئید یکی از محصولات فرایند اکسیداسیون لیپیدها است و در اثر این فرآیند به میزان قابل توجهی افزایش می‌یابد
 (Bidabadi et al., 2020). پراکسید هیدروژن نیز از جمله گونه‌های فعال اکسیژن است که در اثر تنش خشکی افزایش می‌یابد و این افزایش نشان‌دهنده‌ سطح بالای استرس اکسیداتیو در گیاه است (Haghaninia et al., 2024c; Mohasseli et al., 2019).

در مقابل، NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان به‌طور خاص با تنظیم متابولیسم گیاه و تقویت پاسخ‌های دفاعی آن، توانایی گیاه برای مقابله با استرس خشکی را افزایش می‌دهند (Ashraf et al., 2022; Attaran Dowom et al., 2022). نانوذرات کیتوزان با ایجاد یک پوشش محافظ روی ذرات کود NPK، آزادسازی تدریجی و کنترل‌شده‌ مواد مغذی را امکان‌پذیر می‌کنند (Hajihashemi et al., 2022) که این امر باعث می‌شود گیاه بتواند بهتر از مواد مغذی بهره‌برداری کرده و به‌ویژه در زمان‌های بحرانی، مانند شرایط تنش خشکی، به سرعت به مواد مغذی دست یابد (Ali et al., 2021; Salem et al., 2024). این تغذیه پایدار باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی می‌شود که به مقابله با اثراتROS  کمک کرده و سطح MDA و H₂O₂ را کاهش می‌دهد (Gohari et al., 2023; Sahu et al., 2023).

شکل 5. مقایسه میانگین اثرات متقابل تنش خشکی و تیمارهای کودی بر مالون­دی­آلدهید و پراکسید هیدروژن نعناع گریپ­فروتی. Fc 90%: 90 درصد ظرفیت زراعی (بدون تنش)، FC 60%: 60 درصد ظرفیت زراعی (تنش خشکی متوسط)، FC 50%: 50 درصد ظرفیت زراعی (تنش خشکی شدید). حروف مختلف نشان­دهنده تفاوت معنی­دار در سطح احتمال پنج درصد بر اساس آزمون LSD است.

4. نتیجه­گیری

نتایج این تحقیق نشان داد که تنش خشکی تأثیر قابل توجهی بر صفات فیزیولوژیک، بیوشیمیایی و ماده خشک گیاه نعناع گریپ‌فروتی دارد. این تنش باعث کاهش تولید ترکیبات اسانس، افزایش مالون­دی‌آلدئید و پراکسید هیدروژن و در نتیجه کاهش کمیت و کیفیت شد. با این حال، برخی از صفات مانند محتوای اسانس و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی تحت شرایط تنش خشکی متوسط به­طور معناداری افزایش یافت که نشان‌دهنده واکنش گیاه به استرس و تلاش آن برای مقابله با آسیب‌های ناشی از رادیکال‌های آزاد است. با این حال، استفاده از کودهای شیمیایی NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان توانست به­طور مؤثری اثرات منفی تنش خشکی را کاهش دهد. این کودها با تأمین تدریجی عناصر غذایی ضروری برای گیاهان موجب تقویت فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانی، بهبود فرآیندهای بیوسنتزی، افزایش تولید ترکیبات اسانس و سایر متابولیت‌های ثانویه در گیاه شدند. علاوه­بر­این، نانوذرات کیتوزان با ویژگی‌های آنتی‌اکسیدانی خود کمک کردند تا آسیب‌های ناشی از رادیکال‌های آزاد کاهش یابد و سیستم دفاعی گیاه تقویت شود. به‌طور کلی، نتایج این تحقیق حاکی از این است که کاربرد کودهای شیمیایی NPK پوشش‌دار شده با نانوذرات کیتوزان نه تنها می‌تواند به‌طور مؤثری تولید و کیفیت ترکیبات اسانس در گیاهان تحت تنش خشکی را افزایش دهد، بلکه با کاهش اتلاف مواد شیمیایی به محیط زیست و کاهش خطرات آلایندگی ناشی از کودهای شیمیایی سنتی، به حفظ سلامت خاک و اکوسیستم‌ها کمک می‌کند. با این­حال، پیشنهاد می‌شود پژوهش‌های میدانی با هدف ارزیابی پاسخ گیاه به این ترکیب در خاک‌های مختلف و شرایط اقلیمی متنوع انجام شود تا امکان تعمیم‌پذیری یافته‌ها در مقیاس بزرگ‌تر فراهم شود.

5. منابع

Abd Elbar, O.H., Farag, R.E., & Shehata, S.A. (2019). Effect of putrescine application on some growth, biochemical and anatomical characteristics of Thymus vulgaris )L.( under drought stress. Annals of Agricultural Sciences, 64(2), 129-137. https://doi.org/10.1016/j.aoas.2019.10.001.

Adams, R.P. (2017). Identification of essential oil components by gas chromatography/mass spectrometry. 5 online ed. Gruver, TX USA: Texensis Publishing.

Aebi, H. (1984). Catalase in vitro. Methods in Enzymology, 105, 121-126. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(84)05016-3.

Ahmadi, H., Morshedloo, M.R., Emrahi, R., Javanmard, A., Rasouli, F., Maggi, F., & Lorenzo, J.M. (2022). Introducing three new fruit-scented mints to farmlands: Insights on drug yield, essential-oil quality, and antioxidant properties. Antioxidants, 11(5), 866. https://doi.org/10.3390/antiox11050866.

Akbarzadeh, S., Morshedloo, M.R., Behtash, F., Mumivand, H., & Maggi, F. (2023). Exogenous β-aminobutyric acid (BABA) improves the growth, essential oil content, and composition of grapefruit mint
(Mentha suaveolens× piperita) under water deficit stress conditions. Horticulturae, 9(3), 354. https://doi.org/10.3390/horticulturae9030354.

Alexieva, V., Sergiev, I., Mapelli, S., & Karanov, E. (2001). The effect of drought and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat. Plant, Cell & Environment, 24(12), 1337-1344. https://doi.org/10.1046/j.1365-3040.2001.00778.x.

Alhasan, A.S. (2020). Effect of different NPK nano-fertilizer rates on agronomic traits, essential oil, and seed yield of basil (Ocimum basilicum L. cv Dolly) grown under field conditions. Plant Archives, 20(2), 2959-2962.

Ali, E.F., El-Shehawi, A.M., Ibrahim, O.H.M., Abdul-Hafeez, E.Y., Moussa, M.M., & Hassan, F.A.S. (2021). A vital role of chitosan nanoparticles in improvisation the drought stress tolerance in Catharanthus roseus (L.) through biochemical and gene expression modulation. Plant Physiology and Biochemistry, 161, 166-175. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2021.02.008.

Amir, S.B., Rasheed, R., Ashraf, M.A., Hussain, I., & Iqbal, M. (2021). Hydrogen sulfide mediates defense response in safflower by regulating secondary metabolism, oxidative defense, and elemental uptake under drought. Physiologia Plantarum, 172(2), 795-808. https://doi.org/10.1111/ppl.13267.

Arnon, D.I. (1949). Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology, 24(1), 1.

Asghari, J., Mahdavikia, H., Rezaei-Chiyaneh, E., Banaei-Asl, F., Amani Machiani, M., & Harrison, M.T. (2023). Selenium nanoparticles improve physiological and phytochemical properties of basil (Ocimum basilicum L.) under drought stress conditions. Land, 12(1), 164. https://doi.org/10.3390/land12010164.

Ashraf, U., Zafar, S., Ghaffar, R., Sher, A., Mahmood, S., Noreen, Z., & Ashraf, A. (2022). Impact of nano chitosan-NPK fertilizer on field crops. In Role of chitosan and chitosan-based nanomaterials in plant sciences (pp. 165-183). Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-323-85391-0.00008-3.

Aslani, Z., Hassani, A., Mandoulakani, B.A., Barin, M., & Maleki, R. (2023). Effect of drought stress and inoculation treatments on nutrient uptake, essential oil and expression of genes related to monoterpenes in sage (Salvia officinalis). Scientia Horticulturae, 309, 111610. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2022.111610.

Attaran Dowom, S., Karimian, Z., Mostafaei Dehnavi, M., & Samiei, L. (2022). Chitosan nanoparticles improve physiological and biochemical responses of Salvia abrotanoides (Kar.) under drought stress. BMC Plant Biology, 22(1), 364. https://doi.org/10.1186/s12870-022-03689-4.

Babaei, K., Moghaddam, M., Farhadi, N., & Pirbalouti, A.G. (2021). Morphological, physiological and phytochemical responses of Mexican marigold (Tagetes minuta L.) to drought stress. Scientia Horticulturae, 284, 110116. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2021.110116.

Balusamy, S.R., Rahimi, S., Sukweenadhi, J., Sunderraj, S., Shanmugam, R., Thangavelu, L., & Perumalsamy, H. (2022). Chitosan, chitosan nanoparticles and modified chitosan biomaterials, a potential tool to combat salinity stress in plants. Carbohydrate Polymers, 284, 119189. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2022.119189.

Batool, T., Ali, S., Seleiman, M.F., Naveed, N.H., Ali, A., Ahmed, K., & Mubushar, M. (2020). Plant growth promoting rhizobacteria alleviates drought stress in potato in response to suppressive oxidative stress and antioxidant enzymes activities. Scientific Reports, 10(1), 16975. https://doi.org/10.1038/s41598-020-73489-z.

Bayati, P., Karimmojeni, H., & Razmjoo, J. (2020). Changes in essential oil yield and fatty acid contents in black cumin (Nigella sativa L.) genotypes in response to drought stress. Industrial Crops and Products, 155, 112764. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2020.112764.

Beauchamp, C., & Fridovich, I. (1971). Superoxide dismutase: Improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Analytical Biochemistry, 44(1), 276-287. https://doi.org/10.1016/0003-2697(71)90370-8.

Bidabadi, S.S., VanderWeide, J., & Sabbatini, P. (2020). Exogenous melatonin improves glutathione content, redox state and increases essential oil production in two Salvia species under drought stress. Scientific Reports, 10(1), 6883. https://doi.org/10.1038/s41598-020-63986-6.

Chance, B., & Maehly, A.C. (1955). Assay of catalases and peroxidases. U: Colowick SP, Kaplan NO (ur.) Methods in Enzymology.

Chiappero, J., del Rosario Cappellari, L., Alderete, L.G.S., Palermo, T.B., & Banchio, E. (2019). Plant growth promoting rhizobacteria improve the antioxidant status in Mentha piperita grown under drought stress leading to an enhancement of plant growth and total phenolic content. Industrial Crops and Products, 139, 111553. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2019.111553.

Das, D., Bisht, K., Chauhan, A., Gautam, S., Jaiswal, J.P., Salvi, P., & Lohani, P. (2023). Morpho-physiological and biochemical responses in wheat foliar sprayed with zinc-chitosan-salicylic acid nanoparticles during drought stress. Plant Nano Biology, 4, 100034. https://doi.org/10.1016/j.plana.2023.100034.

De Sousa Barros, A., de Morais, S.M., Ferreira, P.A.T., Vieira, Í.G.P., Craveiro, A.A., dos Santos Fontenelle, R.O., & de Sousa, H.A. (2015). Chemical composition and functional properties of essential oils from Mentha species. Industrial Crops and Products, 76, 557-564. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2015.07.004.

Elshamy, M.T., Husseiny, S.M., & Farroh, K.Y. (2019). Application of nano-chitosan NPK fertilizer on growth and productivity of potato plant. Journal of Scientific Research in Science, 36(1), 424-441. https://doi.org/10.21608/jsrs.2019.58522.

Elshayb, O.M., Ghazy, H.A., Wissa, M.T., Farroh, K.Y., Wasonga, D.O., & Seleiman, M.F. (2024). Chitosan-based NPK nanostructure for reducing synthetic NPK fertilizers and improving rice productivity and nutritional indices. Frontiers in Sustainable Food Systems, 8, 1464021. https://doi.org/10.3389/fsufs.2024.1464021.

Giglou, M.T., Giglou, R.H., Esmaeilpour, B., Azarmi, R., Padash, A., Falakian, M., & Lajayer, H.M. (2022). A new method in mitigation of drought stress by chitosan-coated iron oxide nanoparticles and growth stimulant in peppermint. Industrial Crops and Products, 187, 115286. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2022.115286.

Gohari, G., Farhadi, H., Panahirad, S., Zareei, E., Labib, P., Jafari, H., & Fotopoulos, V. (2023). Mitigation of salinity impact in spearmint plants through the application of engineered chitosan-melatonin nanoparticles. International Journal of Biological Macromolecules, 224, 893-907. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2022.10.175.

Ha, N.M.C., Nguyen, T.H., Wang, S.L., & Nguyen, A.D. (2019). Preparation of NPK nanofertilizer based on chitosan nanoparticles and its effect on biophysical characteristics and growth of coffee in green house. Research on Chemical Intermediates, 45, 51-63. https://doi.org/10.1007/s11164-018-3630-7.

Haghaninia, M., Javanmard, A., Kahrizi, D., Bahadori, M.B., & Machiani, M.A. (2024a). Optimizing oil quantity and quality of camelina (Camelina sativa L.) with integrative application of chemical, nano and bio-fertilizers under supplementary irrigation and rainfed condition. Plant Stress, 11, 100374. https://doi.org/10.1016/j.stress.2024.100374.

Haghaninia, M., Javanmard, A., Mahdavinia, G.R., Shah, A.A., & Farooq, M. (2023). Co-application of biofertilizer and stress-modulating nanoparticles modulates the physiological, biochemical, and yield responses of camelina (Camelina sativa L.) under limited water supply. Journal of Soil Science and Plant Nutrition, 23(4), 6681-6695. https://doi.org/10.1007/s42729-023-01521-y.

Haghaninia, M., Javanmard, A., Radicetti, E., Rasouli, F., Ruiz-Lozano, J.M., & Sabbatini, P. (2024b). Adoption of arbuscular mycorrhizal fungi and biochar for alleviating the agro-physiological response of lavander (Lavandula angustifolia L.) subjected to drought stress. Plant Stress, 12, 100461. https://doi.org/10.1016/j.stress.2024.100461.

Haghaninia, M., Memarzadeh, S., Najafifar, A., Soleimani, F., & Mirzaei, A. (2025). Impact of silicon nanoparticle priming on metabolic responses and seed quality of chia (Salvia hispanica L.) under salt stress. Food Bioscience, 106119. https://doi.org/10.1016/j.fbio.2025.106119.

Haghaninia, M., Rasouli, F., Javanmard, A., Mahdavinia, G., Azizi, S., Nicoletti, R., & Caruso, G. (2024c). Improvement of physiological features and essential oil content of Thymus vulgaris after soil amendment with chitosan nanoparticles under chromium toxicity. Horticulturae, 10(6), 659. https://doi.org/10.3390/horticulturae10060659.

Hajihashemi, S., & Kazemi, S. (2022). The potential of foliar application of nano-chitosan-encapsulated nano-silicon donor in amelioration the adverse effect of salinity in the wheat plant. BMC Plant Biology, 22(1), 148. https://doi.org/10.1186/s12870-022-03531-x.

Hassanpouraghdam, M.B., Abdollahfam, F., Fathi, S., & Mehrabani, L.V. (2023). Foliar application of iron-oxide nanoparticles coated with citral and chitosan enhances the growth and physiological responses of spearmint exposed to salinity stress. Russian Journal of Plant Physiology, 70(6), 130. https://doi.org/10.1134/S102144372360109X.

Heath, R.L., & Packer, L. (1968). Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics, 125(1), 189-198. https://doi.org/10.1016/0003-9861(68)90654-1.

Ibrahim, F.R. (2019). Influence of potassium fertilization and nano-chitosan on growth, yield components and volatile oil production of chamomile (Matricaria chamomilla L.) plant. Journal of Plant Production, 10(6), 435-442. https://dx.doi.org/10.21608/jpp.2019.48289.

Jabeen, Z., Mahmood, B., Rehman, S., Butt, A.M., & Hussain, N. (2024). Biodegradable glycine betaine encapsulated chitosan nanoparticles induce the expression of antioxidant enzyme genes to improve drought tolerance in maize. South African Journal of Botany, 171, 571-582. https://doi.org/10.1016/j.sajb.2024.06.012.

Jafari, S., Garmdareh, S.E.H., & Azadegan, B. (2019). Effects of drought stress on morphological, physiological, and biochemical characteristics of stock plant (Matthiola incana L.). Scientia Horticulturae, 253, 128-133. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2019.04.033.

Jahanafrooz, Z., Mousavi, M.M.H., Akbarzadeh, S., Hemmatzadeh, M., Maggi, F., & Morshedloo, M.R. (2024). Anti-breast cancer activity of the essential oil from grapefruit mint (Mentha suaveolens× piperita). Fitoterapia, 174, 105875. https://doi.org/10.1016/j.fitote.2024.105875.

Khodadadi, F., Ahmadi, F.S., Talebi, M., Moshtaghi, N., Matkowski, A., Szumny, A., & Rahimmalek, M. (2022). Essential oil composition, physiological and morphological variation in Salvia abrotanoides and S. yangii under drought stress and chitosan treatments. Industrial Crops and Products, 187, 115429. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2022.115429.

Kubavat, D., Trivedi, K., Vaghela, P., Prasad, K., Vijay Anand, G.K., Trivedi, H., & Ghosh, A. (2020). Characterization of a chitosan‐based sustained release nanofertilizer formulation used as a soil conditioner while simultaneously improving biomass production of Zea mays (L.). Land Degradation & Development, 31(17), 2734-2746. https://doi.org/10.1002/ldr.3629.

Li, X., Ahammed, G.J., Zhang, X.N., Zhang, L., Yan, P., Zhang, L.P., & Han, W.Y. (2021). Melatonin-mediated regulation of anthocyanin biosynthesis and antioxidant defense confer tolerance to arsenic stress in Camellia sinensis L. Journal of Hazardous Materials, 403, 123922. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2020.123922.

Ludwiczuk, A., Kiełtyka-Dadasiewicz, A., Sawicki, R., Golus, J., & Ginalska, G. (2016). Essential oils of some Mentha species and cultivars, their chemistry and bacteriostatic activity. Natural Product Communications, 11(7), 1934578X1601100736.

Mahmoud, M.A., & Swaefy, H.M. (2020). Comparison between effect of commercial and nano NPK in presence of nano zeolite on sage plant yield and components under drought stress. Zagazig Journal of Agricultural Research, 47(2), 435-457. https://doi.org/10.21608/zjar.2020.94486.

Mahmoud, N., Abdou, M.A., Salaheldin, S., Soliman, W.S., & Abbas, A.M. (2023). The impact of irrigation intervals and NPK/yeast on the vegetative growth characteristics and essential oil content of lemongrass. Horticulturae, 9(3), 365. https://doi.org/10.3390/horticulturae9030365.

Mandoulakani, B.A., Eyvazpour, E., & Ghadimzadeh, M. (2017). The effect of drought stress on the expression of key genes involved in the biosynthesis of phenylpropanoids and essential oil components in basil (Ocimum basilicum L.). Phytochemistry, 139, 1-7. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2017.03.006.

Mohammadi, N., Shariatmadari, H., Khademi, H., & Bazarganipour, M. (2020). Coating of sepiolite-chitosan nanocomposites onto urea increases nitrogen availability and its use efficiency in maize. Archives of Agronomy and Soil Science, 66(7), 884-896. https://doi.org/10.1080/03650340.2019.1643842.

Mohasseli, V., & Sadeghi, S. (2019). Exogenously applied sodium nitroprusside improves physiological attributes and essential oil yield of two drought susceptible and resistant specie of Thymus under reduced irrigation. Industrial Crops and Products, 130, 130-136. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2018.12.058.

Mumivand, H., Ebrahimi, A., Morshedloo, M.R., & Shayganfar, A. (2021). Water deficit stress changes in drug yield, antioxidant enzymes activity and essential oil quality and quantity of tarragon (Artemisia dracunculus L.). Industrial Crops and Products, 164, 113381. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2021.113381.

Napar, W.P.F., Kaleri, A.R., Ahmed, A., Nabi, F., Sajid, S., Ćosić, T., & Gao, Y. (2022). The anthocyanin-rich tomato genotype LA-1996 displays superior efficiency of mechanisms of tolerance to salinity and drought. Journal of Plant Physiology, 271, 153662. https://doi.org/10.1016/j.jplph.2022.153662.

Nikzad, S., Mirmohammady Maibody, S.A.M., Ehtemam, M.H., Golkar, P., & Mohammadi, S.A. (2023). Response of seed yield and biochemical traits of Eruca sativa Mill. to drought stress in a collection study. Scientific Reports, 13(1), 11157. https://doi.org/10.1038/s41598-023-38028-6.

Raza, M.A.S., Zulfiqar, B., Iqbal, R., Muzamil, M.N., Aslam, M.U., Muhammad, F., & Habib-ur-Rahman, M. (2023). Morpho-physiological and biochemical response of wheat to various treatments of silicon nano-particles under drought stress conditions. Scientific Reports, 13(1), 2700. https://doi.org/10.1038/s41598-023-29784-6.

Razavizadeh, R., Adabavazeh, F., & Mosayebi, Z. (2023). Titanium dioxide nanoparticles improve element uptake, antioxidant properties, and essential oil productivity of Melissa officinalis (L.) seedlings under in vitro drought stress. Environmental Science and Pollution Research, 30(43), 98020-98033. https://doi.org/10.1007/s11356-023-29384-x.

Rezaei-Chiyaneh, E., Mahdavikia, H., Alipour, H., Dolatabadian, A., Battaglia, M.L., Maitra, S., & Harrison, M.T. (2023). Biostimulants alleviate water deficit stress and enhance essential oil productivity: A case study with savory. Scientific Reports, 13(1), 720. https://doi.org/10.1038/s41598-022-27338-w.

Riseh, R.S., Vatankhah, M., Hassanisaadi, M., & Varma, R.S. (2024). A review of chitosan nanoparticles: Nature's gift for transforming agriculture through smart and effective delivery mechanisms. International Journal of Biological Macromolecules, 129522. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.129522.

Sadak, M.S., Tawfik, M.M., & Bakhoum, G.S. (2022). Role of chitosan and chitosan-based nanoparticles on drought tolerance in plants: Probabilities and prospects. In Role of chitosan and chitosan-based nanomaterials in plant sciences (pp. 475-501). Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-323-85391-0.00013-7.

Safari, M., Khorasaninejad, S., & Soltanloo, H. (2024). Involvement of abscisic acid on antioxidant enzymes activity and gene expression in Lavandula angustifolia cv. Munstead under drought stress. Acta Physiologiae Plantarum, 46(4), 44. https://doi.org/10.1007/s11738-024-03666-4.

Sahu, S., Gautam, S., Singh, A., Lohani, P., Sharma, C., Pathak, P., & Singh, H. (2023). Synthesis and characterization of chitosan-zinc-salicylic acid nanoparticles: A plant biostimulant. International Journal of Biological Macromolecules, 253, 127602. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.127602.

Salem, T.S., El-Sekhariy, E.M., Zayed, A.M., El-Mezin, A.I., & Mahghoub, N.A. (2024). Effect of chitosan loaded npk nanoparticles and conventional fertilizers on wheat plant growth perameters and production. Journal of Soil and Water Sciences, 9(1), 19-27. https://dx.doi.org/10.21608/jsws.2024.302453.1007.

Sami, M.K., Ali, M.A., Gaber, M.K., Sidky, M., & Farroh, K.Y. (2022). Growth, productivity and quality of sweet basal in relation to minerals, nanoparticles of chitosan for NPK fertilization. Egyptian Academic Journal of Biological Sciences, H. Botany, 13(2), 179-193. https://dx.doi.org/10.21608/eajbsh.2022.279576.

Sharma, A., Wang, J., Xu, D., Tao, S., Chong, S., Yan, D., & Zheng, B. (2020). Melatonin regulates the functional components of photosynthesis, antioxidant system, gene expression, and metabolic pathways to induce drought resistance in grafted Carya cathayensis plants. Science of the Total Environment, 713, 136675. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.136675.

Sheikhalipour, M., Esmaielpour, B., Behnamian, M., Gohari, G., Giglou, M.T., Vachova, P., & Skalicky, M. (2021). Chitosan–selenium nanoparticle (Cs–SeNP) foliar spray alleviates salt stress in bitter melon. Nanomaterials, 11(3), 684. https://doi.org/10.3390/nano11030684.

Soltanbeigi, A., Yıldız, M., Dıraman, H., Terzi, H., Sakartepe, E., & Yıldız, E. (2021). Growth responses and essential oil profile of Salvia officinalis (L.) Influenced by water deficit and various nutrient sources in the greenhouse. Saudi Journal of Biological Sciences, 28(12), 7327-7335. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2021.08.034.

Tashakorizadeh, M., Vahabi, M.R., Golkar, P., & Mahdavian, K. (2022). The singular and combined effects of drought and copper stresses on the morphological traits, photosynthetic pigments, essential oils yield and copper concentration of Fumaria parviflora Lam. Industrial Crops and Products, 177, 114517. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2021.114517.

Wang, J., Li, R., Tan, J., & Jiang, Z.T. (2016). Chemical composition of essential oil of grapefruit mint (Mentha suaveolens× piperita) from China. Journal of Essential Oil Bearing Plants, 19(4), 1047-1050. https://doi.org/10.1080/0972060X.2013.831559.