تاثیر محلول‌پاشی آسکوربیک‌اسید بر عملکرد دانه و برخی صفات بیوشیمیایی گیاه کینوا (Chenopodium quinoa wild) تحت شرایط تنش کم‌آبی

مقدمه

گیاهان در طبیعت به طور مداوم در معرض تنش­های زنده و غیر زنده متعددی قرار دارند. با­توجه­به اثرات زیان­آور این تنش­ها، عملکرد گیاهان در حال کاهش است. بنابراین، به­حداقل­رساندن این تلفات یکی از دغدغه­ های اصلی است. در میان تنش‌های زنده و غیر زنده که گیاهان با آن مواجه می‌شوند، تنش خشکی یکی از نامطلوب‌ترین عواملی است که روی رشد و عملکرد گیاه تاثیر گذاشته و تهدیدی جدی برای تولید پایدار محصول در شرایط تغییر اقلیم به شمار می‌رود (El-Bially et al., 2018). مطالعات متعددی کاهش رشد و عملکرد گیاه کینوا را تحت شرایط تنش خشکی نشان داده است (Aziz et al., 2018;
Elewa et al., 2017b; El-Shamy et al., 2022). کاهش پارامترهای رشدی و عملکرد دانه گیاهان تحت شرایط تنش کم‌آبی در سایر گیاهان مانند کنجد (Ghotbzadeh Kermani et al., 2019) و لوبیا (Gaafar et al., 2020) نیز مشاهده شده است.

از میان چندین گیاه زراعی شناخته­شده به ­دلیل سهم قابل توجهی که در امنیت غذایی دارند، کینوا (Chenopodium quinoa Wild.) یکی از مهم­ترین گیاهان است. کینوا گیاه دانه­ ای آلوتتراپلوئید اقتصادی مهم می­باشد که یکساله است و به عنوان یک محصول شبه غلات علفی در نظر گرفته می­شود. با­توجه ­به اهمیت آن برای امنیت غذایی، سازمان خواربار و کشاورزی ایالات متحده (FAO) سال 2013 را به عنوان سال بین ­المللی کینوا (IYQ2013) اعلام کرد. کینوا یک گیاه حیاتی به ­دلیل اهمیت تغذیه ­ای زیاد و مقاومت بالا در برابر تنش ­های غیر زنده است (Bascunan-Godoy et al., 2016). دانه‌های آن دارای محتوای بالایی از اسیدهای چرب، ویتامین‌ها، مواد معدنی، فلاونوئیدها، فیبرهای غذایی و پلی‌فنول‌ها هستند (Alvarez-Jubete et al., 2010).

تنش­های محیطی مختلف منجر به تولید بیش از حد گونه­های فعال اکسیژن (ROS[1]) می­شود که سبب آسیب اکسیداتیو، پراکسیداسیون پلاسمالما، جهشDNA، دناتوره­شدن پروتئین و در نهایت مرگ سلولی می­شود (Sharma et al., 2012). گیاهان برای مقابله با اثرات زیان­آور ROS سیستم­های دفاعی آنزیمی و غیر آنزیمی را به کار می­برند. سیستم دفاعی غیر آنزیمی شامل مولکول­های آنتی­اکسیدان مانند آسکوربیک­اسید، کاروتنوئیدها، گلوتاتیون، پرولین و α-توکوفرول­ها می‌باشد. این سیستم‌های دفاعی آنتی‌اکسیدانی برای کنترل آبشارهای اکسیداسیون کنترل‌نشده بسیار کارآمد هستند و سلول‌های گیاهی را در برابر آسیب‌های اکسیداتیو با حذف ROS حفاظت می­کنند (Gill & Tuteja, 2010). پرولین به تثبیت ساختارهای درون­سلولی (به عنوان مثال، غشاها و پروتئین­ها)، از بین بردن رادیکال­های آزاد و بافر پتانسیل سلولی در شرایط تنش کمک می­کند. همچنین به عنوان یک آنتی­اکسیدان و مهارکننده گونه­های فعال اکسیژن (ROS) عمل می­کند (Ghosh et al., 2021). محققان متعددی در گیاه کینوا و سایر گیاهان گزارش کرده­اند که تنش خشکی، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان و تجمع پرولین و کربوهیدرات را افزایش داده که نشان­دهنده پاسخ گیاهان به تنش اکسیداتیو است (Askari & Ehsanzadeh, 2015; Khazaei et al., 2020; Gholami et al., 2021).

برای بهبود تحمل گیاه به تنش خشکی در طول چند دهه اخیر، به موازات اصلاح سنتی و تکنیک­های بیوتکنولوژی، استراتژی­های متعددی برای بهبود عملکرد گیاه در محیط­های تنش خشکی پیشنهاد شده است. این تکنیک­ها شامل تیمار قبل از کاشت بذر یا محلول­پاشی با آنتی­اکسیدان­ها، ویتامین­ها و ترکیب­های محافظت­کننده اسمزی مانند گلایسین بتائین، پرولین، آسکوربیک­اسید یا ترهالوز است (Elewa et al., 2017). آسکوربیک­اسید به عنوان یک آنتی­اکسیدان، یک کوفاکتور آنزیمی و یک پیش‌ساز برای سنتز اگزالات و تارتارات عمل می­کند (Rigano et al., 2017). آسکوربیک­اسید اساساً به عنوان کاهش­دهنده عمل می­کند و بسیاری از انواع رادیکال­های آزاد را از بین می­برد (Ahmad et al., 2010). ویتامین‌ها تأثیر مطلوبی بر افزایش تقسیم سلولی و سنتز هورمون­های گیاهی نظیر سیتوکنین‌ها و جیبرلین‌ها دارند (Abdelhamid et al., 2013). آسکوربیک­اسید تحمل به تنش کم‌آبی را از طریق فرایندهای فیزیولوژی و بیوشیمیایی در گیاهان بهبود می‌بخشد (Gaafar et al., 2020).

با مطالعه آفتابگردان تحت شرایط تنش کم‌آبی گزارش شد که محتوای کلروفیل برگ و مقادیر عملکرد دانه در گیاهان تیمار­شده با آسکوربیک­اسید در مقایسه با گیاهان تیمار­نشده افزایش نشان داد که نقش مثبت آسکوربیک­اسید را در کاهش اثرات نامطلوب تنش کم‌آبی آشکار کرد (El-Bially et al., 2018). در مطالعه دیگری بهبود محتوای پرولین، کلروفیل، کاروتنوئید و کربوهیدرات­های محلول در گیاه فلفل با محلول­پاشی آسکوربیک­اسید مشاهده شد (Khazaei et al., 2020). در گیاه کینوا نیز بهبود رشد گیاه و فعالیت آنزیم­ها و مولکول­های آنتی­اکسیدان با محلول­پاشی آسکوربیک­اسید به دست آمد (Aziz et al., 2018).

این تحقیق به منظور بررسی تاثیر محلول­پاشی آسکوربیک­اسید بر عملکرد دانه و برخی از صفات فیزیولوژیک گیاه کینوا تحت شرایط تنش کمبود آب انجام شد.

2. روش‎شناسی پژوهش

این تحقیق در ایستگاه مرکز تحقیقات و کشاورزی و منابع طبیعی کرمان واقع در ۲۲ کیلومتری جنوب شهر کرمان با موقعیت جغرافیایی ۵۷ درجه، ۴ دقیقه و 55 ثانیه طول شرقی و 30 درجه، 17 دقیقه و 21 ثانیه عرض شمالی و ارتفاع ۱۸۳۰ متر از سطح دریا روی گیاه کینوا انجام شد. این ناحیه آب و هوای خشک و نیمه­معتدل داشته و متوسط بارندگی سالیانه آن در حدود ۱۵۰ میلی‌متر در سال‌های پر­باران است. میانگین بارندگی در ماه‌های مربوط به سال‌های 1399 و 1400 در جدول 1 آمده است. حداقل و حداکثر متوسط دمای سالیانه آن به­ترتیب 14- و ۴۰+ درجه سانتی­گراد می­باشد. بافت خاکی مزرعه شنی­لومی و pH خاک نیز معادل ۷/۷ بود (جدول 2).

آزمایش به صورت کرت­های خرد­شده در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی با سه تکرار در دو سال 1399 و 1400 اجرا شد. عامل اصلی شامل سه سطح تیمار آبیاری شامل: آبیاری تا مرحله رسیدگی کامل (شاهد)، آبیاری تا شروع مرحله گلدهی و آبیاری تا شروع مرحله خمیری و عامل فرعی شامل دو سطح محلول­پاشی آسکوربیک­اسید (صفر و 2 میلی­مولار) بود. عرض و طول کرت­ها 4/2 در 3 متر، فاصله بین کرت­ها یک متر و فاصله بین بلوک­ها سه متر و هر کرت فرعی شامل 4 ردیف کاشت بود. فاصله بین ردیف­ها 60 سانتی­متر و فاصله بین بوته­ها در هر خط کاشت 10 سانتی­متر بود. آبیاری قبل از کاشت و بعد از سبز­شدن هفته‌ای یک­بار تا شروع مرحله گلدهی برای شرایط تنش شدید انجام شد. در شرایط تنش ملایم آبیاری تا مرحله خمیری نرم ادامه داشته و سپس قطع شد. برای شرایط نرمال نیز آبیاری تا رسیدگی فیزیولوژیکی ادامه داشت. برای کاشت ابتدا خاک مزرعه تسطیح و شخم به عمق 30 سانتی­متر با گاوآهن قلمی انجام شد. میزان کود مصرفی نیز بسته به آزمایش خاک تعیین شد. به دلیل بیماری بوته­میری قبل از کاشت، بذور با قارچ­کش ضدعفونی شدند.

جدول 1. میانگین بارندگی در ماه‌های مربوط به سال 1399 و 1400 در شهرستان کرمان (بر حسب میلی‌متر)

جدول 2. نتایج خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک مزرعه (عمق 60-0 سانتی‌متر)

عملیات کاشت در تاریخ 15 مرداد­ماه و در عمق یک سانتی­متری با دست انجام شد. مبارزه با علف­های هرز نیز صورت گرفت، چون در هفته اول کشت که رشد گیاه کینوا به­کندی صورت می­گیرد، مبارزه با علف­های هرز ضروری است. محلول­پاشی آسکوربیک­اسید در دو مرحله یک­بار در مرحله شروع گلدهی و بار دوم 2 هفته پس از محلول­پاشی نوبت اول با استفاده از سم­پاش دستی در غروب آفتاب انجام شد. عملیات برداشت پس از زرد­شدن بوته­ها و رسیدگی فیزیولوژیک در تاریخ 25 آبان­ماه به­صورت دستی انجام و عملکرد دانه (گرم در متر مربع) برای هر واحد آزمایشی محاسبه شد.

1-2. صفات مورد بررسی

2-1-1. عملکرد دانه: برای اندازه­گیری عملکرد دانه، کل بوته­های هر واحد آزمایشی به غیر از حاشیه پس از رسیدگی فیزیولوژیک برداشت شده و بر حسب گرم در متر مربع بیان شد.

2-1-2. میزان کلروفیل a‌‌، کلروفیل b و کاروتنوئیدها: ۲۰ میلی‌لیتر استون 80 درصد به نیم گرم ماده گیاهی پودر­شده اضافه و با سرعت 6000 دور در دقیقه به ­مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. فاز بالایی به بالن شیشه­ای منتقل و مقداری از آن را در کووت اسپکتروفتومتر ریخته و به­طور جداگانه در طول موج‌های 663 نانومتر برای کلروفیل a، ۶۴۵ نانومتر برای کلروفیل b و 470 برای کارتنوئیدها مقدار جذب قرائت شد.

در نهایت با استفاده از فرمول­های زیر میزان کلروفیلa ، b و کاروتنوئیدها بر حسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر نمونه به دست آمد.

در این روابط A میزان جذب در طول ‌موج مورد نظر، V حجم نهایی استون 80 درصد برحسب میلی­لیتر وW  اندازه برگ برحسب گرم می­باشد (Lichtenthaler & Wellburn, 1985).

2-1-3. محتوای پرولین: اندازه­گیری میزان پرولین برگ با استفاده ازروش Bate et al. (1973) به شرح زیر انجام شد: 05/0 گرم از بافت برگ در ۵ میلی­لیتر محلول اسید­سولفوسالیسیلیک 3 درصد ساییده شده و محلول با کاغذ صاف شد. سپس 3 میلی­لیتر از عصاره صاف­شده با ۲ میلی­لیتر محلول اسید­ناین­هیدرین و 2 میلی­لیتر اسید­استیک مخلوط و به مدت ۳۰ دقیقه در دمای 100 درجه سانتی­گراد قرار داده شد و پس از آن لوله­ها به حمام یخ منتقل شدند. بعد از آن به لوله­ها ۶ میلی لیتر تولوئن اضافه کرده و لوله­ها به­خوبی تکان داده شدند و بعد از حدود ۲۰ ثانیه دو فاز مجزا تشکیل شد. از فاز بالایی برای اندازه­گیری میزان پرولین در طول موج ۵۲۹ نانومتر استفاده شد. میزان پرولین استخراجی بر اساس میکرومول در گرم وزن تر از جدول استاندارد استخراج شد.

2-1-4. محتوای پروتئین برگ: برای اندازه­گیری محتوای پروتئین برگ ابتدا معرف برادفورد آماده شد. سپس به 100 میکرولیتر عصاره­ی گیاهی مقدار 5 میلی­لیتر از معرف برادفورد افزوده شد. پس از دو دقیقه، میزان جذب آن در طول موج 595 نانومتر قرائت شد. بر اساس مقایسه با منحنی استاندارد، غلظت پروتئین بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن تر گزارش شد
 (Bradford, 1976).

2-1-5. محتوای کربوهیدرات: برای اندازه­گیری میزان کربوهیدرات ۱۰ میلی‌لیتر اتانول ۹۵ درصد به 2/0 گرم بافت تازه نمونه اضافه شده و سپس نمونه­ها در حمام آب گرم به مدت یک ساعت با دمای ۸۰ درجه سانتی­گراد قرار داه شد. پس از آن به یک میلی­لیتر از محلول به­دست­آمده یک میلی­لیتر فنل 5/0 درصد و 5 میلی­لیتر اسید­سولفوریک ۹۸ درصد اضافه شد و جذب آن در طول موج ۴۸۳ نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. میزان کربوهیدرات استخراجی بر اساس منحنی استاندارد گلوکز به دست آمد (Keles & Oncle, 2004).

2-1-6. محتوای نسبی آب برگ: نیم گرم از جوان­ترین برگ توسعه­یافته بوته هر کرت آزمایشی برداشت شده و وزن آن با استفاده از ترازوی دیجیتال با دقت 001/0 گرم به دست آمد (FW). سپس نمونه­ها به­مدت ۲۴ ساعت درون آب مقطر شناور شده و در تاریکی و دمای اتاق نگه­داری شدند و بعد از آن با استفاده از ترازوی دیجیتال با دقت 001/0 گرم توزین شد تا وزن در هنگام تورژسانس (TW) به دست آید. پس از آن برگ­ها در آون ۶۰ درجه سانتی­گراد به­مدت ۲۴ ساعت قرار گرفته تا وزن خشک (DW) حساب شود. RWC از طریق معادله زیر محاسبه شد (Ritchi & Nguyen, 1990).

RWC= (FW-DW)/ (TW-DW) ×100

2-2. تجزیه و تحلیل داده­ها

ابتدا داده­ها در نرم­افزار Minitab نسخه 18 از نظر نرمال­بودن مورد بررسی قرار گرفت، بدین­صورت که ابتدا تست نرمالیتی داده‌ها با استفاده از روش کولموگراف اسمیرناف انجام و پس از تأیید نرمال­بودن داده‌ها، خطاها از نظر نرمال­بودن بررسی شدند. همگنی خطاهای آزمایشی با استفاده از آزمون بارتلت نیز بررسی شد. سپس تجزیه واریانس مرکب کلیه صفات و آزمون مقایسه میانگین به روش LSD در سطح پنج درصد با نرم­افزار  SASنسخه 2/9 انجام شد (SAS 2010).

3. یافته­های پژوهش و بحث

نتایج تجزیه واریانس عملکرد دانه و صفات بیوشیمیایی اندازه­گیری­شده در جدول 3 آورده شده است. نتایج نشان داد که سال و اثر متقابل آن با هر دو عامل تیمار آبیاری و آسکوربیک­اسید روی کلیه صفات اندازه­گیری شده تاثیر معنی­داری نداشت. بنابراین عکس­العمل صفات در دو سال زراعی متفاوت نبوده است. اثر تیمار آبیاری روی کلیه صفات به غیر از محتوای کاروتنوئیدها معنی­دار بود. اثر عامل آسکوربیک­اسید روی کلیه صفات معنی­دار بود. اثر متقابل این دو عامل نیز روی کلیه صفات به­استثنای عملکرد دانه و محتوای کربوهیدرات معنی­دار بود که نشان­دهنده این است که واکنش تیمارهای آبیاری برای این صفات به سطوح مختلف عامل آسکوربیک­اسید متفاوت بوده است.

جدول 3. تجزیه واریانس عملکرد دانه و صفات بیوشیمیایی گیاه کینوا تحت سه تیمار آبیاری (A) و دو سطح آسکوربیک­اسید (B) در دو سال (Y).

ns: غیر معنی­دار، * و **: به­ترتیب معنی­دار در سطح احتمال پنج و یک درصد.

مقایسه میانگین عملکرد دانه و محتوای کربوهیدرات در تیمارهای مختلف آبیاری نشان داد که متناسب با تنش خشکی مقادیر عملکرد دانه کاهش و محتوای کربوهیدرات افزایش داشتند (جدول 4). عملکرد دانه 7/18 و 5/40 درصد به­ترتیب در شرایط تنش ملایم (آبیاری تا شروع مرحله خمیری) و تنش شدید (آبیاری تا شروع مرحله گلدهی) نسبت به شرایط غیر تنش (آبیاری تا مرحله رسیدگی کامل) کاهش نشان دادند.

جدول 4. مقایسه میانگین عملکرد دانه و محتوای کربوهیدرات گیاه کینوا در تیمارهای مختلف آبیاری.

برای هر صفت میانگین­هایی که حداقل دارای یک حرف مشترک هستند، تفاوت معنی­داری بر اساس آزمون LSD در سطح احتمال پنج­درصد ندارند.

مطابق با نتایج این تحقیق، Elewa et al. (2017b)، (Aziz et al. (2018 و (El-Shamy et al. (2022 کاهش پارامترهای رشدی، عملکرد دانه و اجزای آن را در گیاه کینوا تحت تنش خشکی مشاهده کردند. سایر محققان نیز در گیاهان مختلف اثرات منفی تنش خشکی بر عملکرد دانه را گزارش کردند (Dolatabadian et al., 2010; Gaafar et al., 2020). در شرایط تنش کم‌آبی، تلفات جدی برای فرآیندهای رشد گیاه رخ می‌دهد و تقسیم سلولی، تکثیر سلولی و مراحل بلوغ سلولی به­طور قابل توجهی مختل می­شود. رنگدانه‌های فتوسنتزی تحت شرایط تنش شدید آب کیفیت خود را از دست داده و در نتیجه باعث کاهش عملکرد محصول می‌شوند (Kapoor et al., 2020).

بیشترین و کمترین محتوای کربوهیدرات به­ترتیب در شرایط تنش شدید و غیر تنش به دست آمد (جدول 4). طبق نتایج این تحقیق، افزایش محتوای کربوهیدرات در گیاه کلزا نیز تحت شرایط تنش کمبود آب مشاهده شد (Farahani et al., 2020). گزارش شده است که کربوهیدرات­های محلول کل تحت تنش خشکی در کتان افزایش یافته که نقش مهمی در تنظیم اسمزی، ذخیره کربن و مهار رادیکال داشتند (Bakry et al., 2012).

محلول­پاشی با آسکوربیک­اسید منجر به بهبود عملکرد دانه و محتوای کربوهیدرات شد. عملکرد دانه با محلول­پاشی این ماده 7/22 درصد افزایش داشت (جدول 5). آسکوربیک­اسید یک آنتی­اکسیدان غیر آنزیمی است که گیاهان برای حفاظت خود از آسیب اکسیداتیو از طریق مهار و حذف گونه­های فعال اکسیژن (ROS) استفاده می­کنند (Gill &Tuteja, 2010). آسکوربیک­اسید در فرآیندهای متعددی شامل فتوسنتز، رشد دیواره سلولی، توسعه سلول، مقاومت به تنش­های محیطی و سنتز اتیلن، جیبرلین­ها، آنتوسیانین و هیدروکسیل پرولین شرکت می­کند (Smirnoff & Wheeler, 2000). از­این­رو ماده مناسبی برای افزایش عملکرد در گیاهان می­باشد. گزارش شده است که کاربرد غلظت‌های مختلف آسکوربیک­اسید در شرایط تنش خشکی در گیاه کینوا سبب بهبود عملکرد، محتوای نسبی آب و شاخص‌های رشدی گیاه شد (Mahdavi Rad et al., 2022).

جدول 5. مقایسه میانگین عملکرد دانه و محتوای کربوهیدرات گیاه کینوا برای فاکتور آسکوربیک­اسید.

برای هر صفت میانگین­هایی که حداقل دارای یک حرف مشترک هستند، تفاوت معنی­داری بر اساس آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد ندارند.

محقق دیگری افزایش پارامترهای رشدی با کاربرد آسکوربیک­اسید در گیاه ذرت تحت هر دو شرایط تنش و غیر تنش خشکی مشاهده کرده و بیان کردند که این افزایش رشد در نتیجه تاثیر آسکوربیک­اسید روی تقسیم سلولی است و هم­چنین آسکوربیک­اسید به­عنوان یک مولکول آنتی­اکسیدان، اثرات زیان­آور تنش خشکی را کاهش می­دهد. آن­ها همچنین افزایش وزن دانه را با کاربرد آسکوربیک­اسید در گیاهان تنش دیده و گیاهان رشد­کرده در شرایط نرمال گزارش کرده و اظهار داشتند که این افزایش می­تواند به سبب افزایش فتوسنتز و انتقال آسیمیلات­ها به دانه در نتیجه کاهش اثرات تنش خشکی مربوط به آسکوربیک­اسید باشد (Dolatabadian et al., 2010). گزارش شده است که محلول­پاشی با آسکوربیک­اسید اثرات نامطلوب تنش خشکی روی صفاتی مانند بسته­شدن روزنه­ها، جذب مواد غذایی، کلروفیل کل، سنتز پروتئین، فرآیند فتوسنتز و رشد گیاه را کاهش می­دهد
 (Hafez & Gharib, 2016).

مقایسه میانگین اثر متق