مقدمه

فلزات سنگین عوارض متعددی را در ارگان‌های مختلف بدن پستانداران ایجاد می‌کنند. رشد جمعیت، افزایش صنعتی شدن جوامع و تردد وسایل نقلیه موتوری را می‌توان از جمله عوامل انتشار فلزات سنگین در محیط زیست دانست. سرب یک فلز بسیار سمی است که در محیط زیست به وفور یافت می‌شود و در دوزهای بسیار پایین نیز می‌تواند اختلالاتی در ارگان‌ها و اندام‌های بدن ایجاد کند (1). از جمله کاربردهای سرب در صنایع امروزی می‌توان به اتومبیل‌سازی، نظامی، تولید ضدزنگ، تهیه باطری، بنزین‌های حاوی سرب و ... اشاره کرد که موجب می‌شود افراد بویژه کارگران در مواجهه مستقیم و یا غیرمستقیم با سرب قرار گیرند (2). Garu و همکاران در سال 2011 و Rafati Rahimzadeh و همکاران در سال 2015 بیان کردند که فلزات سنگین قادر هستند از غشاء سلول عبور کنند و با تجمع در بافت‌های نرم از جمله تخمدان، موجب اختلال در عملکرد فیزیولوژی، تغییرات بافتی، تغییر در رشد فولیکول‌ها و کم و زیاد شدن دوره تخمک‌گذاری آن‌ها شوند (3،4). ساختمان کروی یا بیضی شکل تخمدان‌ها از دو ناحیه قشری و مرکزی تشکیل شده است. ناحیه مرکزی شامل بافت همبند فیبروزی متراکم و عروق خونی است در حالی‌که ناحیه قشری دارای انواع فولیکول‌های در حال رشد، جسم زرد، بافت بینابینی و عروق خونی می‌باشد. فولیکول‌ها در بخش قشری تخمدان قرار گرفته و هسته اووسیت‌ها دارای کروماتین و یک هستک مشخص می‌باشد. زونا پلوسیدا در اطراف اووسیت حضور داشته و توسط لایه گرانولوزا احاطه شده است. لایه‌های تک داخلی و خارجی نیز لایه گرانولوزا را احاطه می‌کنند (5). ‌ Waseemو همکاران در سال 2014 گزارش کردند که مواجهه با استات سرب سبب کاهش مقدار فولیکول‌های تخمدانی اولیه و بالغ در موش‌های نژاد Balbc شد (6). Patriarca و همکاران در سال 2000، Antonio-Garcia  و Masso-Gonzalez در سال 2008، Dumitrescu و همکاران در سال 2015، نشان دادند که سرب توانایی عبور از سد خونی- جفتی را دارد و بدین طریق سبب تأخیر در تکوین جنین می‌شود و اثرات تراتوژنیک در آن ایجاد می‌کند. آن‌ها در ادامه بیان کردند که تجمعات سرب در بافت‌های تخمدان، لوله‌های رحمی و رحم موجب تغییرات بافتی، تغییر مراحل تکوین فولیکول و ناباروری می‌شود؛ همچنین آلودگی مادر به سرب از طریق شیر به نوزادان قابل انتقال است (9-7).

Bassit  و همکاران در سال 2020، با مطالعه اثر سمیت سرب با دوز 640 میلی‌گرم بر کیلوگرم بر تکامل تخمدان، از روز 10ام آبستنی تا 21 روز بعد از تولد، بیان کردند که سرب سبب کاهش اندازه تخمدان، بی‌نظمی در بافت پوششی، آسیب انواع فولیکول‌ها، تخریب سلول‌های گرانولوزا و کوچک شدن هسته تخمک می‌شود (10).  Sodani در سال 2017 اثرات مضر استات سرب بر بافت تخمدان موش‌های آلبینو به روش استریولوژی را بررسی و نشان داد که مصرف استات سرب با دوز پایین سبب تغییرات هیستوپاتولوژیک از قبیل دژنره شدن اووسیت، ناحیه شفاف، تغییرات دژنراتیو سلول‎های تاجی و افزایش تعداد فولیکول‌های آترتیک می‌شود اما تغییر معنی‌داری در تعداد فولیکول‌ها ایجاد نمی‌کند (11).

 با توجه به گسترش روزافزون آلودگی با سرب در جامعه کنونی تلاش‌های بسیاری برای کاهش آلودگی مادران، زنان باردار و کودکان صورت گرفته است، اما اجتناب از در معرض قرار گرفتن سرب تقریباً غیرممکن می‌باشد. هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر آلودگی سرب با دوز پایین در مادر بر روی تکوین تخمدان موالید با استفاده از تکنیک استریولوژی در مدل حیوانی رت می‌باشد که براساس مطالعات حاضر تاکنون انجام نشده است. نتایج مطالعه حاضر می‌تواند در ارزیابی کمی تغییرات بافت تخمدان متعاقب مسمومیت با سرب و اتخاذ روش‌های مناسب جهت محافظت مادران از مسمومیت با سرب و اثرات آن بر تخمدان موالید مفید باشد.

مواد و روش کار

در مطالعه حاضر، رت‌های نر و ماده بالغ نژاد ویستار از انیستیتو پاستور خریداری شدند و در آزمایشگاه جنین‌شناسی و بافت‌شناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران با حفظ شرایط استاندارد (12 ساعت روشنایی، 12 ساعت تاریکی، دمای 26-20 درجه سانتی‌گراد و آب و غذای کافی) نگهداری شدند. جهت از بین رفتن استرس احتمالی ناشی از تغییر محل زندگی، رت‌ها به مدت یک هفته با شرایط مذکور نگهداری شدند تا به محیط جدید عادت کنند. در تمام مراحل مطالعه موازین اخلاقی نگهداری و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی رعایت شد. انجام این طرح با شماره ثبت 17/6/30029 مورد تأیید قرار گرفت. برای جفت‌گیری، در هر قفس به‌ازای هر حیوان نر، دو حیوان ماده در نظر گرفته شد و پس از گذشت 12 ساعت از جفت‌گیری، پلاک واژنی (Vaginal plaque) مورد بررسی قرار گرفت. همچنین از واژن رت‌های ماده به‌وسیله سوآپ اسمیر تهیه و سپس با ائوزین رنگ‌آمیزی و در زیر میکروسکوپ بررسی شد تا در صورت مشاهده اسپرم، آن روز به عنوان روز صفر آبستنی در نظر گرفته شود (0=P). پس از جداسازی رت‌های بارور، آن‌ها به صورت تصادفی در پنج گروه مختلف قرار گرفتند. مادران تمام موالید گروه‌های تجربی، استات سرب را به صورت 2/0 درصد در آب آشامیدنی دریافت کردند. جهت جلوگیری از رسوب استات سرب از اسیداستیک گلاسیال استفاده شد (14-12). گروه‌ها شامل گروه کنترل: رت مادر به آب آشامیدنی نرمال (1 لیتر آب + 5/0 میلی‌لیتر/ لیتر اسیداستیک گلاسیال) در دوران قبل آبستنی، آبستنی و شیرواری دسترسی داشت. تعداد رت‌های موالید گروه کنترل 5 عدد بود.

• رت مادر با استات سرب 2/0 درصد یا 2 گرم + 1 لیتر آب آشامیدنی+ 5/0 میلی‌لیتر/ لیتر اسیداستیک گلاسیال به مدت 30 روز قبل از جفت‌گیری تیمار شد. تعداد رت‌های موالید گروه پیش‌آبستنی 3 عدد بود.
• گروه آبستنی: رت مادر در طول دوره 21 روز با استات سرب 2/0 درصد یا 2 گرم+ 1 لیتر آب آشامیدنی+ 5/0 میلی‌لیتر/ لیتر اسیداستیک گلاسیال تیمار شد. تعداد رت‌های موالید این گروه 4 عدد بود.
• گروه شیرواری: رت مادر در طی 21 روز دوره شیرواری با استات سرب 2/0 درصد یا 2 گرم+ 1 لیتر آب آشامیدنی+ 5/0 میلی‌لیتر/لیتر اسیداستیک گلاسیال تیمار شد. تعداد موالید این گروه 4 عدد بود.
• گروه پیش‌آبستنی-آبستنی-شیرواری: رت مادر 30 روز قبل از آبستنی تا انتهای دوره شیرواری (به مدت 72 روز) با استات سرب 2/0 درصد یا 2 گرم+ 1 لیتر آب آشامیدنی+ 5/0 میلی‌لیتر/ لیتر اسیداستیک گلاسیال تیمار شد. تعداد موالید این گروه 5 عدد بود.

پس از پایان دوره شیرواری یعنی 21 روز بعد از تولد، موالید از رت‌های مادر جدا و جنس‌های نر و ماده نیز از هم جدا شدند. رت‌های ماده جهت رسیدن به بلوغ تا پایان روز 65ام نگهداری شدند. سپس رت‌های موالید ماده با استفاده از 300  میلی‌گرم/کیلوگرم بر وزن بدن کتامین 10 درصد (شرکت آلفاسان هلند) و 30 میلی‌گرم/کیلوگرم بر وزن بدن زایلازین (شرکت آلفاسان هلند) آسان‌کشی شدند (9). جهت انجام مراحل استریولوژی، نرمال‌سالین و متعاقب آن پرفیوژن پارافرمالدهید 4 درصد از بطن چپ قلب تزریق شد. تخمدان‌های چپ و راست خارج  و در پارافرمالدهید 4 درصد غوطه‌ور شدند. بعد از گذشت 24 ساعت جهت تثبیت بهتر فرمالین‌ها تعویض شدند. وزن تخمدان‌های چپ با ترازوی دیجیتال ثبت و پس از انجام مراحل پاساژ بافتی با تکنیک ارینتیتور (Oriantator) و با دستگاه تیشوپروسسور (Tissue processor DS2080/H) قالب‌گیری شدند. از قالب‌های پارافینی با استفاده از روش نمونه‌برداری تصادفی یکنواخت سیستماتیک (Random Sampling Systematic Uniform) برش‌هایی به ضخامت 7 میکرومتر تهیه و با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‌آمیزی شدند. از برش‌های بافتی تهیه شده به منظور انجام استریولوژی، تصاویری با میکروسکوپ نوری مدل Jenamed2 تهیه شد. تصاویر با استفاده از نرم‌افزار Axiovision مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند (تصویر 1،2). حجم متوسط فولیکول‌های آنترال و پره‌آنترال و حجم متوسط اووسیت‌های آن‌ها با استفاده از روش‌های نوکلئاتور و فرمول 1 محاسبه شدند. در این فرمول I بیانگر متوسط شعاع‌های فولیکول و اووسیت از مرکز هسته و V نشان‌دهنده‌ حجم متوسط فولیکول و اووسیت  می‌باشد (15). آنالیز نتایج به‌دست آمده با استفاده از نرم‌افزار spss نسخه 24 انجام شد. برای آنالیز آماری از آزمون کولموگروف - اسمیرنوف استفاده شد. در صورت توزیع نرمال داده‌ها، از آزمون‌های آماری پارامتری آنووا یک‌طرفه و آزمون تکمیلی توکی و در صورت توزیع غیرنرمال داده‌ها از آزمون‌های آماری غیرپارامتری کروسکال والیس و من‌ویتنی برای مقایسه بین گروه‌ها استفاده و مقدار 05/0P<  به عنوان معیار معنی‌داری در نظر گرفته شد.

نتایج

حجم اووسیت: بررسی نتایج حجم اووسیت در فولیکول‌های مقدماتی در گروه‌های کنترل، پیش‌آبستنی، آبستنی، شیرواری و پیش‌آبستنی-آبستنی-شیرواری (تصویر 3)، نشان داد که گروه شیرواری نسبت به سایر گروه‌ها افزایش معنی‌دار داشت (00/0P<).

بررسی نتایج حجم اووسیت در فولیکول‌های اولیه تک‌لایه در گروه‌های کنترل، پیش‌آبستنی، آبستنی، شیرواری و پیش‌آبستنی-آبستنی-شیرواری (تصویر 4)، نشان داد که گروه شیرواری نسبت به گروه کنترل (00/0P<) و گروه آبستنی (01/0P<) افزایش معنی‌دار داشت.

بررسی نتایج حجم اووسیت در فولیکول‌های اولیه چندلایه در گروه‌های کنترل، پیش‌آبستنی، آبستنی، شیرواری و پیش‌آبستنی-آبستنی-شیرواری (تصویر 5)، نشان داد که گروه شیرواری نسبت به گروه‌های آبستنی (004/0P<) و گروه پیش‌آبستنی-آبستنی-شیرواری (007/0P<) افزایش معنی‌دار داشت اما نسبت به سایر گروه‌ها معنی‌دار نبود.

بررسی نتایج حجم اووسیت در فولیکول‌های آنترال در گروه‌های کنترل، پیش‌آبستنی، آبستنی، شیرواری و پیش‌آبستنی-آبستنی-شیرواری (تصویر 6)، نشان داد که مقادیر در گروه شیرواری نسبت به سایر گروه‌ها افزایش داشت اما تنها با گروه پیش‌آبستنی-آبستنی-شیرواری  این اختلاف معنی‌دار بود (036/0P<).

حجم فولیکول: بررسی نتایج حجم فولیکول‌های مقدماتی در گروه‌های کنترل، پیش‌آبستنی، آبستنی، شیرواری، و پیش‌آبستنی-آبستنی-شیرواری (تصویر 7)، نشان داد که گروه شیرواری نسبت به سایر گروه‌ها افزایش معنی‌دار داشت (00/0P<).

بررسی نتایج حجم فولیکول‌های اولیه تک‌لایه در گروه‌های کنترل، پیش‌آبستنی، آبستنی، شیرواری و پیش‌آبستنی-آبستنی-شیرواری (تصویر 8)، نشان داد که مقادیر گروه شیرواری نسبت به گروه‌های دیگر افزایش داشت که اختلاف آن تنها با گروه کنترل معنی‌دار بود (01/0P<).

بررسی نتایج حجم فولیکول‌های اولیه چند‌لایه (تصویر 9) و حجم فولیکول‌های آنترال (تصویر 10)، در گروه‌های‌ کنترل، پیش‌آبستنی، آبستنی، شیرواری و پیش‌آبستنی-آبستنی-شیرواری، اختلاف معنی‌داری بین گروه‌ها مشاهده نشد.

بحث

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که حجم متوسط اووسیت فولیکول‌های مقدماتی، اولیه تک‌لایه و اولیه چند لایه در گروه شیرواری نسبت به گروه کنترل و سایر گروه‌های تجربی افزایش داشت. حجم متوسط اووسیت فولیکول آنترال در گروه شیرواری نسبت به گروه کنترل و سایر گروه‌های تجربی افزایش داشت که اختلاف آن فقط با گروه پیش‌آبستنی-آبستنی-شیرواری معنی‌دار بود. مقایسه حجم متوسط فولیکول‌های مقدماتی و اولیه تک‌لایه در گروه‌ شیرواری نسبت به گروه کنترل و سایر گروه‌های تجربی افزایش معنی‌دار داشت اما در حجم متوسط فولیکول اولیه چندلایه و آنترال اختلاف معنی‌داری بین گروه‌ها مشاهده نشد. براساس نتایج به‌دست آمده در مطالعه حاضر اثر سرب در گروه‌های شیرواری بیشتر از سایر گروه‌های مورد مطالعه مشهود بود. به عبارتی سرب به دلیل انتقال از طریق شیر به نوزادان، می‌تواند در بافت نرم تخمدان رسوب کرده و رشد فولیکول‌ها را تحت‌تأثیر قرار دهد. همچنین سرب توانایی عبور از غشاء سلول‌ها را داشته و می‌تواند با ورود به فولیکول‌ها و اووسیت آن‌ها، تغییراتی در سلول‌های گرانولوزا ایجاد کند و رشد فولیکول‌ها را تحت ‌تأثیر قرار دهد و در نهایت موجب تغییر در حجم فولیکول‌ها و حجم اووسیت شود. Nampoothiri  و Gupta در سال2006، مطالعه‌ای جهت ارزیابی اثر همزمان سرب و کادمیوم انجام دادند. نتایج این مطالعه نشان داد سلول‌های گرانولوزا در گروه دریافت‌کننده سرب کاهش یافته که می‌تواند سبب کاهش حجم فولیکول شود (16).  Sharmaو Bhattacharya در سال 2014، کاهش قطر فولیکول‌ها را متعاقب مصرف استات سرب (با دوز 25/1 میلی‌گرم بر کیلوگرم به مدت 30 روز)، گزارش کردند (17). مطالعات گسترده‌ای که اثرات استات سرب را با دوزهای مختلف بر حجم متوسط فولیکول‌ها و حجم متوسط اووسیت‌ها نشان دهد، صورت نگرفته است؛ اما مطالعات دیگری وجود دارد که تأثیر دارو یا مواد دیگری را بر حجم متوسط فولیکول و حجم متوسط اووسیت نشان می‌دهد که از جمله آن‌ها می‌توان به مطالعه Soleimani Mehranjani و همکاران در سال 2010 اشاره کرد. در این مطالعه اثرات ویتامین E بر روی بافت تخمدان رت به دنبال مهار با پارانونیل فنول به روش استریولوژی ارزیابی شد. نتایج این مطالعه نشان داد که در اثر مواجهه با پارانونیل فنول، حجم اووسیت و فولیکول‌ها کاهش می‌یابد (18). Shariatzadeh و همکاران در سال 2012، اثر سدیم آرسنیت را بر بافت تخمدان به شیوه استریولوژی بررسی کردند. نتایج بیانگر این بود که حجم متوسط اووسیت در فولیکول‌های اولیه، ثانویه، آنترال و گراف کاهش می‌یابد (19).  Soleimani Mehranjani وMansoori  در سال 2016، اثرات مهاری ویتامین C روی تأثیرات مضر بیس‌فنول A بر تخمدان رت را به روش استریولوژیکی مطالعه کردند و نشان دادند که حجم اووسیت و فولیکول‌های آن در گروه تجربی در مقایسه با گروه کنترل کاهش داشت (20). Dahmardeh و همکاران در سال 2020، مورفومتری تخمدان موالید موش‌های سوری تحت‌تیمار با اگزالی‌پلاتین را در دو دوره 30 و 60 روزه بررسی کردند. مشاهدات نشان داد که در موالید 30 روزه، حجم متوسط اووسیت در فولیکول‌های آنترال و پره‌آنترال و حجم متوسط فولیکول‌های آنترال در گروه‌های تجربی پیش‌آبستنی، آبستنی و شیرواری در مقایسه با گروه کنترل، کاهش داشت. همچنین آن‌ها بیان کردند که در موالید 60 روزه، حجم متوسط فولیکول‌های آنترال و حجم متوسط اووسیت فولیکول‌های آنترال در گروه‌های تجربی نسبت به گروه کنترل کاهش داشت (21). نتایج داده‌های مربوط به حجم اووسیت و حجم فولیکول‌ها در مطالعه حاضر با نتایج مطالعات گذشته همسو نبود. البته لازم به یادآودری است که در مطالعات پیشین سرب مورد استفاده با دوز بالا بود. در صورتی‌که در مطالعه حاضر رت‌های مادر با استات سرب با دوز پایین مواجهه بودند. لذا پیشنهاد می‌شود که در آینده مطالعاتی در مورد مکانیسم فیزیولوژیک و پاتولوژیک رت‌های مادر و موالید مواجهه شده با استات سرب صورت گیرد.

نتیجه‌گیری نهایی: در مطالعه حاضر حجم متوسط اووسیت فولیکول و حجم فولیکول‌ها با تکنیک استریولوژی مورد ارزیابی قرار گرفت. با توجه به توانایی عبور سرب از غشاء سلول و تجمع آن در فولیکول‌های موجود که سبب افزایش حجم اووسیت و فولیکول می‌شود؛ می‌توان این‌گونه نتیجه‌گیری نمود که بیشترین اثرات منفی سرب بر حجم فولیکول‌های تخمدانی مربوط به دوره شیرواری می‌باشد.

سپاسگزاری

مطالعه حاضر حاصل نتایج پایان‌نامه دکتری تخصصی بافت‌شناسی می‌باشد و نویسندگان بر خود لازم می‌دانند از حمایت مالی و پژوهشی معاونت محترم پژوهشــی و بخش بافت‌شناسی و آناتومی دانشکده دامپزشکی سپاسگزاری نمایند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.