مقدمه

بیماری میکزوماتوز دریچه‌ای در سگ‌ها عارضه‌ای دژنراتیو و پیشرونده در دریچه‌های دهلیزی-بطنی است که در کتب دامپزشکی با نام‌هایی همچون آندوکاردیوز یا بیماری مزمن دریچه‌ای قلب نیز شناخته می‌شود. در بسیاری از نقاط دنیا، آندوکاردیوز به‌عنوان یکی از شایع‌ترین بیماری‌های قلبی مطرح است؛ به‌ویژه در سگ‌ها که با افزایش سن بروز بیشتری می‌یابد. مشاهدات نشان می‌دهد که تقریباً 10 درصد از سگ‌های ارجاعی به کلینیک‌های دامپزشکی مبتلا به بیماری‌های قلبی می‌‌باشند (1). با این که در ایران میزان دقیق شیوع این بیماری در سگ‌ها مشخص نیست، اما به هرحال، آندوکاردیوز شایع‌ترین بیماری قلبی ارجاعی سگ‌ها به مرکز درمانی دامپزشکی می‌باشد.

هوموسیستئین (Homocysteine) یا Hcy یک اسید‌آمینه کوچک غیرضروری سولفوردار می‌باشد که ماده جانبی حاصل از متابولیسم متیونین است (2). متیونین یکی از اسید‌های آمینه ضروری است که بدن قادر به ساخت آن نمی‌باشد و باید از طریق غذا تأمین شود. هوموسیستئین تولید شده در داخل بدن، در 2 مسیر عمده ری‌متیلاسیون و ترانس‌سولفوراسیون به مصرف می‌رسد. مسیرهای ری‌متیلاسیون و ترانس‌سولفوراسیون در تعادل ظریفی با یکدیگر می‌باشند. مازاد هوموسیستئین تولید شده توسط مسیرهای فوق با انتشار ساده از آن خارج شده و به صورت "هوموسیستئین تام" در سرم و پلاسما قابل اندازه‌گیری می‌باشد (3). هوموسیستئین تام مجموعه‌ای از کلیه اشکال آن است و هنوز روشی که هر یک از اشکال هوموسیستئین را به تفکیک اندازه‌گیری کند، ابداع نشده است. به هر حال زمانی میزان هوموسیستئین در خون افزایش می‌یابد که متابولیسم آن در بدن از حد تعادل خارج شده باشد (4). در انسان هایپرهوموسیستئینمی را یک شاخص حساس کمبود ویتامین ب، فولات و فاکتور خطر مستقل جهت بیماری قلبی‌عروقی به‌ویژه در افراد زیر 50 سال می‌دانند (5).

شواهد زیادی بر نقش هوموسیستئین در ایجاد آترواسکلروز، افزایش فشار‌خون و کلسیفیکاسیون عروقی انسان وجود دارد (6). هنوز چگونگی تأثیر هوموسیستئین بر روی سلول‌های بدن و چگونگی تأثیر آن در بیماری‌های قلبی انسانی به‌خوبی شناخته نشده است (3). به‌هر‌حال احتمالاً استرس اکسیداتیو ناشی از تجمع گونه‌های اکسیژن راکتیو یا ROS، می‌تواند به‌عنوان مکانیسم اصلی صدمه عروقی ناشی از هوموسیستئین مطرح باشد زیرا ROS تولید شده منجر به بیان ژن‌های پیش التهابی و التهابی عروق می‌شود (7). همچنین مطالعات انسانی نشان می‌دهد که احتمالاً هوموسیستئین خون می‌تواند مستقیماً به آستر رگ‌های عروق کرونر آسیب بزند و تشکیل آتروما (تجمع مواد رسوبی در لایه داخلی سرخرگ‌ها) را محتمل‌تر سازد (4) و تشکیل لخته‌‌های خون را گسترش دهد (8). البته برخی مطالعات انسانی نقش هوموسیستئین را به‌عنوان یک فاکتور خطر مستقل بیماری قلبی تأیید نمی‌کنند (9).

گرچه تعداد زیادی مطالعات بر روی هوموسیستئین در طب انسانی صورت گرفته است اما در دامپزشکی در این ارتباط مطالعات کافی وجود ندارد. Cayir و Kozat در سال 2016 برای اولین بار هوموسیستئین تام پلاسما 40 سگ از 4 نژاد مختلف Golden Retriever، Terrier، German Shepherd وLabrador Retriever را به‌ترتیب 1/6± 43/11، 34/2± 88/8، 55/4± 6/10 و 83/3± 4/9 میکرومول در لیتر گزارش کردند (10). همچنین مطالعات نشان می‌دهد که در سگ‌های مبتلا به هیپوتیروئیدیسم، هیپرهوموسیستئینمی مشاهده می‌گردد. در این سگ‌ها کاهش خفیف اسید فولیک خون، ممکن است ناشی از هیپرهوموسیستئینمی باشد (11).

البته در ارتباط با Systemic inflammatory response syndrome (SIRS) یا sepsis در سگ‌ها نتایج کاملاً متفاوتی به دست آمده است. Patterson و همکاران در سال 2013 نشان دادند که غلظت هوموسیستئین سرم در سگ‌های مبتلا به SIRS یا سپسیس کمتر از سگ‌های سالم است و هیچ‌گونه ارتباط معنی‌داری مابین هوموسیستئین سرم و غلظت‌های کوبالامین و فولات وجود ندارد. نتایج فوق کاملاً بر‌خلاف گزارشات انسانی در این ارتباط است (12).

به‌هر‌حال در دامپزشکی مطالعات کمی در ارتباط با هوموسیستئین و بیماری‌های مختلف بخصوص بیماری‌های قلبی صورت گرفته است. هدف از مطالعه حاضر اندازه‌گیری سطح سرمی هوموسیستئین، کلسترول، تری‌گلیسیرید و فعالیت کراتین‌فسفوکیناز و آسپارتات آمینوترانسفراز سگ‌های نژاد کوچک مبتلا به بیماری آندوکاردیوز می‌باشد تا ارزش اندازه‌گیری هوموسیستئین در سگ‌های مبتلا به آندوکاردیوز مشخص گردد.

مواد و روش کار

به‌همین منظور، 30 قلاده سگ ارجاعی به بیمارستان آموزشی و پژوهشی دام‌های کوچک دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران در سنین 3 تا 16 سالگی، با میانگین سنی 87/0± 24/9 و میانگین وزنی 55/0± 38/6 در 2 گروه مبتلایان به بیماری قلبی و شاهد مورد بررسی قرار گرفتند. انتخاب گروه بیماران (شامل 7 نر و 8 ماده) با کمک معاینات بالینی، گوش کردن به صدای قلب با گوشی پزشکی، رادیوگرافی و اکوکاردیوگرافی انجام و اطلاعات مربوط به هریک از بیماران از جمله سن، وزن، جنس، نژاد و تاریخچه بیماری به دقت ثبت گردید. عمده بیماران از نژاد تریر بودند اما مخلوط این نژاد با نژادهایی مانند پودل، اشپیتز، پومرانین، 

پیکینیز و شیتزو نیز در مطالعه حاضر وجود داشت. لازم به ذکر است که علاوه بر معاینات بالینی، پارامترهای هماتولوژی و بیوشیمیایی برای اطمینان از عدم وجود بیماری‌های دیگر نیز اندازه‌گیری گردید و با استفاده از نتایج آن‌ها به همراه دنبال کردن روند درمان بیماران، کلیه مواردی که علائم ابتلا به بیماری‌های دیگر بجز بیماری‌های قلبی مانند بیماری‌های سیستمیک، التهاب، عفونت، تومور و دیابت ملیتوس را نشان می‌دادند، از مطالعه حذف شدند. خون‌گیری از رگ جاگولار بیماران انجام گردید و سپس جهت تهیه سرم، لوله‌های حاوی خون بدون ماده ضد انعقاد پس از دکله شدن به مدت 15 دقیقه در rpm 2500 سانتریفیوژ و سرم آن‌ها پس از جداسازی در میکروتیوب ریخته و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد تا انجام آزمایش‌های مربوطه نگهداری شدند. همچنین 15 قلاده سگ سالم نیز با وزن، سن، جنس و نژاد مشابه بیماران به عنوان گروه شاهد در نظر گرفته شدند. کلیه معاینات بالینی، رادیوگرافی، اکوکاردیولوژی، اندازه‌گیری پارامترهای آزمایشگاهی در مورد گروه شاهد همانند گروه بیماران قلبی نیز انجام گرفت.

تصاویر رادیوگرافی از قفسه سینه بر‌اساس روش‌های استاندارد و با دستگاه Kodak Carestream (Classic model، ژاپن) تهیه شد. همچنین اکوکاردیوگرافی در مُدهای مختلف (B mode، M mode و Doppler) توسط اکوکاردیوگرافی Vivid 7  (General Electric ، نروژ) انجام شد.

اندازه‌گیری هوموسیستئین با استفاده از روش آنزیمی انجام پذیرفت. در این روش هوموسیستئین با استفاده از آنزیم سیستاتیونین بتا- سینتاز ابتدا به سیستاتیون تبدیل شد، سپس سیستاتیون به‌وسیله سیستاتیونین بتا-لیاز به هوموسیستئین، پیروات و آمونیاک تبدیل ‌گردید. در نهایت پیرووات به‌وسیله آنزیم لاکتات‌ دهیدروژناز احیا شده، در حالی که به طور همزمان NADH بهNAD اکسیده می‌گردد. کاهش جذب نوری در 340 نانومتر متناسب با مقادیر تشکیل NAD و غلظت هوموسیستئین می‌باشد (5).

فعالیت کراتین فسفوکیناز (CPK) و آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) و مقادیر کلسترول و تری‌گلیسیرید سرم با استفاده از کیت‌های شرکت پارس‌آزمون ساخت ایران و دستگاه اتوآنالایزر (Elitech-Selectra prom، فرانسه) اندازه‌گیری شدند.

به‌منظور بررسی‌های آماری از آزمون تی-‌استیودنت، آنالیز واریانس یک‌طرفه و آزمون LSD (نرم‌افزارSPSS، نسخه 16) استفاده گردید. در مطالعه حاضر میانگین و خطای استاندارد یا SE (Standard Error) محاسبه و 05/0P< معنی‌دار تلقی گردید. همچنین از آزمون همبستگی خطی Pearson نیز جهت تعیین ارتباط ما‌بین مقادیر سرمی هوموسیستئین با تری‌گلیسیرید، کلسترول،CPK ، AST و همچنین سن استفاده شد.

نتایج

آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) نشان داد که هر چند در سگ‌های نر بیمار میانگین هوموسیستئین سرم از ماده‌های بیمار و نرهای سالم و بیمار بیشتر می‌باشد اما این تغییرات معنی‌دار نیست (05/0P>) (تصویر1).

همچنین نتایج نشان داد که میانگین مقادیر سرمی هوموسیستئین و کلسترول در گروه بیمار علی‌رغم افزایش جزیی، نسبت به گروه شاهد تغییر معنی‌داری ندارد (05/0P>)، اما افزایش میانگین مقادیر تری‌گلیسیرید در گروه بیمار معنی‌دار بود (03/0 P=). تجزیه و تحلیل آماری بر روی مقادیر فعالیت آنزیم‌های عضلانی کراتین‌فسفوکیناز (CPK) و آسپارتات ‌آمینو‌ترانسفراز (AST) نیز صورت گرفت. بدین ترتیب فقط افزایش میانگین فعالیت CPK در گروه بیمار نسبت به شاهد معنی‌دار بود (01/0 P=) (جدول 1).

نتایج یافته‌های اکوکاردیوگرافی و رادیولوژی سگ‌های مبتلا به آندوکاردیوز و گروه شاهد در جدول 3 آمده است.

آزمون همبستگی نشان داد که هیچ‌گونه همبستگی مابین هوموسیستئین سرم با سن، مقادیر کلسترول، تری‌گلیسیرید و آنزیم‌های عضلانی سرم وجود ندارد (جدول 2). در نرها و ماده‌ها نیز همبستگی مابین هوموسیستئین سرم با پارامترهای مذکور مشاهده نگردید.

بحث

از هوموسیستئین سرم در بیماری‌های قلبی انسان به‌عنوان یک بایومارکر بیماری‌های قلبی عروقی یاد می‌شود، اما در دامپزشکی، مطالعات زیادی بر روی هوموسیستئین سرم و بیماری‌های قلبی صورت نگرفته است (13).

Lee و همکاران در سال 2017 افزایش غلظت سرمی هوموسیستئین را در سگ‌های مبتلا به آندوکاردیوز نسبت به سگ‌های سالم گزارش کردند. نتایج آن‌ها نشان داد که مابین مقادیر هوموسیستئین سرم و شدت بیماری میکزوماتوز دریچه میترال همبستگی معنی‌داری وجود دارد (13). همچنین Rossi و همکاران در سال 2008 در نمونه‌های سرمی سگ‌های مبتلا به بیماری کلیوی و قلبی، مقادیر هوموسیستئین را افزایش یافته گزارش و حتی آن را برای مونیتورینگ بیماری‌های فوق توصیه کردند (5). اماLee  و Hyun در سال 2012 تفاوت معنی‌داری در هوموسیستئین پلاسمای سگ‌های مبتلا به مراحل مختلف نارسایی دریچه میترال (CMVI) نیافتند (14). در مطالعات انسانی نیز Khosravi و همکاران در سال 2010 تغییرات معنی‌داری را در مقادیر سرمی هوموسیستئین بیماران مبتلا به بیماری قلبی در مقایسه با افراد سالم مشاهد نکردند (9). در مطالعه حاضر نیز میانگین هوموسیستئین سرم بیماران قلبی در مقایسه با شاهد تغییرات معنی‌داری را نشان نداد. هر چند در انسان، غلظت هوموسیستئین بالاتر از صدک (Percentile) 90 را عاملی جهت افزایش خطر فرآیندهای دژنراتیو و آترواسکلروتیک می‌دانند (15)، اما باید به این نکته توجه داشت که در جمعیت‌های انسانی مورد مطالعه، در اکثر گزارش‌ها، بیماران مبتلا به انفارکتوس میوکارد، بیماری‌های سرخرگی کرونری و ترومبوآمبولیسم در نظر گرفته شده‌اند و در مقایسه با انسان، وقوع انفارکتوس میوکارد در سگ‌ها فوق‌العاده کم است (1).

برخی مطالعات نشان می‌دهد که بین افزایش سطح هوموسیستئین و افزایش سن بیماران انسانی ارتباط معنی‌داری وجود دارد. از دلایلی که برای افزایش هوموسیستئین در سنین بالا گزارش کرده‌اند، کاهش عملکرد کلیه‌ها با افزایش سن است که معمولاً افزایش غلظت کراتینین سرم را نیز به‌دنبال دارد. بدین ترتیب با افزایش غلظت کراتینین سرم، غلظت هوموسیستئین نیز به علت انتقال گروه متیل در حین متابولیسم کراتینین افزایش می‌یابد (4). Kakimoto و همکاران در سال 2014 ارتباط معنی‌دار مابین هوموسیستئین خون و سن درسگ‌های نر و ماده را گزارش کردند اما آن‌ها بیان داشتند که این ارتباط آن قدر کم است که درحقیقت معنی‌دار نیست (16). در مطالعه حاضر نیز ارتباط معنی‌داری مابین هوموسیستئین و سن سگ‌ها مشاهده نگردید (97/0P=، 06/0r=).

میزان هوموسیستئین در مردها بیشتر از زنان دارای سن مشابه می‌باشد که این مسئله ناشی از شاخص توده بدن، وضعیت ویتامین‌ها، هورمون‌های جنسی و غلظت کراتینین سرم نسبت به توده عضلانی است (4). اما بررسی‌ها نشان داد که با وجود بیشتر بودن میانگین هوموسیستئین در سگ‌های نر، تفاوت معنی‌داری در میزان هوموسیستئین سگ‌های نر، ماده‌های سالم و بیمار وجود ندارد (05/0P<). Rossi و همکاران نیز در سال 2008 هوموسیستئین سرم سگ‌ها را با کیت انسانی (روش آنزیماتیک) ‌اندازه‌گیری کردند. آن‌ها ضمن آن که عنوان کردند روش آنزیمی به خوبی در سگ قابل اجرا می‌باشد و نمونه‌های سرمی نسبت به پلاسما بهتر است، بیان نمودند که هیچ‌گونه اختلاف معنی‌داری در مقادیر هوموسیستئین بر حسب سن و جنس وجود ندارد (5).

در مطالعه حاضر، اندازه‌گیری تری‌گلیسیرید و کلسترول نشان داد که میانگین تری‌گلیسیرید درگروه‌های بیمار و شاهد به ترتیب 26/25±41/104 و 07/4±31/44 میلی‌گرم در ‌دسی‌لیتر و میانگین کلسترول در گروه‌های بیمار و شاهد به‌ترتیب 98/15±76/202 و 39/14±85/197 میلی‌‌گرم در دسی‌لیتر می‌باشد. همان‌گونه که مشاهده گردید، برخلاف کلسترول افزایش تری‌گلیسیرید در گروه بیمار نسبت به شاهد چشم‌گیر و معنی‌دار است. در انسان افزایش چربی‌های سرم (تری‌گلیسیرید و کلسترول) عوامل خطر بیماری قلبی محسوب می‌شوند (9). بررسی Sesh و همکاران در سال 2013 نشان داد که در سگ‌های مبتلا به بیماری قلبی علی‌رغم محدوده طبیعی تری‌گلیسیرید و کلسترول سرم سگ‌های بیمار، ضمن آن که میانگین هر 2 ماده فوق در بیماران نسبت به شاهد کاهش یافته بود، اما فقط کاهش کلسترول معنی‌دار بود. آن‌ها علت تفاوت‌های فوق را ناشی از تغذیه، مرحله بیماری و میزان فعالیت حیوان عنوان کردند (17).

در مطالعه حاضر آزمون همبستگی نشان داد که همبستگی مابین هوموسیستئین سرم، مقادیر کلسترول و تری‌گلیسیرید وجود ندارد که کاملاً مشابه نتایج Khosravi و همکاران در سال 2010 می‌باشد (9). همچنین، اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های عضلانی همچون CPK و AST نیز نشان داد که افزایش فعالیت CPK نسبت به گروه شاهد معنی‌دار است. البته گاهی برخی محققین عدم افزایش فعالیت CPK را در بیماری‌های قلبی گزارش کرده‌اند. Baalash و همکاران در سال 2012 بیان کردند که حتی پس از ایجاد ایسکمی تجربی در سگ‌ها، فعالیت CPK افزایش نیافت (18). اما Sesh و همکاران در سال 2013 در سگ‌های مبتلا به کاردیومایوپاتی اتساعی یا DCM فقط افزایش CPK (البته در محدوده طبیعی) را گزارش کردند و میانگین فعالیت AST معنی‌دار نبود (17). افزایش معنی‌دار فعالیت کراتین فسفوکیناز همراه با مقادیر طبیعی AST در مطالعه Khaki و همکاران در سال 2018 در سگ‌های نژاد کوچک مبتلا به آندوکاردیوزیس و نارسایی احتقانی قلب نیز گزارش شده است (1). در مطالعه حاضر، هرچند که برخی از بیماران دارای مقادیر طبیعی CPK بودند، اما افزایش میانگین فعالیت CPK بیش از حد طبیعی نشان داد که احتمالاً برخی از بیماران بلافاصله پس از ایجاد بیماری قلبی به درمانگاه ارجاع شده‌اند. در 2 بیمار فعالیت CPK 950 و 2400 واحد بین‌المللی در لیتر بود. مطالعات نشان می‌دهد در صورتی که بیماران ظرف 6 ساعت پس از بیماری قلبی به درمانگاه ارجاع شوند، مقادیر CPK آن‌ها افزایش یافته است ولی پیک افزایش AST در زمان طولانی‌تری در حدود 2 تا 3 روز واقع می‌شود (19). در مطالعه حاضر هیچ‌گونه همبستگی مابین مقادیر هوموسیستئین سرم با CPK و AST وجود نداشت که با نتایج مطالعات انسانی Khosravi و همکاران در سال 2010 مطابقت دارد (9).

 نتیجه‌گیری نهایی: مطالعه حاضر نشان داد که هرچند افزایش معنی‌دار میانگین فعالیت CPK و تری‌گلیسیرید در سگ‌های مبتلا به آندوکاردیوز در مقایسه با سگ‌های به ظاهر سالم مشاهده ‌‌گردید اما افزایش جزیی میانگین مقادیر سرمی هوموسیستئین، کلسترول و فعالیت AST در گروه بیمار نسبت به گروه شاهد معنی‌دار نبود. به هر حال به نظر می‌رسد که نقش هوموسیستئین به‌عنوان یک ریسک فاکتور جدید، همانند برخی مطالعات انسانی هنوز مورد تردید است و در نظر گرفتن آن به‌عنوان یک ریسک فاکتور بیماری قلبی سگ و انتخاب حیوان مذکور به‌عنوان مدل حیوانی بررسی نقش هوموسیستئین در بیماری‌های قلبی انسان، در هاله‌ای از ابهام است و نیاز به مطالعات بیشتر دارد.

سپاسگزاری

بدین وسیله از جناب آقای دکتر وحید سیاوشی جهت کمک به انجام آزمایشات تشکر و قدردانی می‌گردد.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.