مقدمه

ورم پستان از پرهزینه‌ترین بیماری‌ها در صنعت دامپروری گاو شیری است، به نحوی که در حدود 26 درصد کل هزینه بیماری‌ها در گله‌های صنعتی گاو شیری ناشی از این بیماری است. ورم پستان به دو شکل بالینی و تحت بالینی رخ می‌دهد. در اغلب گله‌ها ورم پستان تحت بالینی شایع‌ترین نوع بیماری است و سبب بیشترین میزان خسارت می‌شود. تشخیص ورم پستان تحت بالینی به علت عدم وجود نشانه‌های قابل رویت سخت است، بنابراین برای تشخیص آن به تست‌های آزمایشگاهی و تست‌های در سطح گله نیاز است (5،11).

پاسخ سیستم ایمنی حیوانات به التهاب، افزایش تعداد گلبول‌های سفید در پستان است. این مکانیسم دفاعی به وسیله‌‌ی ترشح چند آنزیم از جمله لاکتات دهیدروژناز (LDH) گلبول‌های سفید را همراهی می‌کند. با افزایش شدت پاسخ التهابی، میزان این آنزیم نیز افزایش می‌یابد. افزایش غلظت لاکتات دهیدروژناز در شیر شاخصی مناسب برای از بین رفتن بافت و نشان دهنده‌ی آلودگی فعال است. LDH با تعداد سلول‌های سوماتیک (SCC) شیر در ارتباط است اما نکته‌ی مثبت LDH آن است که به راحتی تحت تأثیر شرایط دیگر مانند استرس، تغذیه و دوره‌ی شیرواری قرار نمی‌گیرد. میزان LDH غالباً زودتر از میزان SCC افزایش می‌یابد که شاخصی بسیار خوب برای تشخیص زود هنگام عفونت پستان است. اخیراً چند مدل از ماشین‌های شیردوشی میزان LDH را برای مراقبت از سلامت پستان به عنوان شاخصی از ورم پستان اندازه می‌گیرند (7،9).

آزمایش Uddercheck Dipstick (PortaCheck Inc. USA) روشی مؤثر جهت تشخیص میزان افزایش LDH در شیر است (12){Jadhav, 2018 #60}. پد معرف دارای یک لایه ثابت به نام ال لاکتات است. در جریان یک‌سری واکنش‌های آنزیمی این ماده به وسیله‌ی لاکتات دهیدروژناز شیر اکسید شده، در حالی‌که هم‌زمان اندیکاتور نیتروترازولیوم آبی به فورمازان بنفش کاهش می‌یابد. غلظت نهایی رنگ فورمازان متناسب با غلظت لاکتات دهیدروژناز شیر است.

امروزه سیستم‌های تشخیص ورم پستان بسیار تخصصی شده‌اند. هم زمان با افزایش تمرکز بر کیفیت شیر، پیشرفت‌هایی نیز در زمینه تکنولوژی‌های تشخیص در سطح گله حاصل شده است. ارزیابی مؤثر بودن سیستم تشخیص بیماری با برآورد میزان حساسیت و ویژگی آن سیستم صورت می‌پذیرد. هدف از مطالعه حاضر ارزیابی دقت تشخیص ورم پستان تحت بالینی با استفاده از نوارهای تشخیص لاکتات دهیدروژناز است. همچنین برای اولین بار عملکرد و دقت ارزیابی ورم پستان تحت بالینی با استفاده از این نوارها با توجه به روزهای شیرواری، میزان تولید و تعداد زایش مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش کار

مطالعه حاضر بر روی 106 رأس گاو شیری نژاد هلشتاین در دو واحد صنعتی در اطراف شهر مشهد با 800 و 500 رأس گاو دوشا انجام شد. گاوها به صورت تصادفی از بین گاوهای پرتولید و کم‌تولید انتخاب شدند و هر 4 کارتیه پستان گاوها مورد آزمایش CMT قرار گرفت. بر اساس نتیجه‌ CMT از کارتیه یا کارتیه‌های مورد نظر، 2 نمونه شیر طبق اصول نمونه گیری NMC اخذ شد. یک نمونه برای کشت میکروبی در نظر گرفته شد و نمونه‌ی دیگر برای آزمایش LDH شیر با استفاده از نوار تشخیصی Udder check dipstick (PortaCheck Inc. USA) و آزمایش شمارش سلول‌های سوماتیک استفاده شد.

نمونه‌های شیر در کنار یخ به آزمایشگاه حمل و فوراً کشت داده شدند. به طور خلاصه، نمونه‌ها با محیط هم دما شدند و در نهایت بعد از چند بار مخلوط کردن، 01/0 میلی لیتر از نمونه‌ها برداشته و هم زمان در محیط‌های بلاد آگار و مک کانکی آگار کشت داده شدند. محیط‌های کشت به انکوباتور 37 درجه سانتیگراد منتقل گردیدند و بعد از 24-18 ساعت مورد بررسی قرار گرفتند. در لوله دیگر نوار LDH زده شد و مقدار اضافی شیر از روی نوار به وسیله‌ی تکان دادن ریخته شد و پس از 2 دقیقه، نتیجه بر اساس تغییر رنگ نوار و در مقایسه با چارت موجود بر روی ظرف حاوی نوارها از منفی تا 3 مثبت قرائت شدند و پس از آن شمارش سلول‌های سوماتیک شیر به وسیله‌ی دستگاه فوزوماتیک 5000 ساخت کشور دانمارک انجام گرفت.

 جهت ارزیابی توانایی نوار در تشخیص ورم پستان تحت بالینی منحنی (ROC) Receiver Operating Characteristic رسم و سطح زیر منحنی گزارش شد. سطح زیر منحنی بین 7/0 و 8/0 fair و سطح زیر منحنی زیر 7/0 poor در نظر گرفته شد. سپس حساسیت و ویژگی تست نوار محاسبه و گزارش شد. حساسیت، قابلیت تست در تشخیص درست موارد بیمار (درصدی از بیماران واقعی که توسط تست به درستی مثبت تشخیص داده شده‌اند) و ویژگی، قابلیت تست در تشخیص درست موارد سالم (درصدی از دام‌های سالم واقعی که توسط تست به درستی منفی تشخیص داده شده‌اند) می‌باشد. برای بررسی رابطه پاسخ نوار و وضعیت واقعی ورم پستان تحت بالینی با کنترل اثر تعداد زایش، میزان تولید شیر و روز شیرواری از روش رگرسیون لوجستیک استفاده شد. رابطه پاسخ نوار و میزان SCC و نیز رابطه پاسخ نوار با پاسخ تست CMT توسط آزمون Spearman’s correlation test مورد ارزیابی قرار گرفت و برای بررسی رابطه پاسخ نوار و نتیجه کشت از روش Chi-square test استفاده شد.

نتایج

نتایج ردیابی ورم پستان بالینی و آزمایش CMT در دو گاوداری مورد مطالعه نشان داد که از مجموع 153 کارتیه مورد آزمایش تعداد و درصد موارد طبیعی، خفیف (Trace)، یک، دو و سه به ترتیب 27 (64/17 درصد)، 12 (84/7 درصد)، 50 (67/32 درصد)، 37 (18/24 درصد) و 25 (33/16درصد) بود. همچنین 2 مورد (3/1 درصد) ورم پستان بالینی مشاهده شد. در کشت میکروبی 90 مورد (58 درصد) مثبت و 63 مورد (42 درصد) منفی بود (جدول 1). نتیجه‌ نوار LDH شامل 62 مورد (52/40 درصد) منفی، 53 مورد (64/34 درصد) یک مثبت، 32 مورد (91/20 درصد) دو مثبت و 6 مورد (92/3 درصد) سه مثبت بود.

حساسیت، ویژگی و منحنی ROC تست نوار LDH: زمانی که کشت به عنوان روش تشخیص گلد استاندارد در نظر گرفته شد، حساسیت و ویژگی تست LDH به ترتیب 9/68 و 54 درصد بود. رسم منحنی ROC نشان داد که نوار LDH از نظر استفاده برای تشخیص ورم پستان تحت بالینی در رده poor قرار می‌گیرد (62/0Area under curve=) (نمودار 1).

حساسیت، ویژگی و منحنی ROC تست SCC: رسم منحنی ROC نشان داد که SCC از نظر استفاده برای تشخیص ورم پستان تحت بالینی در رده Fair قرار می‌گیرد (79/0Area under curve=) (نمودار 2). زمانی که کشت به عنوان روش تشخیص گلد استاندارد در نظر گرفته شد، حساسیت و ویژگی تست SCC به ترتیب 4/74 و 4/71 درصد بود.

حساسیت، ویژگی و منحنی ROC تست CMT: رسم منحنی ROC نشان داد CMT از نظر استفاده برای تشخیص ورم پستان تحت بالینی در رده Fair قرار می‌گیرد (77/0Area under curve=) (نمودار 3).

حساسیت و ویژگی تست CMT: حساسیت و ویژگی تست CMT در صورتی که نتیجه CMT به صورت 2 حالت منفی (N, T) و مثبت (1، 2 و 3) و کشت به عنوان روش تشخیص گلد استاندارد در نظر گرفته شد به ترتیب 3/93 درصد و 8/50 درصد بود. همچنین حساسیت و ویژگی تست CMT در صورتی که نتیجه CMT به 2 حالت منفی (N) و مثبت (T، 1، 2 و 3) و کشت به عنوان روش تشخیص گلد استاندارد در نظر گرفته شد به ترتیب 6/95 درصد و 9/34 درصد بود.

رابطه پاسخ نوار و میزان SCC: رابطه معنی‌داری بین پاسخ نوار و میزان SCC مشاهده شد. با افزایش میزان SCC درجه پاسخ نوار هم افزایش پیدا کرد (001/0>P)(6/0=r) (نمودار 4).

رابطه پاسخ نوار و نتیجه تست CMT: رابطه معنی‌داری بین پاسخ نوار و نتیجه تست CMT مشاهده شد. با افزایش درجه CMT درجه پاسخ نوار هم افزایش پیدا کرد (001/0>P) (44/0=r) (نمودار 5).

رابطه پاسخ نوار و نتیجه کشت با کنترل میزان تولید شیر، روز شیرواری و تعداد زایش: زمانی که پاسخ نوار به 2 حالت منفی و مثبت در نظر گرفته شد، با کنترل اثر روز شیرواری، میزان تولید و تعداد زایش، دامی که از نظر نتیجه تست نوار LDH مثبت بود شانس این‌که مبتلا به ورم پستان تحت بالینی باشد 35/4 برابر دامی بود که نتیجه تستش منفی بود (013/0=P) (35/4=OR) (جدول 2). در نمونه‌هایی که نتیجه تست نوار LDH، 1 یا بالاتر بود (مثبت)، درصد مواردی که در کشت، باکتری محیطی (009/0=P) یا واگیردار (029/0=P) جدا شد به صورت معنی‌داری بالاتر از نمونه‌هایی بود که نتیجه‌ی‌ تست نوار LDH صفر بود.

رابطه نتیجه SCC و نتیجه کشت با کنترل میزان تولید شیر، روز شیرواری و تعداد زایش: زمانی که نتیجه SCC به دو حالت منفی و مثبت در نظر گرفته شد، با کنترل اثر روز شیرواری، میزان تولید و تعداد زایش، دامی که تعداد SCC بیشتر از 200000 داشت، شانس این‌که مبتلا به ورم پستان تحت بالینی بوده باشد 11/4 برابر دامی بود که نتیجه تستش منفی بود (018/0=P)(11/4=OR) (جدول 3).

رابطه پاسخ CMT و نتیجه کشت با کنترل میزان تولید شیر، روز شیرواری و تعداد زایش: در صورتی که نتیجه CMT به دو حالت منفی (N, T) و مثبت (1، 2 و 3) در نظر گرفته شد، با کنترل اثر روز شیرواری، میزان تولید و تعداد زایش، در دامی که نتیجه CMT مثبت بود شانس این‌که مبتلا به ورم پستان تحت بالینی باشد 38/7 برابر دامی بود که نتیجه تستش منفی بود (006/0=P) (38/7=OR) (جدول 4).

SCC، LDH و CMT با روز شیرواری و تولید شیر رابطه معنی‌داری نداشتند ولی با افزایش تعداد زایش میزان هر سه شاخص افزایش معنی‌داری را نشان دادند.

بحث

از آنجایی که ورم پستان از مهم‌ترین بیماری‌ها در سطح گله‌های گاو شیری است لذا تشخیص دقیق و سریع آن اهمیت بیشتری پیدا کرده و نیاز به روش تشخیصی مناسب برای این بیماری کاملاً ضروری است. هدف از مطالعه حاضر بررسی کارآیی استفاده از نوارهایLDH در تشخیص ورم پستان تحت بالینی و همچنین بررسی ارتباط آن در گروه‌های مختلف بر اساس میزان تولید و مرحله شیرواری بود. محققین در مطالعه حاضر به دنبال آن بودند که در صورت کارآیی بیشتر این روش نسبت به روش‌های تشخیصی CMT، SCC و کشت و با توجه به صرفه جویی در هزینه، وقت و امکان تشخیص سریع‌تر نسبت به سایر تست‌ها روش تشخیصی مناسبی را جهت استفاده در سطح دامداری ارائه کنند.

نتایج مطالعه‌ حاضر نشان داد که استفاده از نوار تشخیصی LDH در مقایسه با روش تشخیص گلد استاندارد مشتمل بر کشت مثبت و SCC بیشتر از 200000 دارای حساسیت 4/75 درصد و ویژگی 6/53 درصد است که میزان حساسیت مشابه نتیجه‌ی به دست آمده در مطالعه Chagunda و همکاران در سال 2006 بود که در دو گروه شامل گاوهای سالم و گاوهای مبتلا به ورم پستان میزان NAGase و LDH را به وسیله‌ی فلورومتر اندازه‌گیری کردند و نشان دادند که رابطه‌ی SCC و LDH در گاوهای مبتلا به ورم پستان بالینی بسیار قوی‌تر از این رابطه در گاوهای سالم و حساسیت تست LDH بالاتر از تست NAGase است (حساسیت تست LDH 73 درصد و ویژگی آن 92 درصد بود) (2). تفاوت در میزان ویژگی با مطالعه حاضر می‌تواند به خاطر نوع دسته بندی متفاوت و در نظر گرفتن SCC بیشتر از 100000 هزار باشد در حالی که در مطالعه حاضر SCC بیشتر از 200000 در نظر گرفته شد.

همچنین نتایج مطالعه حاضر نشان داد که رابطه معنی‌داری بین تست LDH و میزان SCC وجود دارد و با افزایش میزان SCC درجه پاسخ تست LDH هم افزایش پیدا کرد (001/0>P) (6/0=r). این نتیجه مشابه مطالعه صورت گرفته توسط Hiss و همکاران در سال 2007 و Chagunda و همکاران در سال 2006 بود (2،6).

در مطالعه Hiss و همکاران در سال 2007 میزان LDH به وسیله‌ دستگاه آنالیزور اندازه‌گیری شد و نشان داد که میزانLDH در نمونه‌هایی که از نظر کشت مثبت بودند از میزان آن در نمونه‌هایی با کشت منفی بیشتر بود که نشان دهنده وجود همبستگی قوی بین میزان LDH و SCC بود. در مطالعه حاضر حساسیت و ویژگی تست LDH به ترتیب 80 و 87 درصد بود (6).

در مطالعه‌ حاضر نشان داده شد که رابطه معنی‌داری بین پاسخ تست تشخیصی نوار LDH و نتیجه تست CMT وجود دارد. با افزایش درجه CMT درجه پاسخ نوار هم افزایش پیدا کرد (001/0>P) (44/0=r) که این نتیجه مشابه مطالعات صورت گرفته توسط سایر محققین بود (1،10).

در سال 2009 مطالعه بر روی 60 رأس گاو شیری سالم و مبتلا به ورم پستان تحت بالینی در سه دامداری ارومیه انجام‌ گرفت و فعالیت LDH این در مطالعه توسط اسپکتروفوتومتر اندازه‌گیری شد. نتایج این مطالعه نشان داد که میانگین LDH در شیرهای اخذ شده از گاوهای دارای ورم پستان تحت بالینی بالاتر از میزان آن در شیرهای اخذ شده از گاوهای سالم بود. در این مطالعه میزان LDH در خون نیز  اندازه‌گیری شد که تفاوتی بین گروه سالم و گروه دارای ورم پستان تحت بالینی مشاهد نشد (10).

در مطالعه‌ دیگری که بر روی 72 رأس گاو انجام گرفت (35رأس گاو CMT مثبت که SCC آن‌ها بیشتر از 500000 بود در گروه ورم پستان تحت بالینی و بقیه در گروه گاوهای سالم)، فاکتورهای مختلفی از جمله سدیم، کلر، آلبومین و LDH اندازه‌گیری شد. در گروه ورم پستان تحت بالینی میزان LDH شیر بالاتر از گروه کنترل بود در حالی که میزان آن در خون دو گروه تفاوتی نداشت (1).

Friggens و همکاران در سال 2007 در 253 رأس گاو کاملاً سالم و مبتلا به ورم پستان تغییرات LDH را بررسی کردند. پروفایل این دو گروه در یک بازه‌ی 60 روزه مبنی بر عدم وجود سابقه‌ی درمانی و نوع انحراف میزان SCC در تقسیم بندی گاوها مورد استفاده قرار گرفت و با اندازه‌گیری میزان LDH به این نتیجه رسیدند که حساسیت این تست در تشخیص ورم پستان بالینی 92 درصد و ویژگی آن 97 درصد است. در این مطالعه یک پروفایل دو ماهه برای تقسیم بندی گاوها استفاده شد و از یک عدد ثابت SCC برای تفریق دو دسته‌ گاوهای سالم و مبتلا به ورم پستان استفاده نشد بلکه از لگاریتم مثبت و منفی این تست استفاده شد که این مورد توانست بر دقت کار طی تقسیم بندی گاوها بیافزاید و خود دلیلی بر افزایش میزان حساسیت و ویژگی تست بعد از دقت در دسته بندی گاوها باشد (3).

Guha و همکاران در سال 2012 مطالعه‌ای را بر روی عناصر کمیاب و LDH در شیر گاومیش انجام دادند. در این مطالعه میزان LDH توسط کیت تجاری اندازه‌گیری شد و نشان داد که در گروه دارای ورم پستان تحت بالینی و به ویژه آن‌هایی که درگیر با عفونت استرپتوکوکی بودند میزان LDH بیشتر بود. حساسیت LDH در تشخیص ورم پستان تحت بالینی 34 درصد و ویژگی آن 92 درصد بود (4).

Kalantari و همکاران در سال 2013 در مطالعه‌ای به دنبال یافتن جایگزین برای SCC و کشت در تشخیص ورم پستان تحت بالینی، 145 رأس گاو را که از لحاظ بالینی سالم بودند جدا نموده و بر اساس نتیجه کشت و میزان SCC در دو گروه تقسیم کردند. بر این اساس 77 رأس گاو با کشت مثبت و SCC بالاتر از 100000 در گروه ورم پستان تحت بالینی و بقیه گاوها (78 رأس) در گروه سالم قرار گرفتند. آنزیم‌های ALP و LDH در خون و شیر این گاوها با استفاده از کیت‌های تجاری اندازه‌گیری شد. میانگین فعالیت آنزیم‌ها در گاوهای مبتلا به ورم پستان تحت بالینی بیشتر بود و LDH دارای حساسیتی به میزان1/94 درصد و ویژگی 8/94 درصد بود (8).

مطالعه‌ Kalanatri و همکاران در سال 2013 در میزان حساسیت و ویژگی با نتایج مطالعه حاضر متفاوت بود که احتمالاً به علت تفاوت در دسته بندی گاوها (در مطالعه Kalanatri و همکاران در سال 2013 از SCC بیشتر از 100000 استفاده شد در صورتی که در مطالعه‌ حاضر از SCC بالاتر از 200000 استفاده شد) و همچنین اندازه‌گیری توسط کیت‌های تجاری و دستگاه اسپکتروفتومتر بود (8).

 هدف از مطالعه حاضر مقایسه برخی از روش‌های ردیابی ورم پستان تحت بالینی در سطح گله بود. نتایج حساسیت و ویژگی تست‌ها به این صورت بود که با در نظر گرفتن کشت به عنوان روش تشخیص گلد استاندارد، حساسیت تست SCC، LDH و CMT به ترتیب 74، 69 و 3/93 درصد بود. همچنین ویژگی این تست‌ها به ترتیب 71، 54 و 8/50 درصد بود. از لحاظ کارایی تشخیص ورم پستان تحت بالینی در گاو تست‌های SCC، CMT و استفاده از نوار سنجش LDH به ترتیب بهترین روش‌ها هستند.

سپاسگزاری

از آقای مهندس سید‌ علی کارگر و خانم دکتر نیلوفر‌‌ تشکری در پلی‌کلینیک تخصصی دانشکده دامپزشکی دانشگاه فردوسی مشهد که در اجرای این طرح و تصحیح مقاله همکاری داشتند صمیمانه سپاسگزاری می‌شود. بودجه انجام طرح از دانشگاه فردوسی مشهد و با کد 33541/3 در تاریخ 12/11/1393 تأمین گردید.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.