مقدمه

هدایت مغناطیسی سلولی یک روش جدید و نوید بخش برای رساندن هر چه مؤثرتر سلول‌ها به کانون بافت آسیب دیده می‌باشد (23). این روش طی 20 سال اخیر جهت ارتقای  توزیع و احتباس سلول‌ها در بافت هدف به کار رفته است و مکمل تزریق سیستمیک سلول‌های درمانی است. هدایت مغناطیسی سلول بر دو مرحله اصلی استوار است، شامل: اتصال ذرات آهنربایی به سلول و اعمال میدان مغناطیسی بر بافت هدف تا سلول‌های متصل به ذرات آهنربایی را پس از تزریق گیر انداخته و در بافت هدف نگه دارد. از میان همه اجزای آهنربایی موجود، نانوذرات اکسید آهن سوپرپارامغناطیس (SPIONs)، کاربردی‌ترین گزینه برای هدایت مغناطیسی هستند. چند دلیل برای این امر وجود دارد که عبارتند از: قیمت مناسب، در دسترس بودن، زیست سازگاری، جذب سلولی قابل تنظیم و سمیت کم (6).

ذرات اکسید آهن با ابعاد نانو ویژگی‌هایی دارند که کار کردن با آن‌ها را دشوار می‌کند؛ از جمله: ناپایداری ذاتی در مجاورت هوا که باعث اکسید شدن آن‌ها می‌شود. به علاوه، از آنجایی که آهن به شکل فیزیولوژیک در بدن وجود دارد، بدن قادر به متابولیسم و حذف آن از بافت هدف می‌باشد. غلظت بالای یون آهن قادر به عبور از دیواره میتوکندری و هسته بوده و سمی است؛ و آهن آزاد در میتوکندری قادر به تولید رادیکال‌های هیدروکسیل و یون‌های فریک است که به شدت واکنش دهنده و مخرب هستند (8،18،25). در نتیجه به منظور به حداقل رساندن این ویژگی‌ها، هسته‌های آهن را به کمک پلیمر‌های ارگانیک یا غیر ارگانیک پوشش می‌دهند. بدین ترتیب، علاوه بر افزایش زیست سازگاری این ذرات، امکان اتصال لیگاند‌های مختلف از جمله پادتن به سطح آن‌ها فراهم می‌شود (7).

اگرچه مطالعات زیادی در خصوص پوشش‌های مختلف SPIONs انجام شده است (اکسیدان‌های ضعیف، سورفاکتانت، فلزات گران بها، سیلیکا، پوشش‌های کربنی، سلولز، چیتوزان)، عمده آن‌ها بر سه پوشش اصلی تمرکز دارند که عبارتند از: نشاسته، پلی اتیلن گلایکول (PEG) و دکستران که هر یک ویژگی‌هایی دارند. لیکن خصوصیت مشترک آن‌ها، افزایش زیست سازگاری و پایداری نانوذرات و کاهش سمیت آن‌هاست (7،8،25).

در این میان، دکستران به دلیل زیست سازگاری بالا، به شکل گسترده‌ای مورد مطالعه قرار گرفته است و SPIONs پوشش داده شده با دکستران (DSPIONs) در ترکیب دارو‌های تجاری مورد تأیید سازمان غذا و دارو (FDA) و خصوصاً به عنوان مواد حاجب تصویر برداری MRI وجود دارند (7). همچنین، DSPIONs قابلیت تغییر سطح دارند که می‌توان پادتن، پپتید و مشتقات کوچک مولکول را به آن‌ها متصل کرد، نیمه عمر آن‌ها در جریان خون مناسب است و زیست‌ سازگارند (7،27).

هدف اکثر مطالعات پیشین در زمینه هدایت مغناطیسی سلول، وارد کردن نانوذرات اکسید آهن به داخل سیتوپلاسم سلول‎ها از طریق انتقال غیر فعال و اندوسیتوز (فاگوسیتوز و ماکروپینوسیتوز) بوده است (7). در حال حاضر تمرکز محققین به جای  اندوسیتوز نانوذرات،   بر اتصال نانوذرات به سطح سلول‎ها است، زیرا در اندوسیتوز احتمال آزاد شدن آهن در داخل سلول وجود دارد که خود مانع مهمی برای زیست‌سازگار‌پذیری روش است (2،5،26).

 هدف از انجام مطالعه حاضر تولید نانوذره آهن پوشش داده شده با دکستران و متصل به پادتن تک‌بنیانی است که قادر به اتصال به سطح سلول‌های بنیادی مزانشیمی هستند. پوشش دهی دکستران، اندازه نانوذرات، کمیت اتصال پادتن به سطح نانوذرات و اتصال نانوذرات به سطح سلول‌های هدف مورد ارزیابی قرار گرفتند.

مواد و روش کار

تولید و پوشش‌دهی SPIONs با دکستران: در مطالعه حاضر، نانوذرات مگنتیت (Fe₃O₄) با روش هم رسوبی (Co-precipitation) در اتمسفر نیتروژن تولید شدند. بدین ترتیب که نمک‌های FeCl₂ و FeCl₃ (نسبت مولی 1:2) در آب دیونیزه (DIW) حل شدند. سپس محلول دکستران در DIW اضافه و به شدت در اتمسفر نیتروژن هم زده شدند. پس از آن محلول آمونیاک 25 درصد به ترکیب اضافه شد و ترکیب به مدت 30 دقیقه در دمای 60-70 درجه سانتی گراد قرار گرفت. در نهایت برای جداسازی پلیمر اضافه و سایر ناخالصی‎ها، ترکیب نهایی در معرض دیالیز قرار گرفت. محلول مغناطیسی نهایی در g 3500 به مدت 15-10 دقیقه سانتریفیوژ شد تا مایع مغناطیسی خالص به دست آید. pH ترکیب نهایی4/7-2/7 بود (22). موفقیت پوشش دهی با دکستران به کمک طیف سنجی مادون قرمز (FT-IR) مورد بررسی قرار گرفت. همچنین ابعاد ذرات DSPIONs به وسیله میکروسکوپ الکترونی روبشی ((SEM), Hitachi, S4160) اندازه گیری شد.

اتصال پادتن به سطح DSPIONs: به منظور اتصال DSPIONs به سطح سلول‌های بنیادی مزانشیمی، از پادتن تک‌بنیانی mouse anti rabbit CD44 monoclonal antibody (BioRad, MCA806GA) استفاده شد. در سطح سلول‌های رده‌های مختلف سلولی، مارکر‌های اختصاصی وجود دارد و CD44 به عنوان یک مارکر فنوتیپی مثبت MSCs شناخته شده است. اتصال پادتن‌ها به سطح  DSPIONsبر اساس روش Chen و همکاران در سال 2006 صورت گرفت (3). بر این اساس، 75/0 میلی‌گرم از DSPIONs در 5/0 میلی لیتر محلول نمک فسفات با خاصیت بافری (PBS، 4/7=pH) حل شد. سپس 15 میکروگرم سدیم متا-پریدات اضافه و ترکیب در دمای اتاق در تاریکی به مدت 5 ساعت روی همزن مغناطیسی انکوبه شد. در مرحله بعد، 50 میکروگرم پادتن CD44 به DSPIONs فعال اضافه و محلول به مدت 16 ساعت در تاریکی در دمای 4 درجه سانتی‌گر‌اد انکوبه شد. احیاء ترکیب نهایی با اضافه کردن 15 میکروگرم سدیم سیانوبوروهیدرید در تاریکی و در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 2 ساعت صورت گرفت. در نهایت نانوذرات DSPIONs متصل به پادتن (ADSs) به کمک آهنربا در کف ویال نگه داشته و محلول رویی تخلیه شد و جهت سنجش کیفیت اتصال مورد ارزیابی قرار گرفت. این واکنش 4 مرتبه تکرار شد.

ارزیابی روند تولید ADSs: جهت ارزیابی کمی اتصال نانوذرات آهن به پادتن از روش اسپکتروفوتومتری با معرف برادفورد استفاده شد. بدین منظور، نمودار استاندارد طبق دستور العمل کیت پروتئین سنجی برادفورد (کالازیست) ترسیم و پروتئین سنجی در محلول رویی تولید شده که حاوی پادتن‌های آزاد (غیر متصل به نانوذرات) بود، در طول موج 595 نانومتر انجام شد (Eppendorf, Netheler, Hinz GmbH, 613101427).  میزان پادتن متصل به نانوذرات آهن در هر مرحله، از تفاضل مقدار پروتئین موجود در محلول رویی از مقدار کلی آنتی‌بادی مورد استفاده محاسبه شد (5).

استخراج و کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان: جهت استخراج و کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی، از رهیافت استاندارد مورد استفاده در پژوهشکده تحقیقات زیست پزشکی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران استفاده شد (12). بدین منظور، نمونه مغز استخوان از استخوان بازو خرگوش سفید نیوزلندی نر بالغ با وزن تقریبی 5/2 تا 3 کیلوگرم اخذ شد. به ازای هر 3 میلی‌لیتر مغز استخوان، 1000 واحد هپارین مورد استفاده قرار گرفت. سپس نمونه‌ها به آزمایشگاه سلول‌های بنیادی و مهندسی بافت دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران منتقل و روند استخراج سلولی در شرایط آسپتیک ادامه یافت. نمونه‌ها با حجم مساوی DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) مخلوط شدند. بعد از جداسازی لخته‌های احتمالی موجود، به شکل دو فاز روی فایکول ریخته شدند و به مدت 30 دقیقه در سانتریفیوژ g 400 قرار گرفتند. بدین ترتیب سلول‌های تک هسته‌ای از گلبول‌های قرمز جدا شد و پس از مخلوط شدن با DMEM، 2 بار و هر مرتبه به مدت 5 دقیقه در g 400 سانتریفیوژ شدند. در نهایت محلول رویی حذف شد و پلت سلولی حاصل در محیط حاوی 80 درصد DMEM، 20 درصد FBS (Fetal Bovine Serum) و 1 درصد آنتی بیوتیک پنیسیلین استرپتومایسین در فلاسک 25 سانتی متر مربع، در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد با 5 درصد دی اکسید کربن و 97 درصد رطوبت مورد کشت قرار گرفت. سلول‌‌ها تا پاساژ سوم کشت داده شدند و ماهیت مزانشیمی آن‌ها با استفاده از پادتن‌های فایکواریترین- کنژوگه متمایل به CD45، CD90، CD34 و CD29 مورد بررسی قرار گرفت. همچنین توان تمایز این سلول‌ها به رده استخوانی، غضروفی و چربی مورد سنجش قرار گرفت (17).

اتصال ADSs به MSCs: بدین منظور، 1 سی سی تریپسین روی سلول‌های فلاسک 25 سانتی متر مربع ریخته شد و فلاسک به مدت 3 دقیقه در انکوباتور قرار گرفت. پس از اطمینان از جدا شدن سلول‌ها از کف فلاسک، از 20 درصد FBS برای خنثی کردن تریپسین استفاده شد. سلول‌ها به مدت 30 دقیقه در معرض ADSs با غلظت 60 میکروگرم آهن به ازای 10⁶ سلول در انکوباتور قرار داده شدند و در این مدت 4-3 مرتبه روی لرزاننده قرار گرفتند.

ارزیابی ترکیب MSCs-ADSs: جهت بررسی و تأیید اتصال ADSs به MSCs از سه روش ارزیابی رنگ آمیزی اختصاصی آهن پروسین بلو، آنالیز ایمونوفلورسنت و ارزیابی SEM استفاده شد.

رنگ آمیزی اختصاصی آهن: تعداد 50000 سلول در هر گوده از پلیت 6 گوده قرار گرفت و پس از 24 ساعت (ایجاد چسبندگی به کف گوده‌ها)، سه گروه کنترل منفی، DSPION و ADS در نظر گرفته شد. در گروه‌های DSPIONs و ADS، سلول‌ها به مدت 30 دقیقه در معرض ترکیب‌های هم نام با غلظت 60 میکروگرم آهن به ازای 10⁶ سلول (حجم نهایی 500 میکرولیتر در PBS) انکوبه شدند و در گروه کنترل حجم مشابه PBS اضافه شد. برای هر گروه سه تکرار در نظر گرفته شد. در نهایت، شست و شو با PBS صورت گرفت و سلول‌ها در پارافرمالدهید 4 درصد تثبیت شدند. رنگ آمیزی اختصاصی Prussian Blue که در آن سیتوپلاسم سلول‌ها به رنگ صورتی و رسوبات آهن به رنگ آبی دیده می‌شوند انجام شد (13). تعداد هسته‌ها در یک نمای میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 40× شمارش و درصد سلول‌های متصل به ذرات آهن تخمین زده شد. این اندازه‌گیری سه مرتبه تکرار شد.

آنالیز ایمونوفلورسنت: جهت انجام این بررسی، پس از تریپسینه کردن سلول‌ها، پلت سلولی روی لام گسترش داده شد و تثبیت با استون 80 درصد در DIW، به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد صورت گرفت. سپس سلول‌ها 3 مرتبه با PBS شسته شدند و به مدت 30 دقیقه در معرض ADS قرار گرفتند. در نهایت پس از شست و شو با PBS، آنتی‌بادی ثانویه FITC Goat anti mouse antibody (Abcam, Ab6785) با رقت 2000/1 در تاریکی به سطح گسترش اضافه و 20 دقیقه زمان داده شد. در نهایت شست و شو با PBS انجام و سلول‌ها توسط میکروسکوپ فلورسنت (Olympus Optical Co; LTD, BH2-RFL-T3) دیده شدند. درصد سلول‌هایی که رنگ فلورسنت را نشان می‎دادند، در سه نمای میکروسکوپ با بزرگ نمایی 40 محاسبه شد.

آنالیز SEM: سلول‌های تریپسینه شده به مدت 30 دقیقه در معرض ADS قرار گرفتند و پس از طی مراحل آماده سازی طبق دستورالعمل‌های استاندارد مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک (IBB) دانشگاه تهران، از آنالیز SEM جهت به تصویر کشیدن ترکیب MSCs-ADSs استفاده شد.

نتایج

بررسی ابعاد نانوذرات و موفقیت پوشش دهی با دکستران: به منظور بررسی پوشش دهی نانوذرات آهن با دکستران، FT-IR اسپکتروسکوپی انجام شده و ساختار شیمیایی نانوذرات با توجه به حضور گروه‌های شیمیایی مربوطه در ترکیب مورد مطالعه به تأیید رسید. فرکانس ارتعاشی کششی Fe-O در ترکیب Fe₃O₄، به شکل یک قله در cm^-1 588 نشان داده شده است. همچنین، قله‌های cm^-13200 و cm^-1 2922 به ترتیب نشان دهنده فرکانس ارتعاشی کششی هیدروکسیل و C-H دکستران هستند. نواری که در ناحیه cm^-1 1608 دیده می‎شود نشان دهنده پیوند هیدروژنی بین آب و دکستران است. (تصویر .A1) قطر تقریبی نانوذرات پوشش داده شده با دکستران به کمک میکروسکوپ الکترونی SEM  حدود 67/6±13/56 نانومتر اندازه‌گیری شد (تصویر .B1).

ارزیابی میزان اتصال پادتن به DSPIONs: تولید ترکیب ADSs در 4 مرحله و هر مرتبه با 50 میکروگرم آنتی‌بادی اولیه انجام شد. بر اساس نتایج سنجش با استفاده از معرف برادفورد، متوسط درصد پادتن متصل به DSPIONs، معادل 35/6±57/77 اندازه‌گیری شد.

اتصال ADSs به سلول‌های بنیادی مزانشیمی: در رنگ‌آمیزی اختصاصی آهن، حضور آهن در گوده‌های گروه ADS به خوبی قابل مشاهده بود و به طور میانگین، از هر 100 سلول، رنگ آبی نانوذرات آهن در مجاورت 53/2±57/71 سلول دیده ‌شد. همچنین در گوده‌های DSPION نیز مقادیر کمی رسوب آهن به شکل تجمع کانونی در چند قسمت از پلیت وجود داشت. لیکن در گروه کنترل هیچ ذره آهنی دیده نشد (تصویر 2). تصاویر آنالیز ایمونوفلورسنت هم حضور آنتی بادی‌های مربوطه در سطح سلول‌ها را با کیفیت اتصال 95/4±0/95 درصدی نشان داد (تصویر 3). همچنین اتصال ADSs به MSCs توسط میکروسکوپ الکترونی SEM به تصویر کشیده شد (تصویر 4).

بحث

در موضوع هدایت مغناطیسی سلولی، ابعاد ذره و شیمی لایه پوشاننده آن عوامل مهمی در توانایی اتصال ذرات به سلول هستند (6). در این مطالعه، نانوذرات اکسید آهن سوپرپارامغناطیس تولید و توسط پلیمر دکستران پوشش داده شدند. موج‌هایی که در نمودار FT-IR مشاهده می‌شود هر یک نشان دهنده حضور پیوند شیمیایی مشخصی است. بنابر نتایج، در نمودار ترکیب تولید شده در این مطالعه، علاوه بر موج ناحیه cm^-1 588 که نشان دهنده فرکانس ارتعاشی Fe-O و در واقع تأیید حضور آهن است، موج‌های نواحی cm^-1 3200، cm^-1 2922 و cm^-1 1608 به ترتیب به حضور پیوند‌های هیدروکسیل، C-H و پیوند هیدروژنی آب-دکستران دلالت دارند و همگی پوشش دهی نانوذرات با دکستران را تأیید می‌کنند. همچنین، در این مطالعه، میانگین اندازه ذرات ADSs حدود 67/6±13/56 نانومتر اندازه‌گیری شد. در بسیاری از مطالعات اندازه بهینه ذرات برای ورود به سلول‌های غیر فاگوسیت کننده، 20 تا 100 نانومتر بیان شده است (6). در مطالعه‌ای که Cheng و همکاران در سال 2014 با هدف اتصال نانوذرات به سطح سلول انجام دادند، فروموکسیتول (یک مکمل آهن تجاری جهت درمان کم خونی ناشی از فقر آهن در بیماران مزمن کلیوی با نام تجاری Feraheme^®) به عنوان منشأ نانوذرات آهن پوشش داده شده با دکستران مورد استفاده قرار گرفت که اندازه تقریبی آن حدود 50 نانومتر بود (5). اندازه ذرات ADSs تولید شده در این مطالعه با موارد فوق هم خوانی دارد و در مقایسه با اندازه ذرات در مطالعه Chen و همکاران در سال 2013 که برای اتصال نانوذرات آهن به سطح سلول‌ها از پوشش پلی اتیلن گلایکول در سطح نانوذرات استفاده کردند، کوچک‌تر است. اندازه ذرات مورد استفاده در مطالعه آن‌ها در دامنه 90 تا 100 نانومتر قرار داشت (2).

سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSCs) بهترین منشأ سلول پیشگام برای درمان‌های مبتنی بر سلول هستند و بنیاد طب بازساختی (regenerative medicine) را تشکیل می‌دهند (7،23). در این مطالعه نانوذرات آهن با تمایل اتصال به MSCs تولید شدند و بدین منظور پادتن تک‌بنیانی CD44 با کارآمدی 35/6±57/77 درصدی در سطح ADSs قرار گرفت. این مقدار در مطالعه  Cheng و همکاران در سال 2014 که پادتن CD34 را به کمک کیت اختصاصی Poly-link protein coupling kit به سطح نانوذرات فروموکسیتول متصل کردند، 80 درصد گزارش شد (5).

در نهایت اتصال ADSs به MSCs به کمک رنگ آمیزی پروسین بلو، ارزیابی ایمونوفلورسنت و تصاویر SEM به تأیید رسید. به طور مشابه، Sugioka و همکاران در سال 2007، از پادتن CD44 رت استفاده کرده و آن‌ها را به سطح یک بستر متشکل از ذرات مغناطیسی کوچک اندازه (ferri sphere 100^®) متصل کردند. بدین ترتیب سلول‌های MSC رت را به سطح بستر مغناطیسی وصل کردند (26). Cheng و همکاران در سال 2014، از سلول‌های رده هماتوپویتیک (HSC) استفاده کردند و جهت نشانه‌گذاری آن‌ها از اتصال پادتن CD34 که اختصاصی این رده سلولی است در سطح SPIONs پوشش داده شده با دکستران استفاده کردند. بر اساس نتایج رنگ آمیزی پروسین بلو و ایمونوفلورسنت، HSCs به خوبی به نانوذرات متصل شدند (5). Chen و همکاران در سال 2013، از پوشش پلی اتیلن گلایکول در سطح نانوذرات استفاده کردند و همانند Cheng، پادتن CD34 را در سطح آن‌ها متصل کردند. با این وجود، نتایج آن‌ها هم حاکی از نشانه‌گذاری موفقیت آمیز HSC توسط این ذرات بود (2).

به دلیل ویژگی‌های بیولوژیک SPIONs، ایده هدایت مغناطیسی شکل گرفت و در ابتدا راهکاری برای رساندن مواد مختلف از جمله دارو، پادتن و توکسین به ساختارهای هدف خود بود (1،10،15،16،28). از این روش برای مقاصد درمانی مثل هایپرترمی القایی با آهن‌ربا جهت درمان تومورهای بدخیم (11)، یا تشخیصی مثل تشخیص زود هنگام سرطان پروستات (1) استفاده ‌شد. با پیشرفت دانش و فنون زیست پزشکی، هدایت مغناطیسی سلولی مورد توجه محققین قرار گرفت و در دهه اخیر مطالعات بسیاری در این راستا صورت گرفته است (3،4،9،12،13،14،19،24،26،29). اکثر مطالعات انجام شده بر وارد کردن نانوذرات به داخل سلول‌ها تمرکز دارند، در حالی‌که با اتصال نانوذرات به سطح سلول می‌توان از آزاد شدن آهن به داخل آن‌ها پیش‌گیری و زیست سازگاری نانوذرات را افزایش داد (2،5،26). همچنین از این طریق، امکان اتصال هم زمان لیگاندهای متفاوت به سطح نانوذرات فراهم می‌شود (2،27).

با توجه به نتایج ذکر شده، ترکیب نهایی حاصل از پوشش دهی نانوذرات سوپرپارامغناطیس آهن توسط دکستران و اتصال پادتن CD44 به سطح آن، به خوبی قادر به اتصال به سلول‌های بنیادی مزانشیمی است. در ادامه می‌توان از این محصول جهت مطالعات بعدی در خصوص زیست سازگاری و سایر ارزیابی‌های in-vitro و in-vivo مربوط به هدایت مغناطیسی به شکل ابزار هدایت مغناطیسی سلول بهره برد.

سپاسگزاری

بدین وسیله از معاونت پژوهشی دانشگاه تهران جهت تأمین بخشی از هزینه‌های این طرح در قالب رساله دکتری تخصصی، از پژوهشکده تحقیقات زیست پزشکی واقع در دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، جهت تأمین بخش عمده هزینه‌ها و در اختیار قرار دادن تمام مواد و لوازم و تسهیلات مورد نیاز جهت انجام بخش سلولی مطالعه حاضر و نیز از آزمایشگاه شیمی پلیمر واقع در دانشکده شیمی پردیس علوم پایه دانشگاه تهران جهت همکاری در تولید ترکیب نانوذرات آهن سوپرپارامغناطیس تشکر به عمل می‌آید. همچنین از حمایت مالی پارک علم و فناوری دانشگاه تهران از این مطالعه در قالب اعتبار شماره 5441574 قدردانی می‌گردد.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.