مقدمه

کرم‌ها موجودات انگلی هستند که بیشتر از یک میلیارد نفر در دنیا به آن‌ها آلوده‌اند (9). آلودگی به کرم‌های انگلی می‌توانند آسیب‌های پاتولوژی مانند گرانولوماتوز و ازکارافتادگی اعضا را ایجاد کنند. اما اغلب بین انگل و میزبان هماهنگی ایجاد می‌شود به‌طوری که آلودگی معمولاً بدون علائم بوده و منجر به مرگ نمی‌شود. مطالعات اخیر نشان می‌دهد که آلودگی به کرم‌ها سبب تعدیل پاسخ‌های ایمنی می‌شود. آلودگی‌های کرمی سبب کاهش التهاب در برابر آلودگی با باکتری‌ها و تک‌یاخته‌ها می‌شود. همچنین برخی مطالعات، اثر این آلودگی‌ها را بر کاهش واکنش‌های حساسیت‌زا نیز نشان داده است. یکی از ویژگی‌های حفاظتی ناشی از آلودگی‌های کرمی، جهت‌دار شدن پاسخ ایمنی میزبان به سمت فعال شدن سلول‌هایTh2  و سلول‌هایT- regulatory است (9).

گونه‌های توکسوکارا قادر به حمله به طیف گسترده‌ای از میزبان‌ها ازجمله بی‌مهرگان، پرندگان، موش و انسان هستند (2,3). در مرحله نوزادی این انگل قادر است به مدت طولانی در بدن انسان بماند و چرخه زندگی را در بدن میزبان حامل به حالت تعلیق درآورد و در صورت رسیدن به یک میزبان سگ‌سان بالغ شود. درصورتی‌که سگ‎سانان ماده به این انگل آلوده شوند تا زمان بارداری، انگل در بافت‌های سگ‌سانان ماده باقی می‌ماند و سپس از طریق جفت یا شیر به توله‌ها منتقل می‌شود (24).

توکسوکارا کنیس انگل روده‌ای شایع سگ‌ها و عامل بیماری توکسوکاریازیس احشایی و توکسوکاریازیس چشمی در انسان است. توکسوکاریازیس رایج‌ترین عفونت کرمی در بسیاری از کشورهای معتدل است و سبب بروز عوارض شدید می‌شود (13،18،20،25). چرخه زندگی این انگل در سگ‌سانان تکمیل می‌گردد، تخم‌هایی که توسط سگ‌سانان دفع می‌شوند توانایی آلوده ساختن میزبان‌های متنوعی از جمله انسان را دارند. در میزبان‌های غیرسگ‌سان نوزاد مرحله دوم که از تخم خارج شد، در بافت‌های نرم مانند قلب و مغز میزبان مهاجرت می‌کند و برای مدت چند ماه تا چند سال در این بافت‌ها بدون رشد یا تغییر باقی می‌ماند (13).

برای پی‌بردن به توانایی زنده ماندن این نوزادها در بدن میزبان و چگونگی تعدیل ایمنی میزبان، باید محصولات ژنی تولیدی در این مرحله را بررسی کرد، مانند لکتین نوع سی که با لکتین نوع سی پستانداران مشابه است (25).

لکتین نوع سی از خانواده پروتئین‌های carbohydrate-binding است که در واکنش‌های ایمنی نقش دارد (17). پروتئین لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس چهار نوع است. نوع یک و چهار پروتئین‌های دفعی-ترشحی هستند. غلظت نوع یک در بین پروتئین‌های دفعی-ترشحی بیشتر است. این پروتئین‌ها در تعدیل سلول‌های ایمنی نقش دارند و سبب کاهش واکنش‌های التهابی در میزبان می‌شوند. لذا این پروتئین‌ها می‌توانند جهت مطالعات ایمنی‌شناسی و به‌ویژه کرم‌درمانی مورد توجه قرار گیرند.

لکتین نوع سی ترشح‌ شده از کرم‌های انگلی با لکتین‌های موجود در سلول‌های ایمنی پستانداران مانند موش تشابه دارد. لذا عملکرد این پروتئین در سلول‌های موش قابل پیش‌بینی است. لکتین نوع سی یک (CTL-1) توکسوکارا کنیس، یک پروتئین سطحی است و به سیستم ایمنی سلولی و هومورال عرضه می‌شود (6). لذا پیش‌بینی می‌شود این پروتئین بر روند‌های تعدیل سلول‌های ایمنی تأثیر داشته باشد. بنابراین می‌توان این پروتئین را به‌ عنوان یک کاندیدا جهت مطالعات کرم‌درمانی حائز اهمیت دانست. همه پروتئین‌های نوترکیب به‌طور یکسان در اشریشیا کلای بیان نمی‌شوند و نیاز به بهینه‌سازی شرایط برای دستیابی به بیشترین بیان، وجود دارد. بنابراین هدف اصلی مطالعه حاضر بهینه‌سازی شرایط برای دستیابی به بیشترین بیان پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی در باکتری اشریشیا کلای سویه BL21(DE3) است.

مواد و روش کار

در مطالعه حاضر دو سویه باکتری اشریشیا کلای به نام‌های BL21(DE3) و BL21 استفاده شد. پلاسمید pET32a نیز به‌ عنوان وکتور بیانی در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت.

سنتز ژن و ORF کدکننده لکتین نوع سی براساس ژن ثبت شده در بانک ژن: توالی نوکلئوتیدی مربوط به لکتین نوع سی انگل توکسوکارا کنیس از بانک ژن استخراج شد. سپس پلاسمید pET32a حاوی توالی مورد نظر توسط شرکت GENERAY سنتز شد. جایگاه شناسایی آنزیم‌های BamH1 و EcoR1 بر روی توالی مورد نظر اضافه شدند. به‌ منظور سنتز پلاسمید نوترکیب توالی لکتین نوع سی به همراه دو جایگاه برش آنزیمی و کدون متوقف کننده به شرکت ارائه گردید.

ترانسفورماسیون در باکتری اشریشیا کلای سویه DH5α و غربالگری سلول‌های حاوی ژن لکتین نوع سی: ﭘﻼﺳﻤﯿﺪ ﻧﻮﺗﺮﮐﯿﺐ به باکتری اشریشیا کلای سویه DH5α به‌ عنوان میزبان اولیه برای تکثیر پلاسمید نوترکیب با روش شوک حرارتی منتقل شد. جهت تأیید ترانسفورماسیون از کلنی‌های تشکیل ‌شده بر روی محیط LB حاوی آنتی بیوتیک آمپی‌سیلین (100 میلی گرم بر میلی لیتر) به شکل تصادفی و با استفاده از پرایمر‌های یونیورسال T7 کلنی PCR انجام شد. استخراج پلاسمید با استفاده از کیت استخراج پلاسمید (MBST, Iran) و طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. پلاسمید استخراج ‌شده، به باکترهای اشریشیا کلای سویه‌های BL21(DE3) و BL21 جهت بیان ژن به روش شوک حرارتی منتقل شد.

ترانسفورماسیون در باکتری اشریشیا‌کلای BL21(DE3) و BL21: جهت بیان پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی (CTL) کلنی‌های حامل پلاسمید نوترکیب در محیط LB حاوی آنتی بیوتیک آمپی‌سیلین (100 میلی گرم بر میلی لیتر) در حرارت 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 18 ساعت کشت داده شد. از این محیط کشت به میزان 200 میکرولیتر به 20 میلی‌لیتر محیط کشت حاوی آمپی‌سیلین (100 میلی گرم بر میلی لیتر) اضافه شد. سپس محیط کشت در دو دمای 32 و 37 درجه سانتی‌گراد مورد بررسی قرار گرفت. پس از این که تعداد باکتری به حد مناسب رسید (Optical Density=0.6 در طول موج 600 نانومتر)، القا بیان پروتئین با استفاده از IPTG (شرکت Sigma آمریکا) در غلظت 1 میلی مولار صورت گرفت. نمونه گیری در ساعت صفر، یک، دو، سه و چهار پس از القا IPTG (در پنج نوبت) انجام شد. رسوب باکتری جمع‌آوری شد. به رسوب حاصل 70 میکرولیتر بافر لیز کننده اضافه و به مدت 1 ساعت با دور تند مخلوط شد. محصول در rpm 8000 سانتریفیوژ شد و محلول رویی و رسوب حاصل با روش SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت.

خالص‌سازی پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی (CTL): جهت تخلیص پروتئین از کیت (QIAGEN)Ni-NTA spin و مطابق با دستورالعمل کیت استفاده شد. به منظور شناسایی پروتئین نوترکیب و تأیید بیان آن از روش دات‌بلات با استفاده از سرم انسان مبتلا به توکسوکارا استفاده شد.

بررسی بیان پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی با استفاده از روش دات‌بلات: نمونه‌های پروتئینی استخراج‌شده با غلظت 116 میکروگرم در میلی‌لیتر بر روی کاغذ نیتروسلولز (BIORAD) لکه‌گذاری شدند. سپس نقاط غیراختصاصی موجود بر روی کاغذ توسط بافر بلوکه­کننده PBST (phosphate bffer saline +tween20) حاوی 5 درصد شیر خشک بدون چربی بلوکه شدند. پس از انجام سه مرحله شستشو با بافر PBSTسرم مثبت توکسوکاریازیس انسانی، مثبت شده با کیت تجاری و مورد تأیید پزشک بالینی، با رقت 1:1000 اضافه شد و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه گردید. سپس پنج مرحله شستشو مانند قبل انجام شد. پس از آن آنتی‌بادیAnti Human-IgG متصل به آنزیم HRP (Razi biotech) در رقت 5000:1 اضافه و به مدت 1 ساعت انکوبه گردید. پنج مرحله شستشو مانند قبل انجام شد. در پایان کاغذ با سوبسترای رنگی DAB (Sigma) در حضور پراکسیدهیدروژن به عنوان سوبسترا آنزیم در محیط تاریک به مدت 5 دقیقه انکوبه شد.

نتایج

پلاسمید نوترکیب استخراج‌شده به باکتری اشریشیا کلای BL21(DE3) و BL21 منتقل شد. برای تأیید انتقال درست کلنی PCR با استفاده از پرایمرهای یونیورسال T7 انجام شد. محصول PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز شد (تصویر1). پس از القا بیان پروتئین با استفاده از IPTG، سوسپانسیون حاصل به روش SDS-PAGE و به کمک نشانگر پروتئینی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج بررسی نشان‌دهنده‌ بیان پروتئین نوترکیب CTL به وزن 41 کیلودالتون بود (تصویر2). در بررسی محصول تخلیص پروتئین با روش SDS-PAGE نیز باندی به وزن 41 کیلودالتون مشاهده شد (تصویر3). ارزیابی ایمنی‌زایی پروتئین نوترکیب CTL به روش دات‌بلات نشان‌دهنده‌ قابلیت واکنش این پروتئین با سرم جدا شده از خون فرد مبتلا به توکسوکاریازیس بود (تصویر4).

در مطالعه حاضر بیان پروتئین نوترکیب CTL در پلاسمید pET32a و تحت شرایط متفاوت مورد ارزیابی قرار گرفت.

مقایسه بیان پروتئین نوترکیب در سویه‌های مختلف اشریشیا کلای: در مطالعه حاضر بیان پروتئین نوترکیب در باکتری اشریشیا کلای سویه‌های BL21(DE3) و BL21 مورد بررسی قرار گرفت. پروتئین نوترکیب در باکتری اشریشیا کلای سویه BL21 بیان نشد و یا به مقدار بسیار کم بیان شد به طوری که با روش SDS-PAGE قابل‌ مشاهده نبود؛ اما در باکتری اشریشیا کلای سویه BL21(DE3) باند به وزن 41 کیلودالتون مربوط به پروتئین نوترکیب CTL به روش SDS-PAGE به‌ وضوح قابل مشاهده بود (تصویر 2).

مقایسه تأثیر دما بر بیان پروتئین نوترکیب در سویه‌های مختلف اشریشیا کلای: در مطالعه حاضر بیان پروتئین در دو دمای 32 و 37 درجه سانتی گراد در باکتری اشریشیا کلای BL21(DE3) مقایسه شد. نتایج نشان داد که بیان باکتری در دمای 37 درجه سانتی‌گراد قابل قبول بود. و در ادامه آزمایش‌های بعد القا در 37 درجه سانتی‌گراد انجام شد.

مقایسه تأثیر غلظت IPTG بر بیان پروتئین نوترکیب سویه‌های مختلف اشریشیا کلای: در مطالعه حاضر بیان پروتئین نوترکیب CTL در دو غلظت 1 و 5/0 میلی‌مولار IPTG مورد بررسی قرار گرفت. که در غلظت 1 میلی‌مولار باند مربوط به پروتئین مورد نظر قابل ‌مشاهده بود.

بحث

به‌ منظور تولید پروتئین نوترکیب انتخاب میزبان مناسب بسیار مهم است. طیف گسترده‌ای از میزبان‌ها برای بیان پروتئین‌ها در دسترس هستند. پروتئین‌ها را می‌توان در کشت سلول‌های باکتریایی، مخمر، قارچ‌های رشته‌ای، حشرات، پستانداران یا گیاهان تولید کرد. امروزه علاوه بر کشت‌های سلولی، تولید پروتئین‌ها در گیاهان و حیوانات تراریخت نیز مرسوم است. پروتئین‌های بزرگ عموماً در سیستم‌های یوکاریوتی و پروتئین‌های کوچک در سیستم‌های پروکاریوتی بیان می‌شوند. یکی از راه‌های متداول تولید پروتئین‌های دارویی، تهیه آن‌ها به‌ صورت نوترکیب است. در این روش می‌توان از میزبان‌های یوکاریوت و پروکاریوت متعددی بهره برد، اما استفاده از باکتری اشریشیا کلای به دلیل سهولت کشت و دست‌کاری آسان در مقام نخست قرار دارد (21،28). در مطالعاتی که توسط افراد مختلف انجام شده، پروتئین‌های نوترکیب متفاوتی در این باکتری بهینه سازی شده است و در هر مورد شرایط کشت، دمای پس از القا، مدت زمان پس از القا یا غلظت القاگر مورد ارزیابی قرار گرفته است (1،12،21،23،28).

از اوایل سال 1900، زمانی که تنها منابع اصلی در دسترس گیاهان و حیوانات بودند، پروتئین‌ها به عنوان عوامل درمانی مهم مورد توجه بودند. با استخراج انسولین از پانکراس خوک در سال 1920، استفاده از پروتئین‌ها آغاز گردید. با این‌ حال در سال 1970 با ظهور تکنولوژی DNA نوترکیب مشاهده گردید که پروتئین‌های دارویی نوترکیب می‌توانند به ‌وسیله‌ی باکتری اشریشیا کلای با یک روش قدرتمند و مقرون به‌صرفه تولید شوند. در اوایل 1980 انسولین نوترکیب تولید شده به‌وسیله‌ باکتری اشریشیا کلای برای درمان دیابت توسط سازمان غذا و داروی آمریکا تأیید شد و درهای جدیدی را بر روی تولید سایر داروهای نوترکیب گشود. امروزه بیش از 151 داروی نوترکیب مجزا توسط سازمان غذا و داروی آمریکا برای کاربردهای مختلف پزشکی تأییدیه گرفته­اند که یک ‌سوم از این پروتئین‌ها در باکتری اشریشیا‌کلای تولید می‌‌شوند (2،16).

Savari و همکاران در سال 2015 نشان دادند که به‌ منظور دستیابی به بیشترین میزان تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب در باکتری اشریشیا کلای بهترین محیط کشتTB ، بهترین دمای کشت ۲۵ درجه سانتی گراد و بهترین زمان پس از القا 1 ساعت است (23).

Azaman و همکاران در سال 2010 تولید اینترفرون آلفا را در پریپلاسم باکتری اشریشیا کلای بهینه‌سازی و غلظت IPTG ۵/۰ میلی‌مولار و دمای ۲۵ درجه سانتی گراد را به ‌عنوان شرایط بهینه معرفی کردند (1). Gholami و همکاران در سال 2017 بهینه‌سازی تولید B-NGF نوترکیب را در باکتری اشریشیاکلای در مقیاس آزمایشگاهی انجام دادند و بهترین غلظت القاگر IPTG، دمای پس از القا و زمان پس از القا را به ترتیب ۱ میلی‌مولار، ۲۵ درجه سانتی گراد و ۲ ساعت به‌دست آوردند (12).

شایان ذکر است که اغلب این بررسی‌ها در مقیاس آزمایشگاهی و در ظروف کشت انجام شده است. بررسی‌های انجام‌ شده در ظروف کشت حاکی از این مطلب است که در مورد هر پروتئین نوترکیب، شرایط کشت و القا مثل غلظت القاگر، دمای پس از القا و زمان پس از القا متفاوت است و در هر مورد باید به ‌منظور دستیابی به بیشترین بازده تولید، بهینه­سازی این عوامل صورت پذیرد (27).

در این مطالعه بیان پروتئین نوترکیب CTL انگل توکسوکارا کنیس با استفاده از پلاسمید بیانی PET32a در باکتری اشریشیاکلای با موفقیت انجام گرفت. با هدف افزایش کارایی این پلاسمید، یک توالی خاتمه دهنـده رونویسی و دو جایگاه برش آنزیم‌های BamHI و EcoRI به ساختار آن افزوده شد.

حامل‌های بیانی متعددی در پروکاریوت‌ها وجود دارد که از مهم‌ترین آن‌ها می‌توان به pET32a، pET28a وpET21a اشاره کرد، که از این میان pET32a به دلیل داشتن ژن Trx دو جایگاه Histidin Tag و یک جایگاه S.Tag و ژن مقاومت به آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین بسیار پر کاربرد است. ژن Trx دارای 109 اسید‌آمینه است و با اتصال به انکلوژن بادی باعث محلول شدن پروتئین می‌شود، وجود Histidin Tag در این وکتور، قدرت شناسایی پروتئین مورد نظر را نسبت به سایر حامل‌ها دوچندان می‌کند (14). مطالعه‌ای که توسط Farjadi و همکاران در سال 2013 انجام شد نشان داد که پروتئین نوترکیب CagA هلیکوباکتر پیلوری در حامل pET32a و در میزبان اشریشیا کلای به‌خوبی قابل بیان است. نتایج این مطالعه همچنین نشان داد که پروتئین نوترکیب مذکور خاصیت آنتی ژنی خود را حفظ کرده و جهت استفاده در روش‌های تشخیصی سرم‌شناسی قابل استفاده است (7).

بنابراین در مطالعه حاضر نیز از پلاسمید pET32a که می‌تواند ژن مورد نظر را به‌طور اختصاصی و به مقدار زیاد بیان کند، استفاده شد. اشریشیا کلای به‌عنوان میزبان برای بیان پروتئین‌های نوترکیب در صنعت و مطالعات تحقیقاتی مورد استفاده قرار می‌گیرد (4). میزبان‌های بیانی فاقد پروتئازهای سیتوپلاسمی (از جمله DegP, OmpT, HtpR) هستند و به دلیل داشتن عناصر تنظیمی و موتاسیون در پروتئازهایشان امکان بیان بیشتر پروتئین‌های نوترکیب را فراهم می‌کنند (15). در مطالعه حاضر پروتئین تولید شده دارای وزن مولکولی 41 کیلو‌دالتون بود که این وزن حاصل اضافه شدن 160 اسیدآمینه از ناقل پلاسمیدی به پروتئین نوترکیب بود. همچنین انتقال اولیه پلاسمید نوترکیب به سویه DH5α، به طور معنی‌داری باعث افزایش بیان پروتئین شد. در مطالعه حاضر دمای بیان و همین‌طور نوع باکتری و شرایط بیان مورد مقایسه قرار گرفت و نتایج نشان داد که با استفاده از باکتری اشریشیا کلای سویه BL21(DE3) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد بیشترین بیان پروتئین حاصل می‌شود.

به‌ منظور بهینه‌سازی بیان پروتئین نوترکیب فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی در باکتری اشریشیا کلای سویه BL21(DE3) Fazeli و همکاران در سال 2019، اقدام به بهینه سازی بافر لیز کننده نمودند و نتایج نشان داد که این بهینه‌سازی باعث جلوگیری از تجمع اولیه انکلوژن بادی‌ها و بهبود بیان شده است (8). Santos و همکاران در سال 2018 برای بیان پروتئین‌های TES-30 و TES-120 توکسوکارا کنیس از وکتور Pae و باکتری اشریشیا کلای سویه BL21star استفاده کردند. حساسیت و ویژگی این پروتئین‌های نوترکیب به‌عنوان آنتی‌ژن‌های (پادگن‌های) تشخیصی در روش‌های سرم شناسی ارزیابی شدند و نتایج نشان داد که از حساسیت و ویژگی قابل قبول برخوردار هستند (22). Brown و همکاران در سال 2007 لکتین نوع سی انگل انکیلوستوما سیلانیکوم را با استفاده از وکتور pMT/BiP/V5-His درسیستم یوکاریوتی Drosophila S2 cell بیان کردند (3). سیستم‌های یوکاریوتی هزینه بالاتری را به تحقیقات تحمیل می‌کنند لذا اگر بیان در سیستم‌های پروکاریوتی، از حساسیت و ویژگی قابل ‌قبول برخوردار باشند محققان ترجیح می‌دهند از این روش استفاده نمایند. Fong و همکاران در سال 2003 برای بیان پروتئین TES-120 توکسوکارا کنیس از وکتور بیانی pTrcHis2C استفاده نمودند که در سیستم پروکاریوتی موفقیت آمیز بود. نتایج آن‌ها این پروتئین نوترکیب را به ‌عنوان یک آنتی‌ژن اختصاصی مناسب جهت تشخیص سرم‌شناسی معرفی کرد (10).

در مطالعه حاضر القا بیان ژن بعد از 4 ساعت با IPTG یک میلی مولار بهترین نتیجه را نشان داد (تصویر 2،3). لازم به ذکر است که بیان پروتئین نوترکیب در باکتری اشریشیا کلای علیرغم مزایای بسیاری که دارد با مشکلاتی همراه است. بیان باند دی سولفیدی در اشریشیا کلای با مشکل مواجه است، همچنین پروتئین‌هایی که در اشریشیا کلای تولید می‌شوند به صورت غیرگلایکوزیله هستند و به همین دلیل آنتی‌بادی‌های تولید شده توسط اشریشیا کلای در شناسایی پروتئین‌های پستانداران با شکست روبرو می‌شوند. این پروتئین‌ها با اندوتوکسین‌ها تولید می‌شوند و کشت در تراکم بالا نیز منجربه تولید استات می‌شود که روی سلول اثر سمی دارد. به‌طور معمول، پروتئین‌هایی که در سیتوپلاسم بیان می‌شوند، انکلوژن بادی تشکیل می‌دهند، علاوه بر آن اشریشیا کلای قادر نیست زیر واحدهای پروتئینی را به شیوه‌ای مناسب متصل سازد و پروتئین فعال تولید کند. از مهم‌ترین مشکلات بیان پروتئین در این سیستم می‌توان به عدم بیان پروتئین و یا بیان به میزان کم، شکل‌گیری انکلوژن بادی، غیرفعال بودن پروتئین اشاره کرد، البته راه‌کارهایی جهت رفع این مشکلات ارائه شده است (5،19،21). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که پروتئین نوترکیب حاصل ‌شده در اشریشیاکلای سویه BL21(DE3)، خاصیت ایمنی‌زایی خود را حفظ کرده و جهت تشخیص توکسوکاریازیس انسانی قابل استفاده است (تصویر4).

سپاسگزاری

مطالعه حاضر با حمایت‌های مالی مرکز تحقیقات مالتیپل اسکلروزیس، پژوهشکده علوم اعصاب، دانشگاه علوم پزشکی تهران، کد پژوهشیاری 96- 04- 188- 37018 و معاونت پژوهش و فناوری دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران انجام شد و مراحل آزمایشگاهی آن در آزمایشگاه مولکولی گروه انگل‌شناسی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران به انجام رسید. نویسندگان بدین ترتیب مراتب قدردانی خود را از حامیان، ابراز می‌دارند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.