مقدمه

موش آزمایشگاهی نژاد C57BL/6 همخون (Inbred) بوده و یکی از نژادهای منحصر بفرد است که بیش از 6 دهه در تحقیقات زیستی مورد استفاده قرار می‌گیرد (14). نسبت به سایر نژادها پرخاشگرتر، فعالیت بدنی بیشتر و طول عمر بیشتری دارد. در برابر تومورها به نسبت مقاوم می‌باشند. در تحقیقات قلبی عروقی، دیابت (نوع 2) و چاقی، ژنتیک، ایمنی‌شناسی، نورو زیست‌شناسی، تصلب شرائین (Atherosclerosis)، بیماری اتوایمیون اسکلرودرما (Scleroderma) و نیز به لحاظ وقوع بالای میکروفتالمی، تراکم کم استخوان و هیدروسفالی ارثی مورد استفاده قرار می‌گیرد. ولی متأسفانه حساس‌ترین نژاد به سندروم التهاب پوست زخم‌دار (Ulcerative dermatitis) می‌باشد. التهاب پوست زخم‌دار سندرومی وابسته به سن و با علت نامشخص در موش‌های آزمایشگاهی نژاد C57BL/6 و نیز نژادهایی که از آن به دست آمده‌اند می‌باشد که به حالت معمول و خود به خودی ایجاد می‌گردد (1،4). موریختگی بیشتر در پشت گردن، کتف‌ها، شانه‌ها، پشت بدن و کشاله ران که در ابتدا به حالت ملایم و به صورت منفرد و یا چندتایی و به شکل پوسته پوسته دیده می‌شود و سپس خارش شدید از نواحی سطحی به عمق پوست گسترش یافته و منجر به زخم می‌گردد. با بروز التهاب، تجمع سلول‌های نوتروفیل، لنفوسیت، ماکروفاژ و ماست سل (Mast cell) در ناحیه زخم ایجاد می‌گردد و در نهایت منجر به هیپرپلازی سلول‌های اپی‌تلیال، هیپرکراتوز، فیبروزه شدن بافت مبتلا و نکروز می‌شود و ترمیم به تأخیر می‌افتد. در موارد معدودی علائم لنفادنوپاتی موضعی به صورت تورم غدد لنفاوی زیر بغل (Axillary lymph nodes) و نیز بزرگ شدن کبد و طحال که ناشی از واکنش‌های ایمنی می‌باشد نیز گزارش شده است (1،7،8،9،11،15) اولین گزارش این سندروم در موش‌های نژاد C57BL/6 در سال 1971 منتشر گردید (9). گرچه علت ایجاد این سندروم نامشخص است ولی عوامل متعددی نظیر سن، جنس، عوامل محیطی (تغییرات درجه حرارت و رطوبت)، جیره غذایی و تغذیه، فصل، عفونت‌های میکروبی، وجود اجسام خارجی (مانند شماره گوش)، انگل‌های خارجی (بیشتر جرب‌ها)، زخم‌های حاصل از نزاع، تابیدن اشعه‌ها و اسکولیت ناشی از کمپلکس ایمنی (Immune Complex Vasculitis) (رسوب ایمونوگلبولین‎ها یا کمپلمان‌ها در دیواره عروق) و تحلیل فولیکل‌های مو ناشی از نقص در متابولیسم ویتامینA به عنوان عوامل مستعد‌کننده در بروز و پیشرفت آن دخیل هستند (1،7،15). مطالعات اخیر نشان داده‌اند که بروز التهاب پوست زخم‌دار ممکن است در اثر الگوهای رفتاری موش‌های C57BL/6 باشد و نه با منشأ ساختاری پوست. زیرا در موش‌های مبتلا حالاتی شبیه به اختلال کندن مو (Trichotillomania) و اختلال کندن پوست (Skin picking disorder) در انسان دیده شده است. این اختلالات روانی در 4 درصد از جمعیت انسانی وجود دارد و متأسفانه اکثر مبتلایان بدنبال درمان آن نیستند. بنابراین موش‌های C57BL/6 مبتلا به التهاب پوست زخم‌دار الگوی بسیار مناسبی جهت تحقیقات بر روی این اختلالات رفتاری در انسان می‌باشند (15). تاکنون هیچ روش درمانی به طور کامل در درمان این سندروم مؤثر نبوده ولی با توجه به عوامل مستعد کننده ذکر شده، استفاده از بعضی مواد و روش‌ها، نتایج درمانی متنوعی را به همراه داشته است (15). از جمله این روش‌ها می‌توان به استفاده از سیترات ماروپیتانت (Maropitant citrate)، ویتامین E، سیکلوسپورین (Cyclosporine) ، لوسیون کالادریل (Caladryl) ، کلر هگزیدین(Chlorhexidine) ، افزودن اسیدهای چرب امگا 3 به جیره غذایی و کوتاه کردن ناخن‌ها اشاره کرد (15). مشخص شده که افزایش مقدار سروتونین مغزی باعث افزایش خارش پوست و به دنبال آن، افزایش احتمال التهاب پوست زخم‌دار می‌شود. سیترات ماروپیتانت که یک آنتاگونیست گیرنده‌های Tachykinin neurokinin 1 می‌باشد، با این سازوکار در درمان این سندروم تأثیر دارد که باعث کاهش خارش و کاهش اندازه زخم می‌گردد (11،15). استفاده از داروی ایبوپروفن به صورت خوراکی باعث ترمیم لبه‌های زخم، کاهش التهاب و درد می‌گردد (11). از آنجا که در درمان اختلالات کندن پوست و مو در انسان، از N-Acetylcystein استفاده می‌گردد، مشخص شده که این ماده در درمان سندروم التهاب پوست زخم‌دار هم مؤثر می‌باشد. سازوکار عمل آن از طریق تولید آنتی‌اکسیدان گلوتاتیون (Glutathione) در مغز می‌باشد. استفاده هم زمان N-Acetylcystein و گلوتاتیون اثر درمانی بیشتری دارد (4). یکی از روش‌های توصیه شده جهت پیشگیری از بروز این سندروم، کوتاه کردن ناخن‌های موش‌های مبتلا به ویژه در پاهای عقبی، دست کم هر دو هفته یک بار می‌باشد (1،5،15). همچنین از آنجا که واکنش‎های استرس اکسیدکننده می‎توانند در بروز التهاب پوست زخم‎دار دخیل باشند، بنابراین استفاده از آنتی‌اکسیدان‌هایی نظیر ویتامین E، نتایج موفقیت‎آمیزی در درمان داشته است. ویتامین E باعث فعال نمودن واسطه‌های التهابی و نیز اسید آراشیدونیک (Arachidonic acid)، سیکلو اکسیژناز (Cyclooxigenase) و سیتوکین‎های پیش التهابی می‎گردد. همچنین باعث افزایش اپیتلیالیزه شدن پوست می‌شود (1،11). نقش آنزیم پروکسی ردوکسین 6 (Peroxiredoxin 6) در ترمیم زخم‌های پوستی انسان و موش مشخص گردیده است. در مطالعه‌ای که Williams و همکاران در سال 2012 انجام دادند مشخص شد که مقدار این آنزیم در موش‌های C57BL/6 مبتلا به التهاب پوست زخم‌دار به میزان قابل توجهی افزایش یافته است (15). Kastenmayer و همکاران در سال 2006 در مطالعه‌ای که بر روی موش‌های مبتلا انجام دادند دریافتند که نقص در ژن Nitric oxide synthase در ابتلا به این سندروم دخالت دارد. Nitric oxide نقش مهمی در ترمیم پوست ایفا می‎کند (9). هدف از این مطالعه بررسی وضعیت التهاب پوست زخم‌دار در کلنی موش‌های نژاد C57BL/6 یک مرکز پرورش حیوانات آزمایشگاهی و اقدام برای کاهش آن از طریق اصلاح جیره غذایی بر اساس تأمین کامل نیازهای غذایی آن نژاد بود.

مواد و روش کار

طی دوره دو ساله (1397-1396) کلنی موش‌های آزمایشگاهی نژاد C57BL/6 یک مرکز تولید و پرورش حیوانات آزمایشگاهی از نظر وجود سندروم التهاب پوست زخم‌دار تحت بررسی قرار گرفت. حیوانات از نظر ظاهری سالم و در آزمایش‌های به‌عمل ‌آمده آلودگی به انگل‎های خارجی و داخلی منفی بوده و بیماری خاصی نداشتند. در شروع بررسی در سال اول، تعداد موش‌های نر و ماده بالغ، هر کدام 50 سر بودند. حیوانات همانند سال‌های قبل از غذای فشرده (پلت) استاندارد موش‌های آزمایشگاهی غیر همخون (5/19 درصد پروتئین، 1365 کیلوکالری در پوند، انرژی، 5/4 درصد چربی، 8/3 درصد فیبر خام، 2/1 درصد کلسیم، 4/0 درصد فسفر، 8/17 واحد بین‌المللی در کیلوگرم، ویتامین E و 5/14 میلی گرم در کیلوگرم، ویتامین A) و آب به میزان دلخواه استفاده می‌کردند. در سال دوم به منظور افزایش میزان بهره‌وری تولید مثل، جیره اصلاح شده بر اساس نیاز‌های غذایی موش C57BL/6 (24 درصد پروتئین، 1500 کیلوکالری در پوند، انرژی، 5/12 درصد چربی، 3/2 درصد فیبر خام، 1 درصد کلسیم، 3/1 درصد فسفر، 32/82 واحد بین‌المللی در کیلوگرم، ویتامین E و 54 میلی‌گرم در کیلوگرم، ویتامین A) در اختیار حیوانات قرار داده شد (6). سیستم پرورش موش‌ها از نوع متعارفی (Conventional) و در قفس‌های جعبه کفشی (Shoe box) تیپ 2 از جنس پلی کربنات بوده و در هر قفس یک سر موش ماده و یک سر نر نگه‌داری می‌شدند. بعد از زایمان و پس از دوره شیرواری 21 روزه، نوزادان جدا و پس از تعیین جنسیت به قفس‌های دیگر منتقل می‌شدند. از تراشه (پوشال) استریل چوب درخت سپیدار به عنوان بستر استفاده می‌گردید. تعویض قفس و پوشال دو مرتبه در هفته صورت می‌گرفت. دمای سالن پرورشی 24-22 درجه سانتی‌گراد، میزان رطوبت 55-45 درصد، میزان تهویه هوا 10-8 مرتبه سه دقیقه‌ای در ساعت و دوره روشنایی/ تاریکی به صورت 12:12 ساعت در شبانه‌روز و میزان شدت نور کمتر از 325 لوکس بود. در این مطالعه دو ساله، با مشاهده علائم سندروم التهاب پوست زخم‌دار، نمونه‌برداری از آن‌ها صورت می‌گرفت. هنگامی‌که در بیش از 10 درصد سطح بدن موش‌های مبتلا، موریختگی و زخم مشاهده می‌شد، جداسازی حیوانات، معدوم سازی و نمونه برداری از آن‌ها صورت گرفت. همچنین روند پیشرفت بیماری در حیوانات مبتلا، تحت نظر قرار گرفت. جهت نمونه‌برداری، ابتدا بر طبق اصول اخلاق کار با حیوانات آزمایشگاهی، مرگ آسان موش‌ها (با ترکیب کتامین به میزان 225 میلی گرم به ازاء هر کیلوگرم و زایلازین به میزان 30 میلی گرم به ازاء هر کیلوگرم و تزریق داخل صفاقی) صورت گرفت. نمونه‌برداری از محل‌های ضایعه دیده، جهت بررسی وجود انگل‌های خارجی (جرب‌ها) انجام شد. سپس در زیر هود لامینار فلو، به منظور کشت باکتریایی، نمونه‌هایی از نواحی مبتلا (پوست و لبه‌های آن) و در محیط‌های بلاد آگار، مک کانکی آگار (MacConkey agar)، دکستروز آگار سابورو (Sabouraud dextrose agar) و کشت‌های بی‌هوازی در بلادآگار و از کلنی‌های رشد یافته، لام تهیه و با رنگ گرم، رنگ‌آمیزی و به روش‌های استاندارد تشخیص داده شدند. پس از کالبدگشایی، جهت بررسی، بافت‌های غدد لنفاوی زیر بغل، کبد و طحال از هر موش جمع‌آوری و به منظور انجام آزمایشات هیستوپاتولوژی، در محلول بافر فرمالین خنثی10 درصد قرار داده شدند. بافت‌ها به صورت معمول فرآوری شده و در پارافین قرار گرفتند. بلوک‌های پارافینه در مقاطع 6-5 میکرومتر، برش داده شده و سپس با رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) جهت بررسی با میکروسکوپ نوری رنگ شدند. در این مطالعه، مقایسه بین دو گروه، در دو محدوده زمانی عنوان شده، به صورت کیفی و بر اساس مشاهدات میکروسکوپیک صورت گرفته بود. جهت معدوم نمودن لاشه موش‌های استفاده شده از دستگاه امحاء زباله‌های عفونی (بی خطر ساز) استفاده گردید. جهت آنالیز آماری اطلاعات به دست آمده غیر از نتایج هیستوپاتولوژی، با استفاده از آزمون مربع کای بررسی و سطح معنی‌داری کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.

نتایج

در سال اول که کلنی موش‌های همخون نژاد C57BL/6 طبق روال همیشگی آن مرکز از جیره غذایی موش‌های غیر همخون استفاده می‌کردند، تعداد نوزادان متولد شده در هر زایمان به طور میانگین 3 سر بود ولی 75 درصد از آن‌ها در سن 21-1 روزگی تلف می‌شدند. تعداد کل موش‌ها اعم از نوزادان و بالغین (پس از 4-3 مرتبه زایمان) در سال اول 220 سر بود. از نظر مشاهده علائم سندروم التهاب پوست زخم‌دار، در سال اول40 درصد موش‌های بالغ به این سندروم مبتلا شدند. 80 درصد مبتلایان از جنس ماده و 20 درصد، نر بودند و سن ابتلا از 8 هفتگی به بالا بود. در موش‌های مبتلا، موریختگی‌ها به طور عمده در نواحی پشت گردن و پشت بدن بود و حدت علائم از ملایم تا شدید مشاهده گردید (تصویر 1). تلفاتی در موش‌های مبتلا، حتی در موارد شدید مشاهده نشد و بهبودی آن‌ها خود به خودی ولی کند (4-3 ماه) بود. نتایج نمونه‌برداری از ضایعات پوستی از لحاظ وجود انگل‌های خارجی، منفی و در کشت باکتریایی و قارچی در محیط‌های بلاد آگار، مک کانکی آگار، دکستروز آگار سابورو، همگی منفی و تنها در یک نمونه از کشت‌های بی‌هوازی در بلادآگار، باکتری Clostridium sordellii جداسازی و تشخیص داده شد. در کالبدگشایی، علائم بزرگی غدد لنفاوی زیر بغل و نیز بزرگی طحال و کبد مشاهده گردید (تصویر 2). در آزمایشات هیستوپاتولوژی نمونه‌های برداشت شده از نواحی زخم‌های پوستی، کنده شدن لایه پوست و حضور سلول‌های التهابی مشاهده گردید (تصویر 3). در نمونه‌های غده لنفاوی، کاهش جمعیت لنفوسیت‌ها (خط عمود) و تخلیه بافت لنفاوی (پیکان مشکی) به همراه اتساع سینوزوئیدها مشاهده شد (تصویر 4). در طحال، پر خونی در سینوزوئیدها مشاهده گردید (تصویر 5). در کبد، شروع تخلیه بافت لنفاوی به همراه کانون‌های متعدد و پراکنده خون‌ریزی در پارانشیم بافت و نیز نواحی نکروزه مشاهده شد (تصویر 6). در سال دوم و با اصلاح جیره غذایی که بر اساس تأمین کامل نیازهای غذایی موش‌های همخون نژاد C57BL/6 صورت گرفت تعداد نوزادان در هر زایمان به طور میانگین به 6 سر افزایش پیدا کرد. میزان تلفات نوزادان متولد شده تا سن 21-1 روزگی به صفر درصد کاهش یافت. تعداد کل موش‌های باقیمانده اعم از نوزادان و بالغین پس از 3-4 مرتبه زایمان به 1100 سر افزایش یافت. از نظر مشاهده علائم سندروم، در سال دوم تعداد مبتلایان کاهش چشمگیری داشته و به 2 درصد رسید. از نظر کیفی، شدت ضایعات مشاهده شده جلدی (شامل موریختگی و زخم پوست)، به میزان قابل توجهی خفیف‌تر بود. تلفاتی در موش‌های مبتلا، مشاهده نشد و بهبودی آن‌ها خود به خودی و سریع‌تر نسبت به سال اول (2-1 ماه) بود. نتایج نمونه‌برداری از ضایعات پوستی از لحاظ وجود انگل‌های خارجی و کشت‌های باکتریایی و قارچی همگی منفی بودند. در کالبد‌گشایی، علائم در مشاهدات ظاهری، بزرگ شدن غدد لنفاوی، طحال و کبد خفیف‌تر از سال اول بود. همچنین تغییرات هیستوپاتولوژیک مشاهده شده در نمونه‌های بافتی برداشت شده، خفیف‎تر از سال قبل بود.

بحث

میزان ابتلا به سندروم التهاب پوست زخم‌دار در کلنی موش آزمایشگاهی نژاد C57BL/6 در گزارش­های مختلف از 35- 1/4 درصد متفاوت بوده است (7،8،9). در این مطالعه میزان ابتلا 40 درصد برآورد گردید. از نظر سنی، این سندروم بیشتر در سنین بالا دیده می‌شود. مطالعات مختلفی از بروز این حالت در محدوه سنی نزدیک به بلوغ و 3-2 ماهگی، 10-16 ماهگی، 13 ماهگی، 19 ماهگی، 24-13 ماهگی منتشر گردیده است (7،9،12،13). از نظر جنس، موش‌های ماده به مراتب حساس‌تر از نرها به این سندروم می‌باشند و ابتلا به بیماری در موش‌های ماده به مراتب بیشتر از نرها می‌باشد و به طور معمول در سنین بالا مشاهده می‌گردد، گرچه در موش‌های جوان نیز دیده شده است (9،11). نتایج این بررسی با سایر مطالعات مطابقت دارد. در انسان هم اختلالات روانی کندن پوست و مو بیشتر در زنان و در سنین بلوغ مشاهده می‌گردد (5). همچنین مشخص شده که جیره‌های غذایی پر چرب و چاق کننده (35 درصد چربی و کربوهیدرات بالا) و نیز کمبود مواد معدنی و متعادل نبودن آن‌ها، در میزان شیوع و حدت این سندروم مؤثر می‌باشند. هر چه چربی و کمبود مواد معدنی جیره بیشتر باشد میزان شیوع بالاتر خواهد بود (2،12). همچنین کمبود ویتامینE و نقص در متابولیسم ویتامینA به عنوان عواملی مستعدکننده در پیشرفت علائم این سندروم مطرح می‌باشند (2). Michaud و همکاران در سال 2016 در بررسی روند سندروم التهاب پوست زخم‌دار به این نتایج دست یافتند که افزایش میزان چربی جیره به 35 درصد، ابتلا به آن را افزایش و کاهش میزان کالری جیره به 60 درصد مقدار استاندارد، ابتلا به آن را کاهش می‌دهد (11). Hampton و همکاران در سال 2015 که در زمینه درمان موش‌های مبتلا به این سندروم تحقیق می‌کردند ابراز داشتند که میزان شیوع، علائم بالینی و تغییرات بافت‌شناسی در زخم‌های موش‌های مبتلا، در اثر استفاده از جیره‌های غذایی پرچرب، افزایش و اضافه نمودن مکمل‌های معدنی تهیه شده از جلبک دریایی قرمز که سرشار از کلسیم و سایر مواد معدنی است، از میزان آن‌ها می‌کاهد. سازوکار اثر آن نامشخص بوده ولی ممکن است به علت اثر آنتی‌اکسیدانی یا ضد التهابی آن باشد. این مکمل‌های معدنی در درمان استئوآرتریت و تقویت استخوانی و سلامت دستگاه گوارش مصرف می‌گردند (8). کلسیم یکی از مواد معدنی کاتیونی و مهم می‌باشد که نقش مؤثری در رشد سلول‌های اپی‌تلیال و نیز بهبود عملکرد سیستم‌های حفاظتی پوست و کاهش اثرات آماسی بر روی سلول‌ها دارد. نقش سایر مواد معدنی نظیر مس، روی، سلنیم، منگنز و به ویژه مولیبدن که اثر آنتی‌اکسیدانی نیز دارد، در درمان این سندروم مشخص گردیده است (8). مشخص شده است که عفونت‌های باکتریایی فرصت‌طلب نظیر Staphylococcus aureus و Staphylococcus xylosus در پیشرفت زخم‌های پوستی سندروم التهاب پوست زخم‌دار تأثیرگذار هستند. حتی کلستریدیوم‌های موجود در محیط و سطح پوست، توانایی رشد در نواحی عمیق زخم را خواهند داشت (3). گرچه درمان با داروهای مؤثر برای این باکتری‌ها، نظیر تریمتوپریم/ سولفامتوکسازول، نتیجه مؤثری در درمان این سندروم نداشته است (9،10). در خصوص فصل شیوع، در تعدادی از مطالعات، تابستان بیشترین فصل شیوع معرفی شده است. گرچه گزارشاتی از بیشترین میزان شیوع در بهار و پاییز هم وجود دارد. تأثیر شیوع فصلی شاید ناشی از عوامل حساسیت‌زای محیطی مانند گرده گیاهان و یا اسپور قارچ‌ها باشد که به همراه لباس کارکنان، جیره غذایی و یا بستر، وارد سالن‌های پرورش حیوانات آزمایشگاهی می‌شوند (9). در مطالعه‌ای که Adams و همکاران در سال 2016 در خصوص درمان این سندروم انجام دادند، استفاده از داروی ترسادرم (Tresaderm) که ترکیبی از ماده ضد قارچ، کورتیکواستروئید و آنتی بیوتیک وسیع‌الطیف است به میزان 4/25 درصد ولی همراه با کوتاه کردن ناخن‌ها، باعث 90 درصد موفقیت در درمان شده است (1). Michaud و همکاران در سال 2016 در بررسی روش‌های درمان با داروهای ترکیبی، میزان موفقیت آمیز بودن استفاده از سه دارو شامل باسیتراسین، نئومایسین و پلی میکسین B را 34 درصد، استفاده توأم بتادین و سولفادیازین را 34 درصد و نیز درمان با هیپوکلریت را 71 درصد ارائه نمودند (11). در این مطالعه با اصلاح جیره غذایی در سال دوم که تأمین کننده نیازهای غذایی این نژاد موش می‌باشد و نیز استفاده از منبع چربی انتخاب شده که سرشار از ویتامین‌هایE و A است موجب افزایش مقادیر آن‌ها به میزان 5-4 برابر جیره‌های معمولی گردید و باعث شد افزایش قابل توجه در میزان بهره‌وری تولید مثل صورت گیرد. همچنین بروز این سندروم از میزان 40 درصد به 2 درصد کاهش پیدا کرد و نیز شدت و علائم بیماری کمتر و در مدت کوتاه‌تری درمان کامل حاصل شد. بنابراین با تأمین کامل نیازهای غذایی موش آزمایشگاهی نژاد C57BL/6 می‌توان به میزان قابل توجهی از بروز سندروم التهاب پوست زخم‌دار جلوگیری کرد.

سپاسگزاری

نویسندگان این مقاله از همکاران بخش تولید و پرورش حیوانات آزمایشگاهی موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی کمال تشکر و قدردانی را دارند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.