یرسینیوزیس یکی از بیماری­های شایع باکتریایی در مزارع پرورش ماهیان محسوب می­شود که همه ساله خسارات فراوانی به این صنعت وارد می­سازد، عامل این بیماری باکتری یرسینیا راکری (Yersinia ruckeri) است و اولین بار از مزارع قزل آلای رنگین کمان در آمریکا گزارش گردید (18). در حال حاضر این بیماری از نقاط مختلف دنیا در گونه­های مختلف ماهیان گزارش شده و همه ساله خسارات فراوانی به صنعت پرورش آبزیان وارد می­سازد (28). در برخی گزارشات میزان تلفات ناشی از این بیماری بیش از 70 درصد نیز ثبت گردیده است (8). معمولاً در شرایط استرس­زا و شرایط نامناسب فیزیکوشیمیایی آب پرورش، شیوع بیماری افزایش می­یابد (24). در عین حال حساسیت ماهیان مختلف نسبت به باکتری یرسینیا راکری متفاوت است، براساس گزارشات اگر چه بیماری در گونه­های مختلف اتفاق می‌افتد، آزاد ماهیان از بیشترین حساسیت در میان ماهیان پرورشی برخوردارند (9). 

یرسینیوزیس در ایران تنها از مزارع قزل­آلای رنگین­کمان گزارش شده است و تا کنون گزارش رسمی در رابطه با شیوع بیماری در مزارع ماهیان گرمابی کشور و بخصوص کپور ماهیان به­طور رسمی در دست نیست، اما گزارشات فراوانی در رابطه با شیوع این بیماری در مزارع ماهیان سردابی کشور وجود دارد، به گونه­ای که همه ساله خسارات فراوانی به این صنعت در کشور وارد می­سازد (7،19،20). علایم کلینیکی متعددی برای این بیماری در ماهیان گزارش شده است که از آن جمله می­توان به سپتی­سمی و خونریزی در فک و اطراف دهان (به همین دلیل نام دیگر بیماری، بیماری دهان قرمز است)، خونریزی در چشم­ها و اگزوفتالمی، پرخونی و خونریزی در محوطه شکمی و دستگاه گوارش بخصوص در قسمت انتهایی روده­ها اشاره نمود که ممکن است تمامی علایم یاد شده در ماهیان یک مزرعه مشاهده نشود (11،18). 

ماهی کلمه خزری (Rutilus caspicus) از جمله ماهیان با ارزش دریای خزر و حوزه آبریز آن محسوب می­شود. این ماهی در بین مصرف­کنندگان شمال کشور از استقبال بالایی برخوردار است، در عین حال به عنوان یکی از مهمترین منابع غذایی ماهیان خاویاری و بخصوص فیل­ماهی نیز محسوب می­شود. متأسفانه در سال‌های اخیر شاهد کاهش چشمگیر جمعیت این ماهی در دریای خزر بوده­ایم و در راستای بازسازی ذخایر این ماهیان با ارزش، سازمان شیلات ایران همه ساله اقدام به تکثیر مصنوعی و رها سازی بچه ماهیان در سایز انگشت قد به دریا می­نماید اما آمار صید این گونه از دریا بیانگر این موضوع است که این اقدامات اگرچه بسیار مفید بوده است اما نتوانسته جمعیت آسیب دیده این گونه را در دریا بازسازی کند (21). برای عملیات بازسازی نیاز به تأمین ماهی مولد است و این مولدین می­تواند به­صورت مولدین صید شده از دریا و یا به صورت پرورش بچه ماهیان و رسیدن به مرحله مولدی، تأمین گردد که در هر دو صورت نیاز به نگهداری آن‌ها در استخرهای پرورشی می­باشد. با توجه به گسترش یرسینیوزیس در مزارع سردابی کشور احتمال آلودگی مزارع پایین دست نیز وجود دارد. لذا در صورت آلودگی به یرسینیا راکری در منطقه آلودگی این ماهیان در مزارع پایین دست نیز دور از ذهن نیست و با توجه به عدم وجود گزارشی در رابطه با حساسیت ماهیان مولد کلمه خزری نسبت به یرسینیا راکری، در مطالعه حاضر  بافت روده و شاخص­های خونی ماهیان مذکور در مواجهه با این بیماری مورد بررسی قرار گرفته است. 

مواد و روش کار

تهیه و آماده سازی ماهیان: به منظور انجام آزمایش تعداد 60 عدد ماهی کلمه خزری با میانگین وزنی 1/2  ± 4/63 (گرم) که به منظور مولد سازی پرورش داده شده بودند، با پلاستیک حمل بچه ماهیان به محل انجام آزمایش منتقل گردید. ماهیان مذکور در دو  تانکر 400 لیتری تقسیم شده و به مدت یک هفته به منظور سازگاری با شرایط مورد پرورش قرار گرفتند. در طی این دوره ماهیان روزانه به میزان 3 درصد وزن بدن و دوبار در روز با غذای تجاری (انرژی – ایران) تغذیه شدند. در طی این دوره دمای آب 2 ± 24 درجه سانتی‌گراد،  سختی آب برابر با 2 ± 196 (میلی گرم/لیتر) ثبت گردید.

نحوه آماده سازی باکتریایی: باکتری یرسینیا راکری (Yersinia ruckeri) مورد استفاده در این مطالعه از سازمان پژوهش­های علمی و صنعتی ایران با کد PTCC 1888 بصورت فریز شده تهیه گردید. در این راستا گونه دقیق باکتری قبلاً با کمک تست PCR مورد تأیید قرار گرفته بود (13). این باکتری ابتدا به مدت 48 ساعت در محیط کشت تریپتیک سوی براث (Tryptic Soya Broth) غنی­سازی گردیده و سپس به صورت کشت سطحی در محیط نوترینت آگار (Nutrient agar) تلقیح گردید. 48 ساعت پس از گرم­خانه گذاری، باکتری‌ها از سطح محیط کشت برداشت شده و در سرم فیزیولوژی (NaCl 9/0 درصد) به صورت سوسپانسیون باکتریایی آماده گردید. کدورت سوسپانسیون مذکور با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 620 نانومتر و OD بر اساس نیم استاندارد مک فارلند تنظیم گردید. بار باکترهای زنده این سوسپانسیون روش کشت سطحی و بر مبنای تشکیل کلونی (CFU) به روش استاندارد محاسبه گردید به این منظور پس از تهیه رقت­های سریالی و کشت آن‌ها در محیط نوترینت آگار، بار باکتری­های زنده سوسپانسیون  10⁸ × 8 /3  سلول زنده به ازای هر سی­سی محاسبه گردید.

مواجهه باکتریایی ماهیان: در راستای انجام آزمایش یک گروه شاهد منفی، یک گروه شاهد مثبت و یک گروه تیمار (با 2 تکرار برای هر گروه) در نظر گرفته شد. به این منظور مولدین کلمه خزری در 6 آکواریوم شیشه­ای با ابعاد 30 × 50 × 40 سانتی­متر تقسیم شدند (15 ماهی در هر آکواریوم). یک هفته پس از سازگاری ماهیان مواجهه باکتریایی انجام شد. در این مطالعه ماهیان گروه تیمار با 1/0 سی­سی از سوسپانسیون باکتریایی (معادل 10⁷ × 8 /3 باکتری زنده) به روش تزریق داخل صفاقی مورد مواجهه قرار گرفتند(14). ماهیان گروه شاهد مثبت نیز با 1/0 سی­سی سرم فیزیولوژی استریل به روش داخل صفاقی تزریق شدند. هیچ تزریقی در ماهیان گروه شاهد منفی صورت نگرفت. پس از تزریق ماهیان به مدت 2 هفته همه روزه پایش شده و تلفات روزانه در صورت وقوع ثبت گردید.

بررسی آسیب شناسی بافت روده: نمونه برداری بافتی در گروه تیمار از ماهیان در حال مرگ و یا تازه تلف شده صورت گرفت. همزمان از ماهیان گروه شاهد نیز نمونه برداری انجام شد. به این منظور پس از باز شدن شکم ماهی نمونه­برداری از قسمت­های میانی و انتهایی روده هر کدام از نمونه‌ها انجام گرفت. نمونه­های بافتی بلافاصله به فرمالین 10 درصد منتقل شد و پس از 24 ساعت فیکساتیو نمونه­ها تعویض گردید. نمونه‌های بافتی در دستگاه پروسسور بافتی آماده‌سازی شد، و پس از آبگیری در الکل اتانول پارافینه شده، مقاطع 5 میکرونی از بافت‌ها تهیه گردید. رنگ­آمیزی مقاطع بافتی به روش هماتوکسیلین و ائوزین صورت پذیرفت (15) و نمونه ها با چسب انتالن لامل گذاری شده و به کمک میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 100 تا 400 برابر  مورد بررسی قرار گرفتند.

بررسی‌ شاخص‌های خونی: جهت بررسی  شاخص­های خونی در روز 12 پس از مواجهه از ماهیان سالم و بدون علایم بیماری خون‌گیری انجام شده و از هر گروه مورد آزمایش 7 نمونه خون تهیه گردید. ابتدا ماهیان توسط 100 (میلی گرم در لیتر) یوجینول (Sigma_ Aldrich co, Germany) بیهوش شدند و سپس خون­گیری از ساقه دمی ماهیان توسط سرنگ آغشته شده به هپارین با سرسوزن گیج 25 صورت گرفت. شمارش تعداد گلبول‌های قرمز (RBC) و گلبول‌های سفید (WBC) توسط لام نئوبار بر اساس روش استاندارد روتین شمارش سلولی انجام شد (5). هماتوکریت به روش استاندارد میکروهماتوکریت انجام شده و به صورت درصد بیان گردید. مقادیر هموگلوبین در این آزمایش توسط روش سیانومت هموگلوبین و با کیت تجاری پارس آزمون اندازه‌گیری شد (1). اندیس‌های خونی حجم متوسط گلبولی (MCV)، وزن هموگلوبین داخل گلبولی (MCH) و غلظت هموگلوبین داخل گلبولی (MCHC) بر اساس روش Dacie  و   Lewis (2001) محاسبه گردید (5). پس از تهیه گسترش خونی نمونه­ها و رنگ آمیزی با گیمسا تعیین درصد انواع گلبول­های سفید نیز بر اساس ساختار و شکل سلولی صورت پذیرفت (17).

بررسی‌های آماری: بررسی آماری نتایج تحقیق حاضر توسط نرم­افزارهای SPSS18 وExcell 2010  انجام شد. نمودار روند تلفات مولدین کلمه خزری نیز توسط نرم افزارهای SPSS18 رسم گردید. نتایج به­صورت میانگین ± انحراف استاندارد بیان گردید. برای مقایسه  نتایج بین گروه­های مختلف از one way ANOVA و آزمون آماری دانکن (Duncan) استفاده شد.

نتایج

وضعیت تلفات حاصل از مواجهه تجربی ماهیان مولد کلمه خزری با باکتری یرسینیا راکری در نمودار 1 قابل مشاهده است. بر اساس این نتایج تا 4 روز اول پس از مواجهه علایم بیماری و تلفات مشاهده نشد. در روز پنجم پس از مواجهه 20 درصد ماهیان مواجهه شده با 10⁷ × 8 /3 باکتری تلف شدند، روند تلفات تا روز 9 پس از مواجهه به 53 درصد رسید و پس از آن تا روز چهاردهم پس از مواجهه تلفاتی مشاهده نگردید (نمودار 1). عمده علایم ماهیان بیمار شامل پرخونی و خونریزی در قاعده باله­ها و همچنین پرخونی و خونریزی دستگاه گوارش و بخصوص در قسمت انتهایی روده­ها ثبت گردید. در این مطالعه هیچ تلفاتی در ماهیان گروه­های شاهد مشاهده نگردید.

در بررسی بافت شناسی روده­ها، آسیب­های وارده به بافت روده انتهایی در مقایسه با روده میانی در ماهیان گروه تیمار بسیار گسترده­تر و شدیدتر بوده است، عمده­ترین شاخص آسیبی در این بافت شامل نکروز و جداشدگی سلول­های استوانه­ای اپیتلوم پوششی روده­ها و نفوذ سلول‌های آماسی در بافت زیر مخاط روده بود (تصویر 1). علایم یاد شده در قسمت­های میانی روده­ها به صورت خفیف تا ملایم ثبت گردید (تصویر 1، ب و پ). اما در قسمت انتهایی روده گستردگی نکروز اپیتلوم پوششی پرزهای روده به حدی شدید بود که می توان گفت پرز­های روده در این قسمت تمامی اپیتلیوم پوششی خود را از دست داده­اند (تصویر 1، ث و ج). هیچ آسیب بافتی در ماهیان گروه شاهد مشاهده نشد (تصویر1، الف و ت).

نتایج حاصل از بررسی­های خون­شناسی گروه­های شاهد و ماهیان گروه تیمار 12 روز پس از مواجهه با یرسینیا راکری در جدول 1 آورده شده است. بر اساس این نتایج مواجهه با یرسینیا باعث کاهش معنی­دار تعداد گبلول­های قرمز (RBC) و مقادیر هموگلوبین در ماهیان گروه تیمار گردید. در عین حال تعداد گلبول­های سفید (WBC) در ماهیان گروه تیمار افزایش معنی­دار داشت. در بررسی شاخص­های خونی نیز مقادیر MCV در ماهیان گروه تیمار بالاتر و MCHC پایین­تر محاسبه گردید (جدول 1).

بحث

همانگونه که در جدول 1 نشان داده شد، مواجهه با 10⁷×8/3 باکتری منجر به تلف شدن 53 درصد از ماهیان مولد کلمه خزری گردید، که این موضوع نشان دهنده حساسیت متوسط این ماهی نسبت به باکتری یرسینیا راکری است. این حساسیت در ماهیان مختلف متفاوت گزارش شده است. به عنوان مثال در یک بررسی تزریق داخل صفاقی 10⁶ × 8/2 باکتری منجر به تلفات حدود 70 درصدی در بچه ماهیان تاسماهی ایرانی (Acipenser persicus) گردید (14). همچنین با تزریق 10⁵ × 5  باکتری در ماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio) 86 درصد ماهیان تلف شدند (2)، در مطالعه  Haig و همکاران در سال 2011 با تزریق داخل صفاقی 10⁷ × 4/2 باکتری  به آزاد ماهی آتلانتیک (Salmo salar L) و قزل­آلای رنگین کمان تلفات 60 تا 75 درصد ثبت گردید (10).  

بررسی­های خون­شناسی قادر است یک تابلو پاراکلینیکی قابل استناد از سلامت ماهیان ارائه کند. در مطالعه حاضر همان‍گونه که در جدول 1 آورده شده است در ماهیانی که با باکتری مواجه شدند تعداد گلبول­های قرمز کاهش یافته است که با توجه به افزایش اندیس­های خونی MCV و کاهش MCHC می­توان گفت این مواجهه منجر به کم خونی نوع ماکروسیتیک هیپوکرومیک در ماهیان مولد کلمه خزری شده است (4). در حقیقت با عدم تغییر MCH در بین تمامی گروه­های مورد مطالعه در کنار تغییرات اندیس­های یاد شده بیانگر این موضوع است که اگرچه هموگلوبین سلولی کاهش نیافته اما با توجه با کاهش MCHC درصد هموگلوبین خون کاهش معنی­دار داشته است. در بررسی مشابهی در تاسماهی ایرانی مواجهه با یرسینیا راکری منجر به کم­خونی شدید ماهیان گردید (14). افزایش تعداد گلبول­های سفید (WBC) را نیز می‌توان به درگیری سیستم ایمنی با باکتری پاتوژن ربط داد. در بررسی­های متعدد افزایش تعداد گلبول­های سفید در درگیری با پاتوژن­های باکتریایی در ماهیان به اثبات رسیده است (22). 

وجود آسیب­های بافتی روده­ها نیز در بررسی حاضر بیانگر حساسیت ماهیان مولد کلمه خزری به یرسینیوزیس می­باشد، علایم یاد شده شبیه برخی گزارشات در ماهی قزل­آلای رنگین کمان (25،26،27)، تاسماهی ایرانی (14) می‌باشد. در این بررسی همان­گونه که در تصویر 1 قابل مشاهده است عوارض بافتی در قسمت انتهایی روده در مقایسه با قسمت­های میانی از شدت بالاتری برخودار بوده است که این موضوع شاید به دلیل تجمع و کلونیزه شدن باکتری در قسمت انتهایی روده­ها باشد. شاید بتوان نفوذ و حضور بالای سلول­های آماسی در قسمت­های انتهایی روده ماهیان تیمار را با این موضوع مرتبط دانست. در بررسی­های متعدد خونریزی در فک­ها و دهان و همچنین خونریزی در قسمت انتهایی روده و بیرون زدگی مخرج ماهی از علایم تیپیک این بیماری در آزد ماهیان می­باشد (11،18). در مطالعه حاضرعلایم یاد شده در آزاد ماهیان در ماهیان کلمه خزری به این کیفیت مشاهده نگردید، به عنوان مثال در هیچ موردی خونریزی و بیرون زدگی مخرج و یا خونریزی در دهان و فکین ثبت نشد.

همان­گونه که در مقدمه اشاره گردید متأسفانه جمعیت ماهیان کلمه خزری در طی سال‌های اخیر به شدت روند کاهشی داشته است به گونه­ای که در برخی مقاطع حتی تهیه مولدین از دریا نیز مشکل بوده است (21)، به همین دلیل در کنار تکثیر مصنوعی و پرورش بچه­ماهیانی که همه ساله به منظور رهاسازی و ترمیم جمعیت این ماهیان توسط سازمان شیلات ایران صورت می­گیرد، ناگزیر به مولد سازی و نگهداری مولدین نیز خواهیم بود. که در این راستا آگاهی از خطرات احتمالی که این روند را  تهدید می­کند ضروری و کاربردی است. ماهی کلمه خزری یک ماهی گرمابی است و با توجه به شرایط اقیمی کشور محل قرار گرفتن استخرهای این ماهی در پایین دست رودخانه­ها است به عبارت دیگر آلودگی در قسمت­های بالا دست (که معمولاً مزارع سردابی در آن واقع است) قادر به آلودگی این مزارع نیز می­باشد. با توجه به شیوع همه ساله یرسینیا در مزارع سردابی کشور(7،19،20)، مواجهه کلمه خزری با باکتری یرسینیا راکری در پایین دست این مزارع نیز دور از ذهن نیست. از طرفی هنگام شیوع یرسینیوزیس در یک منطقه، آلودگی برای مدت طولانی باقی خواهد ماند. بر اساس برخی گزارشات  این باکتری قادر است به مدت 4  ماه در استخرهای پرورش زنده بماند (23). در عین حال در صورت بروز بیماری، باکتری در دستگاه گوارش ماهی کلونیزه شده و تا چند ماه پس از بهبودی این ماهیان باکتری را از طریق مدفوع در محیط دفع می‌کنند (3،16).  این باکتری حتی از ماهیان سالم و بدون سابقه بیماری نیز در مناطق با سابقه آلودگی جداسازی شده است (6).  برخی محققین بر این باورند که این باکتری قادر است در اندام داخلی ماهیان حساس کلونیزه شده و تا مدت­ها باقی بماند و در شرایط ناساعد محیطی و یا بروز استرس و ضعف سیستم عمومی بدن بیماری به طور ناگهانی بروز پیدا کند (12).

لذا بر اساس مطالعه حاضر، با توجه به حساسیت ماهیان مولد کلمه خزری و همچنین آلودگی منطقه به یرسینیا راکری در پرورش و نگهداری مولدین کلمه خزری ملاحظات بهداشتی و قرنطینه­ای برای این باکتری باید در نظر گرفته شود.

سپاسگزاری

در پایان از مدیریت و پرسنل صمیمی و زحمت­کش "مرکز تکثیر و پرورش ماهیان استخوانی سیجوال _ گلستان" که در انجام مطالعه حاضر ما را همراهی نمودند صمیمانه سپاسگزاری می­شود.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.