آنفلوانزای پرندگان یکی از مهم‌ترین بیماری‌های مشترک بین انسان و دام می‌باشد و از نظر اقتصادی، سیاسی، اجتماعی و بهداشت عمومی دارای اهمیت می‌باشد. این بیماری توسط ویروس­های تیپ A آنفلوانزا متعلق به خانواده اورتومیکسوویریده ایجاد می­شود. ویروس‌های آنفلوانزا دارای ژنوم RNA تک رشته‌ای، چند قسمتی و با قطبیت منفی می‌باشند که در خانواده اورتومیکسوویریده قرار می­گیرند (4). این خانواده دارای هفت جنس شامل: آنفلوانزای تیپ A، B، C و D، کارانجاویروس، توگوتوویروس و آیزاویروس می‌باشد (11). ویروس‌های آنفلوانزای تیپ A که در پرندگان بیماری آنفلوانزا را ایجاد می­کنند، از دو نوع برجستگی گلیکوپروتئینی عمده شامل تریمرهای هماگلوتینین (HA) میله‌ای شکل و تترامرهای نورآمینیداز (NA) قارچی شکل تشکیل شده‌اند. ویروس‌های آنفلوانزای تیپ A براساس واکنش‌های سرمی مربوط به گلیکوپروتئین‌های سطحی هماگلوتینین (HA) و نورآمینیداز (NA) به تحت ‌تیپ‌های HA و NA تقسیم می‌شوند. تاکنون 18 تحت تیپ هماگلوتینین (H1-H18) و 11 تحت ‌تیپ نورآمینیداز (N1-N11) شناسایی شده است. به استثنای H17N10 و H18N11 که اخیراً از خفاش جدا شده است، سایر تحت‌ تیپ‌ها در پرندگان در حال گردش می‌باشد (4). پروتئین HA گلیکوپروتئین فیوژن غشایی و اتصال به گیرنده می‌باشد و القاکننده آنتی‌بادی نوترالیزان در عفونت ویروسی است. پروتئین NA علاوه بر القای آنتی‌بادی نوترالیزان، در رها شدن ویروس نتاج از سلول در مراحل انتهایی تکثیر نقش مهمی را ایفا می‌کند. هر دو پروتئین HA و NA نقش حیاتی در پاتوژنیسیته، آنتی‌ژنیسیته ویروس و طیف میزبانی ویروس‌های آنفلوانزای پرندگان را بازی می‌کنند. بدلیل مکانیسم ناکامل تصحیح‌کنندگی RNA پلی‌مراز در ویروس آنفلوانزا، ایجاد تنوعی از ژن‌های HA و NA غالباً ممکن است اتفاق بیفتد و منجر به ظهور سویه‌های واریانت جدید گردد (4).

سازمان بهداشت جهانی دام (OIE)، ویروس­های آنفلوانزای پرندگان را بر‌اساس بیماریزایی در طیور به دو پاتوتیپ تقسیم می‌کند. ویروس­های با بیماریزایی پایین (LPAI) و ویروس‌های با بیماریزایی بالا (HPAI) که تحت عنوان آنفلوانزای فوق حاد بیان می­شود. تا به امروز کلیه ویروس­های با بیماریزایی بالا متعلق به دو تحت تیپ H5 و H7 می‌باشد، اما تمام تحت تیپ‌های H5 و H7 فوق حاد نیستند و برخی از آن‌ها بیماریزایی پایینی دارند. تمام تحت تیپ­های H5 و H7 تحت عنوان آنفلوانزای اخطارکردنی بیان می­شوند (14).

ویروس آنفلوانزای پرندگان تحت تیپ H9N2 شایع­ترین ویروس آنفلوانزا با بیماریزایی کم در بین طیور در سراسر دنیا می‌باشد. پرندگان آبزی وحشی میزبان طبیعی ویروس­های آنفلوانزا هستند، اما ویروس­های H9N2 نسبتاً غیرمعمول در این پرندگان می‌باشد (9). ویروس­های آنفلوانزای H9N2 که با طیور سازگار شده­اند، به عنوان یک نگرانی بزرگ در 20 سال گذشته در صنعت طیور بوده است. اما در عین حال به دلیل اینکه برخی از دودمان‌های این ویروس قابلیت انتقال به انسان را دارند، به عنوان یک نگرانی بهداشت عمومی نیز تلقی می‌شود (1،10).

اولین بار این ویروس از بوقلمون در دهه 1960 در آمریکا جدا شد و تا دهه 1990 گزارش رخدادهای تک گیر بیماری در دنیا وجود دارد (7). در اواسط دهه 1990 بیماری از جوجه­هایی در گاندونگ چین و سپس در سراسر چین گزارش شد (19). در اواخر دهه 1990 بیماری از تعدادی دیگر از کشورهای آسیایی، خاورمیانه و شمال آفریقا گزارش شد و اکنون در بسیاری از آن کشورها بومی است (7).

در کشور ما در اواسط تیرماه سال 1377 این تحت تیپ خود را در مرغداری­های اطراف تهران و قزوین بصورت بیماری ناشناخته نشان داد و به سرعت بین مزارع تخمگذار کشور گسترش یافت و اکنون در کشور بومی شده است (13).

آنالیز فیلوژنتیک ژن NA تحت‌تیپ N2 دو دودمان عمده آمریکای شمالی و اوراسیا را نشان می‌دهد. متعاقباً دودمان اوراسیا به 4 خوشه BJ/94-like و یا Y280-like، G1-like، Y439-like و F/98-like تقسیم‌بندی می‌شوند (20).

صنعت پرورش طیور در ایران از نظر اقتصادی، اجتماعی و امنیت غذایی دارای اهمیت ویژه­ای است. با توجه به شرایط جغرافیایی و طبیعت مناسب، در سال­های اخیر پرورش طیور صنعتی و بومی در اکثر مناطق کشور گسترش یافته است. در پرورش طیور صنعتی ایران بزرگ‌ترین تولید کننده در خاورمیانه می­باشد (17). به دلیل قیمت مناسب، گوشت مرغ و تخم مرغ با سرانه مصرف 1/26 کیلوگرم و 7/10 کیلوگرم در برابر گوشت قرمز و ماهی به ترتیب با 43/11 و 2/15 کیلوگرم به عنوان مهم‌ترین منبع پروتئینی خانوارها می‌باشد (5).

علاوه بر طیور صنعتی، پرورش طیور بومی نیز در کشور دارای رونق می­باشد. طبق آمار GIS در بیش از 60000 روستا در کشور طیور بومی پرورش و نگه داری می­شوند و حدود 50 میلیون طیور بومی در کشور پرورش داده می­شود. جهت عرضه و فروش طیور بومی بیش از 100 بازار زنده فروشی وجود دارد. تقریباً در اکثر مناطق روستایی کشور، طیور بومی پرورش داده می­شوند و بیشتر آن‌ها برای فروش در بازارها عرضه می­شوند. در این بازارها انواع گونه­های پرندگان عرضه می­شوند و در کنار هم قرار می­گیرند. تنوع گونه­ها، ارتباط آن‌ها با هم، پایین بودن وضعیت بهداشتی و امنیت زیستی بازارها سبب می­شود این بازارها به عنوان منبع بالقوه برای ویروس­های آنفلوانزا مطرح باشند (3).

با توجه به تعدد بازارهای فروش پرندگان در کشور و اهمیت طیور بومی در نگه داری و انتقال ویروس­های آنفلوانزای H9N2، این مطالعه با هدف بررسی شیوع سرمی و مولکولی این بیماری در بازارهای فروش پرندگان زنده، باغ‌های پرندگان و پارک­های کشور انجام گرفت.

مواد و روش‎کار

روش انجام مطالعه و حجم نمونه: این مطالعه به صورت مقطعی (Cross- sectional) و از مرداد ماه تا آخر آذر ماه سال 1395 در تمامی بازارهای فروش پرندگان زنده، باغ پرندگان، پارک‌ها و باغ وحش‌هایی که در زمان انجام مطالعه فعال بوده و پرنده داشتند انجام گرفت. از هریک از واحدها حداقل از 40 پرنده از گونه­های مختلف خون‌گیری شد. تعداد پرنده مورد نیاز برای نمونه­برداری جهت تشخیص با در نظر گرفتن شیوع 30 درصد و با 95 درصد اطمینان در سطح پرنده انتخاب گردید. همزمان از هر یک از واحدها از 60 پرنده آبزی (اردک و غاز) نیز نمونه سواب کلواک اخذ گردید. در صورتی که تعداد پرنده آبزی کمتر از 60 پرنده بود، از تمامی آن‌ها نمونه سواب اخذ شد. تعداد پرنده لازم برای شناسایی ویروس، با در نظرگرفتن شیوع 5 درصد ویروس در پرنده­ها و با 95 درصد اطمینان محاسبه شد (6).

تست‌های آزمایشگاهی: پس از مراجعه به هر واحد بر اساس حجم نمونه محاسبه شده از هر پرنده با سرنگ 5/2 میلی لیتری از ورید بالی به اندازه یک میلی لیتر خون اخذ شد و بعد از انتقال نمونه­ها به آزمایشگاه سرم آن‌ها جدا و در میکروتیوب 5/1 میلی لیتری قرار گرفت و بعد از کدگذاری و ثبت اطلاعات مربوط به محل نمونه­برداری و مشخصات گونه پرنده، تا زمان انجام آزمایش HI در فریز 20- درجه سانتی­گراد قرار گرفت.

آزمون HI-H9: در مورد ماکیان کلیه نمونه­های سرمی با تست HI برای شناسایی آنتی بادی تحت تیپ H9 آزمایش شدند (14). در مورد سایر طیور برای انجام آزمایش HI ابتدا درمان لازم بر روی نمونه‌های سرمی با استفاده از RBC جوجه­های SPF مطابق دستورالعمل OIE (افزودن 025/0 میلی لیتر RBC جوجه SPF به هر میلی­لیتر سرم و قرار دادن در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه و سانتریفیوژ با 800 دور در 2-5 دقیقه) انجام گرفت و سپس آزمون‌های HI مانند روش­های ذکر شده برای ماکیان انجام گرفت. کلیه نمونه­های سرمی با استفاده از آنتی­ژن H9N2 مورد آزمایش ممانعت از هماگلوتیناسیون قرار گرفتند تا از نظر تیتر آنتی­ بادی ضد ویروس (HI) بررسی شوند. محاسبه تیتر آنتی بادی بر اساس لگاریتم 2 انجام گرفت. عیار سرمی 4 به بالا (عیار 16/1) به عنوان مثبت بودن عیار در نظر گرفته شد (14). پرندگانی که دارای عیار سرمی 4 به بالا بودند مثبت و واحدهایی که دارای حداقل یک نمونه مثبت بودند به عنوان واحد آلوده در نظر گرفته شدند.

آزمون مولکولی: جهت انجام آزمایشات مولکولی، نمونه­های سواب اخذ شده (پنج نمونه سواب از یک گونه پرنده) مخلوط و از آن‌ها سوسپانسیون 10 درصد با PBS حاوی 100 واحد پنی سیلین 100 میکروگرم استرپتومایسین و 80 میکروگرم جنتاماسین در میلی لیتر تهیه شد. جهت جداسازی RNA ویروس، از کیت High pure viral Nucleic Acid Kit ساخت کمپانی (Roche, Germany) و مطابق دستورالعمل کارخانه استفاده شد. تمامی نمونه­ها به روش RT-PCR با استفاده از دو جفت پرایمر جهت ردیابی ژن M و نیز ژن H9 جهت ردیابی ویروس H9N2 به روش توصیه شده آزمایش شدند (2).

تحلیل داده­ها: اطلاعات مربوط به واحدها و نتایج آزمایشگاهی وارد اکسل شده و جهت تحلیل نهایی از نرم افزار SPSS نسخه 22 استفاده گردید. برای توصیف داده­های کیفی، فراوانی و فراوانی نسبی و فاصله اطمینان 95 درصد آن‌ها بیان گردید.

نتایج

نتایج سرمی: در این مطالعه از تعداد 2638 پرنده در 127 بازار، باغ وحش، پارک پرنده و... در 22 استان کشور، نمونه سرمی اخذ شد. تعداد 73 واحد از 127 واحد (48/57 درصد و فاصله اطمینان 95 درصد برابر 2/66 - 4/48 درصد) نمونه‌برداری شده سرم مثبت بودند. 720 پرنده از 2638 پرنده (29/27 و فاصله اطمینان 95 درصد برابر29 - 6/25 درصد) نمونه­برداری شده سرم مثبت بودند. بیشترین تعداد واحد سرم مثبت در استان‌های مازندران، تهران و آذربایجان شرقی و به ترتیب با 11، 9 و 8 واحد بود. بیشترین تعداد پرنده سرم مثبت نیز مربوط به استان‌های آذربایجان شرقی و مازندران به ترتیب با 145 و 86 پرنده سرم مثبت بود. در بین گونه­های پرنده نیز بالاترین درصد سرم مثبت مربوط به بوقلمون و مرغ به ترتیب با 6/47 و 3/45 درصد کمترین درصد سرم مثبت نیز مربوط به اردک و غاز به ترتیب با 8/13 و 3/16 درصد بود. نتایج سرمی به تفکیک استان و تعداد و نوع پرنده سرم مثبت در جدول 1 نشان داده شده است.

نتایج مولکولی: در این مطالعه تعداد 3001 سواب کلواک از اردک و غاز در 122 واحد برای آزمایشات مولکولی نمونه برداری شد. بر اساس نتایج، تعداد 39 سواب تجمیع شده از 18 واحد (75/14 درصد) مثبت بود. استان‌های مازندران و گیلان به ترتیب با 4 و 3 واحد، بیشترین تعداد واحد مثبت را داشتند. تعداد سواب اخذ شده به تفکیک استان و نوع پرنده در جدول 2 نشان داده شده است.

بحث

طیور بومی نقش مهمی در معیشت و اقتصاد روستاییان در ایران دارند و علاوه بر تأمین تخم مرغ و گوشت سفید مورد نیاز آن‌ها، با فروش مازاد تولید، بخشی از هزینه­های زندگی روستاییان از این راه تأمین می­شود. بازارهای فروش پرندگان زنده به عنوان یکی از مهم‌ترین مراکز عرضه تولیدات طیور بومی روستاییان در سراسر کشور و به خصوص استان­های شمالی تلقی می­گردد. در این بازارها طیور پرورش داده شده به صورت زنده و کشتار شده عرضه می­شوند. علاوه بر طیور بومی، در فصل مهاجرت پرندگان مهاجر، پرندگان شکار شده نیز به صورت زنده و کشتار شده عرضه می­گردند. تنوع گونه­های طیور عرضه شده در کنار تنوع فروشندگان و خریداران از نظر جغرافیایی باعث شده این بازارها گاهاً فراتر از منطقه­ای عمل کرده و نقش استانی و حتی ملی داشته باشند به گونه­ای که در این بازارها فروشندگان و خریدارانی از مناطق مختلف کشور حضور داشته باشند. از طرفی بسیاری از پرندگانی که در بازارها عرضه شده و فروخته نمی­شوند، توسط فروشندگان در روزهای بعد به بازاهای شهرهای مجاور منتقل شده و شانس انتقال بیماری به این طریق نیز افزایش می­یابد. در این میان شرایط نامطلوب بازارها از نظر بهداشتی و امنیت زیستی باعث فراهم آوردن شرایط مناسب برای تبادل انواع عوامل بیماریزا و به خصوص ویروس­های آنفلوانزا بین طیور عرضه شده و هم چنین شرایط انتقال با وسایل نقلیه، افراد و حتی سایر وسایل موجود در بازارها را فراهم نماید. در بازارهای کشور عرضه پرنده زنده بدون رعایت اصول اولیه امنیت زیستی به همراه عرضه پرندگان به صورت کشتار شده و حتی کشتار و پرکنی در محل شرایط را برای انتقال و گسترش ویروس­های آنفلوانزا دوچندان مساعد نموده است. از طرفی تراکم بالای این پرندگان باعث افزایش شانس انتقال و گسترش آنفلوانزا و حفظ بقای ویروس به دلیل وجود مخازن حساس و زیاد در آن‌ها می­شود. این ارتباط بین طیور بومی باعث گسترش عفونت از پرندگان آلوده به سایر طیور و هم چنین انتقال توسط جابه­جایی پرنده زنده آلوده، افراد، وسایل نقلیه و... به سایر مناطق و حتی طیور صنعتی می­گردد و نقش مهمی در بقای ویروس و به تبع آن گسترش بیماری دارد.

ویروس H9N2 دارای بیماری‎زایی بالایی برای ماکیان نیست. اما طغیان‌ها و اپیدمی­های مختلف این ویروس در سال‌های گذشته و در نقاط مختلف دنیا و از جمله ایران خسارت­های شدیدی را به صنعت پرورش طیور وارد کرده است. در مطالعه حاضر بیش از 57 درصد از واحدهای نمونه‌برداری شده و بیش از 27 درصد پرندگان نمونه­برداری شده از نظر سرمی علیه آنفلوانزای H9N2 مثبت بودند. شیوع بالای عیار سرمی H9N2 بدون داشتن علائم بیماری می­تواند به دلیل مواجهه مداوم طیور بومی با این ویروس و کسب ایمنی در این پرندگان ناشی از گردش این ویروس در محیط و بین طیور بومی باشد. در مطالعه­ای که در سال 1393 در بازارهای کشور انجام گرفت، 3/53 درصد بازارها سرم مثبت بودند که مانند مطالعه حاضر شیوع بالایی داشته است. در مطالعه مذکور 16 درصد نمونه­های اخذ شده نیز سرم مثبت بودند که نسبت به مطالعه حاضر شیوع در بین پرندگان پایین بوده است (7). در مطالعه­ای که  توسط Saadat و همکاران در سال 2014 در استان بوشهر بر روی 1530 نمونه خون ماکیان بومی جهت تعیین تیتر آنتی بادی علیه ویروس آنفلوانزای (H9N2) انجام گرفت، 39 درصد نمونه­ها دارای تیتر سرمی علیه ویروس‌های آنفلوانزا H9N2 بودند که نشان دهنده شیوع بالای H9N2 در طیور بومی استان بوشهر می­باشد (16).

در مطالعه حاضر بالاترین میزان شیوع در بین مرغ­ها با بیش از 45 درصد سرم مثبت و کم‌ترین مربوط به اردک و غاز با 13 و 17 درصد شیوع سرمی بود. این تفاوت در میزان شیوع احتمالاً به چند دلیل می­تواند ایجاد شده باشد. اول تراکم بالاتر این گونه و به تبع آن ارتباط و تماس بیشتر پرنده­ها با هم و تبادل بیشتر ویروس و در نتیجه مواجهه مداوم و تولید پاسخ ایمنی توسط پرندگان مواجهه یافته، اما در مطالعات متعددی که انجام گرفته، مشخص شده پاسخ­های آنتی­بادی در مواجهه با ویروس­های آنفلوانزا در جوجه­ها > قرقاول> بوقلمون> بلدرچین> اردک بوده است. علت این موضوع می­تواند به دلیل سرعت رسوب پادتن‌ها در سرم، فعالیت کمپلمان و یا فرایند شناسایی و مبارزه با ویرس در بدن میزبان باشد (18).

 در مطالعه حاضر در 15 درصد از واحدها، ویروس شناسایی شد. با توجه به اینکه نمونه­های سواب فقط از طیور آبزی (اردک و غاز) اخذ شده بود، نتایج حاکی از گردش نسبتاً بالای ویروس در بین طیور عرضه شده در بازارها می­باشد. نتایج این مطالعه مشابه نتایج مطالعه انجام گرفته توسط Majidzadeh و همکاران در 2012 بر روی 100 نمونه مدفوع پرندگان وحشی (اردک، گنجشک، طوطی، کلاغ، قو و کبوتر) موجود در پارک­های شهر تهران (آزمایش RT- PCR) بود که 14 درصد نمونه‌های مدفوع برای H9 مثبت بودند (13). در مطالعه انجام گرفته در بازارهای چین در سال­های 2014 و 2015 بیش از 34 درصد نمونه­های اخذ شده برای H9N2 در آزمون مولکولی (RRT-PCR)، مثبت بودند (20).

اما بر خلاف نتایج این مطالعه، در مطالعه­ای که توسط Poursafar و همکاران در سال 2012 بر روی 550 نمونه سواب اخذ شده از کلواک اردک­های بومی استان گیلان جهت ردیابی ویروس­های آنفلوانزا (آزمایش RT-PCR) انجام گرفت، ویروس آنفلوانزای پرندگان در هیچ یک از نمونه‌های مورد آزمایش ردیابی نشد (15).

نتیجه­گیری: نتیجه این مطالعه نشان دهنده شیوع بالای ویروس­های آنفلوانزای H9N2 و گردش آن­ها در بین طیور عرضه شده در بازارهاست. در مشاهدات میدانی، علاوه بر پایین بودن سطح امنیت زیستی در بازارها، وضعیت بهداشتی طیور کشتار شده عرضه شده نیز مناسب نبوده و حتی در بسیاری از موارد غیر بهداشتی می­باشد که می­تواند از نظر بهداشت عمومی و انتقال سایر بیماری‎های مشترک نیز مسئله‎ساز گردد. در سال­های اخیر با شیوع آنفلوانزا، سازمان دامپزشکی اقدام به تعطیلی بازارها نموده که این اقدام پیشگیرانه نه تنها مؤثر نبوده بلکه سبب ایجاد بازارهای حاشیه­ای و کوچک‎تر در اطراف بازارهای اصلی شده و از طرفی با توجه به تأثیر آن بر معیشت مردم، موجب نارضایتی مردم و به تبع آن عدم تمایل مسئولین محلی در تعطیلی بازارها و بازگشایی آن‌ها گردیده است. بنابراین سامان دهی بازارها با ارتقاء سطح بهداشتی و امنیت زیستی بازارها، آموزش مردم با همکاری شهرداری و سایر دستگاه‎های متولی و پایش مداوم پرندگان عرضه شده در بازارها از نظر ویروس­های آنفلوانزا به منظور آگاهی از ویروس­های در گردش و تغییرات ایجاد شده در آن‌ها و اتخاذ تصمیمات پیشگیرانه مناسب، به خصوص در فصل‌های پرخطر از جمله اقدامات ضروری جهت کنترل بیماری در بازارهای کشور می­باشد.

سپاسگزاری

این مقاله مستخرج از پروژه مصوب موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی با کد 960683-96023-056-18-18-12 و مشترک با دفتر بهداشت و مدیریت بیماری‌های طیور سازمان دامپزشکی و با هم کاری ادارات کل دامپزشکی استان‌های مربوطه انجام گرفته که از همکاری آن‌ها در اجرای این مطالعه تشکر و قدردانی می­گردد.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.