مقدمه

Semi-nested RT-PCR: در این مطالعه ابتدا به منظور تکثیر ژنوم رمزکننده پروتئین VP7 از پرایمرهای عمومی VP7-R و VP7-F استفاده شد که این پرایمرها قطعه‌ای با طول 871 باز نوکلئوتیدی از کل ژنوم رمزکننده پروتئین VP7 را تکثیر می‌دهند و از نمونه‌های مثبت که PCR گذاشته شد، 8 نمونه باند واضح مربوط به قطعه مورد نظر را نشان دادند و تعدادی هیچ باندی در دور اول ایجاد نکردند ولی در دور دوم باند مورد نظر ایجاد گردید. هدف از این مطالعه به دست آوردن شیوع با روش مولکولی نبود. از مجموع 49 نمونه‌ای که برای تعیین ژنوتیپ با روش Semi-nested RT-PCR با پرایمرهای اختصاصی نوع گاوی مورد آزمایش قرار گرفتند، در 1 نمونه باند واضح مربوط به قطعه با طول 222 باز نوکلئوتیدی (ژنوتیپ G8) دیده شد و در یک نمونه دیگر  باند واضح مربوط به قطعات 448 باز نوکلئوتیدی (ژنوتیپ G6) و 222 باز نوکلئوتیدی (ژنوتیپ G8) را نشان دادند. که هر دو باند مشاهده شده در نمونه دوم، نشان‌دهنده وجود عفونت همزمان نوزاد با هر دو ژنوتیپ است. سایر نمونه‌ها علی‌رغم اینکه در واکنش دور اول PCR باندهای واضح در طول 881 باز نوکلئوتیدی ایجاد کرده بودند در واکنش دور دوم PCR (واکنش تعیین ژنوتیپ G گاوی) هیچ باندی که معرف وجود ژنوتیپ G گاوی با توجه به پرایمرهای اختصاصی مورد استفاده باشد، ایجاد نکردند. نتایج کلی صورت گرفته در آزمایش دور دوم Semi-nested RT-PCR نشان می‌دهد که Reassortment یا بازآرایی (نوترتیبی) روتاویروس‌های گاوی و انسانی صورت گرفته است به طوری که در سه مورد وجود قطعات VP7 گاوی در روتاویروس‌های انسانی تایید شد.

بحث

در مطالعه حاضر تعداد 100 نمونه مدفوع از کودکان زیر دوسال مبتلا به اسهال از دو شهر واقع در استان تهران در طول فصل بهار تا پاییز 1393 جمع آوری شد. به این منظور از بیمارستان‌ها و مراکز درمانی شهرهای تهران و شهرستان ورامین از هر کدام 50 نمونه جمع آوری گردید. شهرستان ورامین به این علت برای جمع آوری 50 درصد نمونه‌ها انتخاب شد که علاوه بر بالا بودن تراکم و جمعیت شهری، در مناطق روستایی اطراف آن گاوداری‌های صنعتی بسیاری وجود دارد و احتمال برخورد دو جمعیت انسانی و دامی و تبادل ویروس میان این دو جمعیت بالا است و از طرفی به علت پایین بودن ارائه خدمات پزشکی در روستاها و همچنین فاصله ناچیز میان روستاها با مرکز شهرستان ورامین (شهر ورامین) میزان مراجعه روستائیان به مراکز درمانی این شهر بالا است و از این رو انتظار می‌رود احتمال آلودگی با روتاویروس‌های جمعیت گاوی در جمعیت انسانی در این شهرستان بالا باشد.

در این مطالعه از 100 نمونه، 49 مورد در الایزا مثبت تشخیص داده شدند. سپس به منظور تکثیر ژنوم رمزکننده پروتئین VP7 از پرایمرهای عمومی VP7-R و VP7-F استفاده شد که این پرایمرها قطعه‌ای با طول 881 باز نوکلئوتیدی از کل ژنوم رمزکننده پروتئین VP7 را تکثیر می‌دهند و از نمونه‌های مثبت که PCR گذاشته شد، 8 نمونه باند واضح مربوط به قطعه مورد نظر را نشان دادند ولی در دور دوم، فقط در دو نمونه ورامین نتایج مثبت بود و وجود قطعه VP7 گاوی در روتاویروس انسانی تایید گردید. اختلاف نتیجه بین الایزا و  PCR می‌تواند به حضور عوامل مهارکننده PCR در نمونه مدفوع، عدم استفاده از سایر پرایمرها، پاسخ مثبت کاذب الایزا، و نیز روش استخراج RNA مربوط باشد (22،24)، یکی دیگر از دلایل منفی بودن واکنش PCR، عدم اتصال مناسب پرایمرها با توالی نوکلئوتیدی الگو است. این موضوع به ویژه در RNA ویروس‌ها که میزان جهش در آن‌ها به مراتب بالاتر از سایر موجودات زنده است بیشتر به چشم می‌خورد (8).

در این مطالعه تعداد 6 نمونه منتخب که بر روی خط سلولی MA104 پاساژ داده شدند، در پاساژ چهارم یا پنجم آثار CPE را بر روی کشت سلولی تک لایه نشان دادند و ویروس‌های عادت داده شده به کشت سلولی MA104، در تلقیح به کشت سلولی پس از 48 تا 72 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2 آثار مرگ سلولی را نشان می‌دادند. نتایج حاصل از روشی که در این مطالعه برای کشت و جداسازی روتاویروس در نظر گرفته شد با روش پیشنهاد شده توسط Kutsuzawa و همکارانش در سال 1982 همخوانی دارد؛ آنان در پاساژ سوم تا ششم آثار CPE را مشاهده نمودند (17). نتایج نشان می‌دهد که روتاویروس‌های نوترتیب این مطالعه فعال بوده و تکثیر پیدا می‌کنند.

در این مطالعه با توجه به مزایای یاد شده از روش Semi-nested RT-PCR جهت تعیین ژنوتیپ‌های G گاوی در موارد انسانی به وسیله پرایمرهای اختصاصی DT6 و HT8 و ET10 مرتبط با قطعات شایع روتاویروس‌ گاوی G6، G8 و G10 استفاده شد (22)، تا بررسی قطعات اختصاصی G تایپ گاوی در موارد اسهال انسانی و وجود نوترتیبی ژنتیکی مشخص شود. از میان نمونه‌هایی که در دور دوم با روش Semi-nested RT-PCR مورد بررسی قرار گرفتند دو نمونه از شهر ورامین علاوه بر ایجاد باند در دور اول، باند واضحی مربوط به دو سروتیپ‌های G6 و G8 ایجاد کردند که در یکی از این دو نمونه هر دو باند G6 و G8 ایجاد شد که نشان‌دهنده عفونت همزمان با هر دو ژنوتیپ است. این نتیجه با در نظر گرفتن این واقعیت که ژنوم روتاویروس‌ها قطعه‌قطعه است بسیار حائز اهمیت می‌باشد، چرا که همواره احتمال وقوع نوترتیبی ژنتیکی در آلودگی همزمان یک سلول با دو روتاویروس و در نتیجه پیدایش سویه نوترتیب جدید وجود دارد (8). پدیده نوترتیبی ژنتیکی، یکی از راهکارهای مهم روتاویروس‌ها در تکامل و همچنین فرار از سیستم ایمنی میزبان است (20). از آنجا که شیوع سروتیپ‌های غیرمعمول در یک نقطه خاص ممکن است در نتیجه وقوع نوترتیبی بین روتاویروس‌های انسانی و حیوانی ایجاد شود (که خود ناشی از انتقال بین گونه روتاویروس‌های حیوان و انسان است) و یا سروتیپ غالب در حیوانات به جمعیت انسانی مجاور زیستگاه حیوانات سرایت و در آن‌ها ایجاد بیماری کند. Gombold و همکاران در تحقیق جالبی درسال 1986 دو جدایه وحشی روتاویروس میمون (SA11) و رزوس (RRA) را به موش‌های نژاد CD-1 نوزاد مادران سرم منفی بطور همزمان خورانده ودر مقاطع زمانی مختلف از نمونه‌های مدفوع، ویروس جدا نموده و روی ژل پلی آکریلامید وجود نوترتیبی قطعات را بررسی نمودند. نتایج نشانگر میزان نوترتیبی 38 درصد (252 از 662 جدایه) بوده که 25 درصد در 12 ساعت ابتدایی و در ادامه در طی 72 و 96 ساعت، بترتیب، 80-100 درصد جدایه ها نوترتیبی حداقل در یک قطعه را نشان دادند. نیز رفته رفته یک جدایه نوترتیب غالب می‌شده که علت آن فشارهای انتخابی ذکر شده است (11). نیز Graham و همکاران در سال 1987 هنگامی‌که جدایه‌های روتاویروس انسانی و گاوی را به خط سلولی کلیه میمون MA104 و نیز BSC-1 همزمان تلقیح نمودند، 511 پلاک متفاوت جدا نموده که از نظر ژنتیک در ژل پلی آکریلامید دارای قطعات متفاوت بودند. نتایج نشان داد که نوترتیبی پدیده اتفاقی نیست، مربوط به قطعات خاصی است و نوع سلول، گونه میزبان و فشارهای انتخابی در فراوانی و قطعه نوترتیب، تأثیر بسزایی دارد (13). همینطور Maunula و همکاران در سال 2002 با بررسی 17 جدایه شاخص اپیدمی‌های سال‌های 1997-1980 فنلاند و بررسی ژنوتیپ آن‌ها، فراوانی بالای تغییرات مشاهده شده را بدلیل نوترتیبی قطعات دانسته و عنوان کردند که این تغییرات فقط در VP7 و VP4 نبوده و دیگر قطعات را نیز شامل می‌شود (19). Iturriza-Gomara و همکاران در سال 2001 پس از بررسی 3601 جدایه روتاویروسی انسانی کشور انگلستان بین سال‌های 99-1995، میزان نوترتیبی جدایه‌ها را 2 درصد گزارش نموده و اظهار داشتند که این پدیده نادر نبوده و جمعیت آن در کل جمعیت روتاویروس جهانی، معنی‌دار است (15). نیز Unicomb و همکاران در سال 1999 روی 1534 جدایه انسانی بنگلادش بین سال‌های 7-1992 مطالعه نموده و تفاوت زیادی در ژنوتیپ G9 از نظر تیپ متفاوت P و همینطور در جدایه‌های G2 و G4 مشاهده نمودند و آن را ناشی از نوترتیبی جدایه‌های G آن‌ها با VP4 (P) متفاوت دانستند. این پژوهشگران نیز تواتر نوترتیبی را در جدایه‌های روتاویروس بنگلادش بسیار بالا برآورد نمودند (28). Trojnar و همکاران در سال 2013 نشان دادند که قطعه VP4(P) از یک جدایه روتاویروس طیورمشابه قطعه جدایه‌های سگ و خوک بوده و نوترتیبی بین روتاویروس‌های طیوری و پستانداری را نشان دادند (27). هم چنین Schumann و همکاران در سال 2009 با بررسی چهار ژن VP4, VP6, VP7, NSP5 در هشت جدایه روتاویروسی ماکیان و بوقلمون، امکان انتقال بین گونه‌ای و نوترتیبی ژن‌های روتاویروس طیور را نشان دادند (25). Bányai و همکاران در سال 2008 در نیکاراگوئه وقوع نوترتیبی و بیماریزایی یک روتاویروس A نوترتیب انسانی – گاوی در کودکان را نشان دادند (2). در نهایت Gentsch و همکاران در سال 2005 با مرور و بررسی ژنوتیپ‌های انسانی و تغییرات بالای آن‌ها اینطور نتیجه گرفتند که تنوع بالای تغییرات روتاویروس انسانی و امکان تبادل بالای آن با قطعات جدایه‌های دیگر انسانی و نیز دامی، لزوم پوشش همه سروتیپ‌ها را در واکسن‌های نوترتیب انسانی یادآور می‌کند (9). 

به عبارت دیگر در صورت عدم رعایت بهداشت، امکان نوترتیبی طبیعی ویروس بین سویه‌های مختلف انسانی و حتی بین سویه‌های انسانی با حیوانی که در این مطالعه به آن پرداخته شد، امکان ایجاد ژنوتیپ نوظهور فراهم می‌گردد. از آنجایی که تبادل قطعات بین سویه‌های انسانی و گاوی به کرات از نقاط مختف دنیا گزارش شده (6،10) و در مطالعه Ahmadi و همکاران در سال 2012 داشتند، تولید سویة بازآرایی (نوترتیب) شدة روتاویروس گاوی را در کشت سلولی با موفقیت انجام داده‌اند، در این مطالعه امکان وجود نوترتیبی در ایزوله‌های جدا شده از بیماران بیمارستان‌ها مطالعه و اثبات گردید (1).

به عبارت دیگر نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که در صورت تبادل قطعه VP7 و ظهور تیپ‌های جدید انسانی، به دلیل تفاوت سویه نوترتیب جدید در پروتئین ایمونوژن، امکان غالب شدن آن در جمعیت انسانی به علت فقدان ایمنی مادری و کارآیی پایین واکسن‌های رایج روی سویه جدید و در نهایت، همه‌گیری و تلفات چه بسا قابل ملاحظه‌ای امکان خواهد داشت که به مطالعات بیشتر و پایش مداوم نیاز دارد. بنابراین پایش سویه‌های موجود روتاویروسی انسانی غالب در مناطق آلوده با روتاویروس گاوی و هشیاری و آمادگی در برابر احتمال وقوع چنین رخدادی منطقی و لازم بنظر می‌رسد.

سپاسگزاری

به این وسیله از معاونت پژوهشی دانشکده علوم زیستی دانشگاه شهید بهشتی به جهت تـأمین هزینه‌های این طرح و نیز از کارکنان آزمایشگاه ویروس شناسی و آزمایشگاه مرکزی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران برای مساعدت و همکاری صمیمانه، تشکر و قدردانی می‌گردد.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

جدول 1.ویژگی و توالی هر یک از پرایمر‌های استفاده شده در این مطالعه.

تصویر 1. وجود آثار تخریب سلولی سایتوپاتیک یکی از نمونه‌های مثبت  پس از 4 پاساژ روی سلول‌های MA104.

تصویر2. آزمایش Semi-nested RT-PCR و باندهای G گاوی مربوط به دو نمونه مثبت که شماره 1، یک باند به اندازه bp222 (ژنوتیپ G8) و شماره 2، دو باند به اندازه‌های bp222 (ژنوتیپ G8) و bp448 (ژنوتیپ G6) را نشان دادند.