ارزیابی توزیع بافتی آنزیم رودناز در گونه‌های بومی ماهیان جنس باربوس

مقدمه

سیانید یک ترکیب بسیار سمی است که به آسانی جذب شده و به علت جلوگیری از ورود اکسیژن، باعث مرگ بافت می‌شود. بسیاری از مواد طبیعی و همچنین محصولات صنعتی حاوی سیانید می‌باشند (20). منابع طبیعی از سیانید شامل گونه‌های مختلف از باکتری‌ها، جلبک‌ها، قارچ‌ها، و گیاهان عالی هستند که سیانید را دفع می‌کنند (46). نمک سیانید به طور گسترده‌ای در تولید پارچه‌های مصنوعی، پلاستیک، در صنعت معادن فلزی برای بازیافت فلزات گرانبها مثل طلا و نقره از سنگ معدن و به طور گسترده به عنوان عامل آفت‌کش و واسطه در کشاورزی برای تولید مواد شیمیایی استفاده می‌شود. بنابراین، سیانیدها یکی از دسته‌های مهم مواد شیمیایی سمی نگران‌کننده در فاضلاب‌های دریافتی توسط موجودات زنده آبزی هستند (25،44). سیانیدها به آسانی در سراسر غشاء آبشش جذب می‌شوند و به صورت قوی و سریع‌الاثر باعث القاء کاهش اکسیژن و‌هایپوکسی سمی در بافت می‌شوند. ماهی‌های آب شیرین حساس‌ترین گروه از موجودات آبزی نسبت به مسمومیت با سیانید هستند. مرگ و میر بالا در غلظت‌های بالاتر از  µg/l 20 سیانید آزاد و اثرات سوء بر روی شنا و تولید مثل در غلظت‌های بالاتر از µg/l  5 در ماهیان گزارش شده است (21). با این حال، تنوع درحساسیت به سیانید در ماهی‌های مختلف گزارش شده است (19). در گزارشاتی کشته شدن حجم عظیمی از ماهی‌ها و سایر موجودات زنده آبزی ناشی از تخلیه تصادفی زباله‌های سیانیدی نیز اعلام شده است (21،22). رودناز (تیوسولفات: سولفورترانسفراز سیانید؛EC 2,8,1,1)، آنزیمی است که در همه موجودات زنده، از باکتری تا انسان فعال است (4،10،17،33،40). رودناز یک سولفورترانسفراز می‌باشد که در شرایط آزمایشگاهی، تشکیل تیوسیانات از سیانید و تیوسولفات و یا دیگر دهندگان مناسب سولفور را تسریع  می‌کند. این اعتقاد وجود دارد که رودناز در سم‌زدایی سیانید دخیل است (6،17،26،27،47).

نقش رودناز در سم‌زدایی سیانید بوسیله غلظت‌های بالای این آنزیم در برخی از بافت‌ها و اندام‌های در معرض سیانیددر پستانداران، مانند کبد، پشتیبانی می‌شود (43). با این حال، شواهدی وجود دارد که آنزیم رودناز ممکن است درگیر وظایفی دیگر، از جمله تشکیل مراکز سولفور آهن (13)، مشارکت در سوخت و ساز انرژی (12،36)، و عملکردی به عنوان یک دیوردوکسین اکسیداز (34)، شود. اکثر بافت‌ها دارای ویژگی صفات آنزیمی هستند که در ارتباط با عملکرد بافت می‌باشد. فعالیت اختصاصی رودناز در بافت، در طیف گسترده‌ای از گونه‌ها گزارش شده است (1،3،5،7،10،17،18،40). کپورماهیان بزرگترین گروه ماهی‌های پرورشی آب شیرین با اهمیت تجاری بالا می‌باشند. چهار گونه از این ماهیان شامل برزم (Luciobarbus barbulus)، بنی (Mesopotamichthys sharpey)، شیربت (Tor grypus) و گطان (Luciobarbus xanthopterus) بعنوان ماهیان بومی استان خوزستان می‌باشند. پراکنش این چهار گونه درجهان، محدود به قسمت‌هایی از ایران، عراق و سوریه

است .هر چهار گونه در برنامه‌های بازسازی ذخایر منابع آبی شیلات بصورت مصنوعی تکثیر شده و سالانه بیش از 20 میلیون قطعه بچه ماهی از این چهار گونه درمنابع آبی استان رهاسازی یا بصورت پلی‌کالچر همراه سایر کپورماهیان در استخرهای خاکی پرورش داده می‌شوند (گزارش آماری شیلات، 20015-2000). علی‌رغم اهمیت بالای آنزیم رودناز در مسمومیت‌زدایی یون سیانید در بافت‌های گونه‌های مختلف، اطلاعات بسیار کمی از فعالیت و توزیع بافتی این آنزیم در بسیاری از گونه‌های ماهی دردسترس می‌باشد.

در مطالعه حاضر توزیع بافتی آنزیم رودناز در بافت‌های مختلف چهار گونه فوق بررسی و مقایسه شد تا براساس نتایج آن بتوان از این اطلاعات در بازسازی ذخایر و نیز مطالعات دیگر روی اثر آلودگی با سیانید بر فون ماهیان بومی استان استفاده نمود.

مواد و روش کار

آماده سازی ماهیان مورد آزمایش: در این مطالعه گونه‌های ماهیان بومی شامل برزم (Luciobarbus barbulus)، بنی (Mesopotamichthys sharpey)، شیربت (Tor grypus) و گطان (Luciobarbus xanthopterus) مورد استفاده قرار گرفتند. برای انجام آزمایش 10 نمونه از هر گونه ماهی (در مجموع 40 نمونه) با میانگین طول 5/6± 5/32 و میانگین وزن 110 ± 440 استفاده شدند. ماهی‌ها از چهار منطقه ذخیره صید رودخانه کارون شامل گتوند، شوشتر، دارخوین و اهواز  جداسازی و  به آزمایشگاه آبزیان دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز انتقال یافتند.

ارزیابی آنزیم‌های رودناز: در آزمایشگاه ماهیان آسان‌کشی و کالبدگشایی شدند و بافت‌های کبد، کلیه، آبشش و روده‌ها به سرعت جداسازی و با سرم فیزیولوژی شسته شدند. همه نمونه‌های بافتی تا زمان آنالیز در  فریزر C°20- نگهداری شدند. به منظور ارزیابی فعالیت رودناز در بافت‌های مذکور ابتدا با استفاده از بافر هموژن کننده (تریس Mmol 50،  Triton X-100 1/0درصد، کلرید سدیم Mmol 150، سدیم فلوراید Mmol1، EDTAMmol 1، SDS1/0درصد) بافت‌ها هموژن شدند. سپس نمونه‌ها به مدت 10دقیقه با دور10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و مایع رویی جهت ارزیابی فعالیت آنزیم مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت آنزیم رودناز با استفاده از روش اصلاح شده Sorbo (1958) در بافت‌های کبد، کلیه، آبشش و روده‌ها اندازه‌گیری شد. بطور خلاصه مقدارml 50 نمونه هموژن شده بهml 4 مخلوط واکنش حاوی تیوسولفات Mmol 8/16، بافر گلیسین Mmol 40 و سیانید پتاسیم Mmol 167 با 2/9=pH  اضافه و به مدت 15 دقیقه در دمای C° 37 انکوبه شد. واکنش با افزودنml 5/0 فرمالدئید 38درصد متوقف شد. در نمونه شاهد فرمالدئید همزمان به نمونه آنزیم به مخلوط واکنش اضافه شد. سپسبه منظور تعیین میزان تیوسیانات تشکیل شده، ml 1 محلول رنگزا  (025/0 3 (NO3)ا Fe درml 74/0 آب وml 26/0 نیتریک اسید غلیظ) به هر نمونه اضافه و با سرعت 5000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. جذب مایع رویی در طول موجnm 460 در مقابل شاهد قرائت گردید. مقدار تیوسیانات تولید شده در هر واکنش با رسم نمودار استاندارد تغییرات غلظت‌های مختلف تیوسیانات(Mmol/L 200-5) در مقابل جذب نمونه‌ها محاسبه گردید. واحد فعالیت آنزیم بر اساس Mmol تیوسیانات تولید شده در مدت یک دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 2/9=pH محاسبه و بر اساس واحد U/mg  پروتئین ارایه گردید. مقدار پروتئین در نمونه‌های هموژن بافتی با استفاده از روش برادفورد و آلبومین سرم گاوی (mg/ml) بعنوان استاندارد اندازه‌گیری شد.

آنالیز آماری: تجزیه و تحلیل‌های آماری داده‌ها با استفاده از نرم افزار SPSSنسخه 18 انجام شد. مقایسه فعالیت آنزیم بین بافتهای مختلف در یک گونه و بین یک بافت در گونه‌های مختلف با استفاده از آزمون مستقل t انجام شد. سطح معنی‌داری داده‌ها 05/0>P در نظر گرفته شد.

نتایج

فعالیت اختصاصی رودناز در بافت‌های مختلفماهیان بومی مورد مطالعه، در جدول شماره 1 نشان داده شده است. همانطور که مشاهده می‌شود بیشترین فعالیت رودناز در کبد مربوط به ماهی برزم (Luciobarbus barbulus) با میانگین 092/0 ± 341/0 و کمترین فعالیت آن مربوط به ماهی شیربت ( (Torgrypusبا میانگین 064/0 ±297/0 بود. بیشترین فعالیت رودناز در کلیه مربوط به ماهی بنی (Mesopotamichthys sharpey) با میانگین 031/0 ±238/0 و کمترین فعالیت آن مربوط به ماهی شیربت (Tor grypus) با میانگین 051/0 ± 219/0 بود. بیشترین فعالیت رودناز در روده مربوط به ماهی شیربت (Tor grypus) با میانگین 017/0 ± 124/0 و کمترین فعالیت آن مربوط به ماهی برزم (Luciobarbus barbulus) با میانگین031/0 ± 109/0 بود. بیشترین فعالیت رودناز در آبشش مربوط به ماهی برزم (Luciobarbus barbulus) با میانگین043/0 ±172/0 و کمترین فعالیت آن مربوط به ماهی شیربت (Tor grypus) با میانگین 027/0 ±138/0 بود. نتایج تحقیق حاضر نشاندهنده الگوی متفاوت فعالیت رودناز در بافت‌های هر گونه بود. در تمام گونه‌ها بالاترین فعالیت رودناز در بافت کبد مشاهده شد (نمودار 1). در گونه‌های گطان و بنی فعالیت رودناز در بافت‌های کلیه و آبشش اختلاف معنی‌داری نداشت (نمودار 2). در گونه شیربت فعالیت آنزیم رودناز در بافت‌های آبشش و روده مشابه بود (نمودار 1). در تمام گونه‌ها فعالیت رودناز در روده‌ها کمترین میزان را نشان داد.

جدول 1: مقایسه میانگین ± انحراف معیار فعالیت آنزیم رودناز در بافت­های مختلف ماهی شیربت Tor grypus

بحث

سیانید یک سم قوی و گسترده در محیط زیست است. مسمومیت با سیانید در انسان و سایر حیوانات یک موضوع سم‌شناسی و زیست محیطی مهم می‌باشد. تبدیل آنزیمی سیانید به تیوسیانات توسط رودناز، به عنوان مسیر اصلی سوخت و ساز سیانید درحیوانات در نظر گرفته می‌شود (6،13،47). سطح رودناز موجود در بافت‌های مختلف جانوران با میزان در معرض قرار گرفتن آن‌ها با سیانید، در ارتباط است (6،9،30). یک ارتباط نزدیک بین فعالیت رودنازو تولید سیانید در گیاهان گزارش شده است که نشان می‌دهد این آنزیم مکانیسمی مهم برای سم‌زدایی سیانید در گیاهان سیانوژنیک، می‌باشد (41). رودناز همچنین یک آنزیم کلیدی درگیر در سم‌زدایی سیانید در ماهی است (24). این حقیقت که گونه‌های مختلف گربه ماهی و دیگرحیوانات قادر به انطباق و زنده ماندن در زیستگاه‌های آلوده به سیانید هستند، منجر به این فرضیه شده است که آنزیم رودناز ایمنی ذاتی در برابر سمیت سیانید را برای گربه ماهی و سایر آبزیان فراهم می‌کند (2).

در مطالعه حاضر، بالاترین فعالیت رودناز در هر چهار گونه مورد بررسی در کبد مشاهده شد، در حالیکه کمترین فعالیت آن در روده بود. در مطالعات قبلی، افزایش سطح فعالیت رودنازدر کبد ماهی مجاور با سیانید، گزارش شده است (14). در مطالعه دیگری که بر روی ماهی دامسل زندانی (Dascyllus aruanus) در معرض سیانید قرار گرفته، انجام شد تفاوت معنی‌داری در فعالیت رودناز کبد بین تیمارهای مختلف رخ داد.

اما این تغییرات در فعالیت آنزیم، به میزان مواجهه با سیانید ارتباط نداشته است (24). رودناز از آبشش و کلیه ماهی نیز جدا شده، اما بیشترین فعالیت آن در کبد بوده است (29). بالاترین میانگین فعالیت اختصاصی رودناز در کبد و کلیه گونه‌های کپور قبلا گزارش شده است (3،5،17،18،37،48). در مطالعه‌ای که توسط Baghshani و Aminlari در سال 2012، بر روی چهار گونه ماهی کپور انجام شد، بیشترین میزان فعالیت آنزیم رودناز در هر چهار گونه مورد مطالعه در کبد و کلیه بدست آمد. نتایج مطاللعه حاضر با نتایج مطالعات فوق همخوانی دارد. به نظر می‌رسد که الگوی توزیع رودناز در ماهی‌های بومی در مطالعه حاضر به طور زیاد به گونه‌ و بافت خاص مربوط می‌باشد. همچنین، فعالیت آنزیم در یک بافت خاص ممکن است منعکس کننده توانایی آن بافت در سم‌زدایی سیانید باشد (3). در مطالعه حاضر فعالیت اختصاصی رودناز (341/0 واحد آنزیم/ میلی گرم پروتئین) در عصاره خام کبد ماهی برزم (Luciobarbus barbulus) بالاتر از ماهیان بومی دیگر بود که در مقایسه با مطالعه Akinsiku و همکاران در سال 2010، فعالیت اختصاصی رودناز در گربه ماهی آفریقایی                Clarias gariepinus بیشتر از مقدار کنونی برای گونه‌های بومی بود که می‌توان دلیل آن را وجود مقدار زیاد سیانید و تحمل بالای این ماهی نسبت به سیانید موجود در محیط زندگی‌اش دانست. با این حال، در برخی از گونه‌های جانوری نشان داده شده است که سایر ارگان‌ها به عنوان مثال دستگاه گوارش (6،8،40) و یا غدد آدرنال (26) دارای فعالیت‌های بالاتری از رودناز هستند. از سویی دیگر، میزان فعالیت رودناز کبد و کلیه برای گونه‌های بومی در مطالعه حاضر، نسبت به داده‌های بدست آمده در گزارشات قبلی برای جانوران دیگر کمتر است (1،3،5). Dudeck و همکاران در سال 1980، گزارش دادند که فعالیت اختصاصی رودناز کبد در ماهی در مقایسه با موش، همستر، و قورباغه پایین‌تر است. نتایج مطالعات فوق با نتایج مطالعه حاضر متفاوت است که این احتمالاً به علت تفاوت‌های بین گونه‌ای، وضعیت تغذیه‌ای، و یا دیگر عوامل ناشناخته است. با این حال، فعالیت‌های بالاتر رودناز در کبد گونه‌های بومی مورد مطالعه، ممکن است به طورکلی به نقش کبد به عنوان ارگان اصلی تغییر شکل دهنده زیستی در فرآیندهای سم‌زدایی سیانید نسبت داده شود (1). از میان بافت‌های دیگر، فعالیت اختصاصی رودناز در کلیه به صورت قابل توجهی نسبت به روده و آبشش در همه گونه‌های بومی بیشتر بود. سیانید ابتدا وارد جریان خون ماهی می‌شود و سپس از طریق آبشش و روده به سرعت در سایر بافت‌های بدن پراکنده می‌شود (32). یک منبع بزرگ از سیانید در طبیعت گلیکوزیدهای سیانوژنیک هستند. فعالیت آنزیمی فلور میکروبی دستگاه گوارش بر این گلیکوزیدهای بلع شده از طریق مواد غذایی، سیانید هیدروژن سمی را آزاد می‌کند. سیانوژن‌ها در حال حاضر به عنوان مواد ضد تغذیه‌ای در برخی از مواد مشتق شده از گیاهان (مانند ریشه محصولات زراعی همچون دانه کتان) هستند که به عنوان مواد تشکیل دهنده خوراک ماهی می-باشند (23). تحقیقات نشان داده است که مصرف خوراک ماهی محتوی مواد غذایی سیانوژن مانند بذر کتان، در مقایسه با ماهیان دریافت کننده غذای کنترل موجب کاهش رشد می‌شوند (27،45). پایین بودن فعالیت آنزیم رودناز که در این مطالعه مشاهده گردید ممکن است توجیهی بر کاهش رشد ناشی از مصرف غذاهای حاوی سیانید بالا در ماهیان باشد.

آبشش، به عنوان ارگان تنفسی ماهی، در طول مواجهه با سیانید محیط زیست، متمایل به تماس مستقیم با سیانید است. از این رو، فعالیت نسبتاًً بالاتر رودناز در این بافت‌ها احتمالاًً سم زدایی مناسب سیانید را  قبل از انتقال آن از طریق جریان خون به اندام‌های دیگر، ثابت می‌کند. در مطالعه حاضر، روده و آبشش ماهیان بومی فعالیت رودناز را نشان دادند، اگر چه مقدار آن پایین‌تراز کبد و کلیه است. وجود رودناز در بافت‌های مختلف، دیگر عملکردهای مهم بیولوژیکی این آنزیم را علاوه بر سم‌زدایی سیانید نشان می‌دهد. با توجه به جرم کل عضلات، نقش تمام رودناز بدنو کل سیانید تغییر شکل دهنده زیستی، می‌تواند قابل توجه باشد (16). این مسئله مطرح شده است که فعالیت رودناز ممکن است تحت تأثیر رژیم غذایی باشد (39). با مطالعه گونه‌های ماهیان بومی می‌توان آن‌ها را بر اساس عادات غذایی به گوشتخوار (Luciobarbus barbulus) و همه‌چیز خوار (Tor grypus و Mesopotamichthys sharpey و Luciobarbus xanthopterus)، طبقه‌بندی نمود (11). گونه‌های ماهی که مقدار قابل توجهی از خوراک خود را توسط مواد گیاهی به دست می‌آورند، احتمالاًً در معرض سطح بالاتری از گلیکوزیدهای سیانوژنیک قرار می‌گیرند. با این حال، نبودن تفاوت‌های بین گونه‌ای در فعالیت‌های آنزیمی بافت‌های مختلف نشان می‌دهد که عادات تغذیه‌ای، اثر قابل توجهی بر سطح رودناز در گونه‌های مختلف ماهیان بومی ندارد. به طور خلاصه، این مطالعه نشان داد که آنزیم رودناز در بافت‌های مختلف چهار گونه ماهیان بومی استان خوزستان بیان شده و داری فعالیت است. حضور رودناز در بافت‌های مختلف نشان می‌دهد که این آنزیم ممکن است در بسیاری ازفعالیت‌های فیزیولوژیکی در این گونه‌ها، نقش داشته باشد. مطالعات آینده برای روشن شدن خواص مولکولی رودناز از دخالت آنزیم در دیگر فرآیندهای بیولوژیکی علاوه بر سم‌زدایی سیانید و امکان ایجاد شرایط پاتوفیزیولوژیکی در این گونه‌ها، مورد نیاز است.

تشکروقدردانی

نویسندگان مقاله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز و قطب علمی آبزیان بدلیل تامین هزینه‌های پروژه تشکر و قدردانی می‌نمایند.

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.