مقایسه‌ی اثر باسیلوس‌های تجاری و بومی (Bacillus subtilis ، Bacillus licheniformis) بر برخی شاخص‌های ایمنی و آنزیم‌های سرمی بدن لارو میگوی پا سفید غربی (Litopenaeus vannamei)

میگوی پا سفید غربی (Litopenaeus vannamei) بطور گسترده در بخش‌های مختلفی از دنیا پرورش داده می‌شود. رشد سریع، بازماندگی خوب در تراکم‌های بالای پرورش و دامنه تحمل نسبت به بیماری سبب شده است تا این میگو بعنوان یک انتخاب مناسب در سیستم‌های پرورشی متراکم و نیمه متراکم در نظر گرفته شود (33،50). این گونه در حال حاضر به عنوان اولین گونه پرورشی میگو در ایران پرورش داده می‌شود. بنابراین، جیره‌های مصنوعی که بتواند احتیاجات ایمونولوژیکی و تغذیه‌ای را تأمین نماید موجب گسترش و بهبود تولید صنعتی می‌شود. به عنوان مثال باکتری باسیلوس می‌تواند آنزیم‌های خارجی زیادی را ترشح و سبب افزایش دامنه تحمل نسبت به دما و کم آبی شود، این باکتری‌ها بطور گسترده‌ای به عنوان پروبیوتیک‌های مورد قبول و شناخته شده در غذا به کار گرفته می‌شوند (27و28). مطالعات نشان می‌دهد هنگامی که این باکتری‌ها به عنوان پروبیوتیک در میگو استفاده می‌شود رشد، بازماندگی، فعالیت آنزیم‌های هضمی و قابلیت هضم ظاهری غذا بهبود یافته و موجب افزایش ایمنی می‌شوند (25،37).

سیستم ایمنی در سخت‌پوستان شامل واکنش‌های سلولی و هومورال بوده که بطور عمده‌ای وابسته به خون یا همولنف ‎آن‌ها می‌باشد. واکنش‌های سلولی شامل ذره‌خواری، تشکیل کپسول و برآمدگی کوچک از میکروارگانیزم‌ها و انگل‌ها؛ و تخریب آن‌ها به وسیله مولکول‌های میکروبیوسیدال و سیتوتوکسیک می‌باشد. از سوی دیگر، واکنش‌های هومورال شامل چندین ملکول محلول همچون لکتین‌های پلاسما، ترکیبات سیستم پروفنولکسیداز (proPO)، پپتید‌های ضد میکروبی و پروتئین‌های درگیر شده در انعقاد همولنف می‌باشد که در ترکیب با واکنش‌های سلولی؛ جانور را در برابر عوامل بیماری‎‌زا محافظت می‌نماید (32).

محققان شیلاتی برای طبقه‌بندی هموسیت‌‎ها، معیار‌های مختلفی اتخاذ کرده‌اند اما با این وجود طبقه‌بندی هموسیت‎‌های سخت‌-‎پوستان هنوز بحث برانگیز باقی مانده است. در سخت‌‎پوستان هموسیت‎‌ها‎ی سیال به طور کلی به 3 دسته شامل سلول‎‌ها‎ی دانه‎دار بزرگ (LGC)، سلول‎‌ها‎ی نیمه دانه‎دار (SGC) و هیالین (HC) طبقه‌بندی می‎شوند (15). هموسیت‎ها‎ی سیال نه فقط از طریق ذره‌خواری و کشتن عوامل عفونی بلکه با ساخت و اگزوسیتوز ترکیبات ضد میکروبی، نقش مهمی در سیستم ایمنی میگو ایفا می‎کنند (39). مطالعات صورت گرفته بر روی پارامتر‌های بیوشیمیایی سرم خون در برخی از بیماری‎‌ها‎ نشانگر بروز تغییرات معنی‎دار در برخی پارامترهای بیوشیمیایی سرم خون می‎باشد (30). پارامترهای بیوشیمیایی موجود در خون به عنوان شاخص با ارزشی برای نظارت بر سلامت و پاسخ‎ها‎ی فیزیولوژیک تغذیه می‎باشد (8). از آنجا که پارامترهای خونی شرایط نامناسب را بسیار سریع‎تر از سایر پارامترها نشان می‎دهند از آن‎ها‎ به طور وسیعی برای توصیف وضعیت سلامت جانور و ارزیابی پاسخ‎ها‎ی استرس و سازش‎ها‎ی فیزیولوژیک موجود استفاده می‎شود (4).

بیشتر تحقیقات پروبیوتیکی صورت گرفته اخیر بر روی میگوی پا سفید غربی بر روی مراحل جوانی و بلوغ متمرکز بوده است (24،49) و دانش کمی در مورد اثرات پروبیوتیک‌ها بر روی مراحل لاروی و پست لاروی وجود دارد. بنابراین، هدف از انجام این آزمایش؛ بررسی پاسخ‌های ایمونولوژیکی و سنجش آنزیمی در میگوی پا سفید غربی در نتیجه استفاده از جیره‌های حاوی پروبیوتیک‌های باسیلوسی جداسازی شده و تجاری (Bacillus subtilis; B. licheniformis) بود.

مواد و روش‌ کار

سویه پروبیوتیکی و جیره: پروبیوتیک تجاری بکار رفته در این آزمایش که شامل B. licheniformis و Bacillus subtilis بود از شرکت پروتکسین آکواتک تهیه گردید. همچنین باسیلوس‌های پروبیوتیک بومی (Bacillus subtilis; B. licheniformis) مورد استفاده در این تحقیق نیز از دستگاه گوارش بچه ماهیان انگشت‎قد فیل ماهی استخراج گردید (26). در ادامه جهت آماده سازی این پروبیوتیک‌ها بر اساس دستور العمل Abdollahi Arpanahi و همکاران در 2014 عمل گردید (1). بدین صورت که اسپورهای باسیلوسی را بر روی محیط کشت تریپتیک سوی آگار (TSA) کشت داده و برای مدت 24 ساعت در دمای C° 30 انکوباسیون شدند تا پرگنه‌ها نمایان شود. سپس با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Biochrom, Libra S22) غلظت مورد نظر در طول موج nm 600  بر مبنای CFU/mL تعیین گردید. برای تهیه غلظت پروبیوتیک تجاری- بومی (با نسبت برابر از هر یک) نیز به همین طریق عمل گردید. در پایان غلظتCFU/g 10⁶×5/1 را که برای هر سه تیمار آزمایشی یکسان بود از طریق اسپری نمودن به سطح غذای میگو اضافه گردید. میگوها در گروه شاهد در طول کل دوره آزمایش با جیره پایه تغذیه گردیدند. میگوها در تیمار 1D، 2D و 3D به ترتیب با جیره‌های حاوی پروبیوتیک تجاری، پروبیوتیک تجاری- بومی و پروبیوتیک بومی با غلظت بیان شده تغذیه شدند.

طرح آزمایش: میگوهای پا سفید غربی (L. vannamei) از مرکز تکثیر و پرورش آبزیان گمیشان (استان گلستان) تهیه و در همان مرکز نیز آزمایش انجام پذیرفت. میگوها در مخازن فایبرگلاس با حجم آبگیری L 50 لیتر نگه‎داری و برای یک هفته از جیره پایه با غذادهی 3 بار در روز تغذیه گردیدند. میگوهای با وزن یکسان (mg 45/6±50) بصورت تصادفی در 12 مخزن با تراکم نگه‎داری 50 قطعه در هر مخزن و 3 تکرار برای هر تیمار ذخیره سازی شدند. مخازن با آب شور دریا که از فیلترهای ریز عبور داده شده بود و با حجم تعویض آب روزانه 20 درصد، آبگیری شدند. در طول دوره پرورش درجه حرارت آب C° 32-28، شوری آب ppt 42-38، اکسیژن محلول mg/l  6 و دوره نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی بود. میگوها روزانه 3 مرتبه با غذای تجاری شرکت هوورراش و با نرخ غذادهی روزانه 7 درصد وزن کل بدن تغذیه نمودند و بر اساس میزان غذای خورده شده واقعی میگو تنظیم گردید. روزانه باقی مانده جیره هر مخزن قبل از غذادهی بعدی از طریق سیفون کردن جمع‎آوری می‌گردید. به علاوه نرخ مرگ و میر در هر مخزن روزانه ثبت و در پایان 60 روز آزمایش، درصد بازماندگی میگوها محاسبه شد.

روش‌های تحلیلی و شاخص‌های ایمنی: در پایان دوره آزمایش، میگوها به مدت 24 ساعت قبل از دستکاری گرسنه مانده و تغذیه آن‌ها قطع گردید (8). نرخ افزایش رشد ویژه، ADG (بر حسب g/day) و همچنین نرخ افزایش وزن نسبی، RWG (بر حسب درصد) محاسبه گردید.

1- نرخ رشد ویژه= [لگاریتم طبیعی وزن نهایی میگو- لگاریتم طبیعی وزن اولیه میگو/ دوره پرورش×]100

2- نرخ وزن نسبی بدست آمده= [(گرم وزن نهایی میگو- گرم وزن نهایی میگو)/ گرم وزن اولیه میگو×]100

همولنف‎گیری: همولنف با استفاده از سرنگ استریل از حفره پریکاردیال میگو گرفته شد که برای این عمل همولنف 6 میگو را گرفته و با هم آمیخته شدند (24) و در میکروتیوب‎های کوچک که حاوی 4/0 از محلول ضد انعقاد آلزور (mmol 115 گلوکز،mmol 336 سدیم کلراید، mmol 27 سیترات سدیم و mmol 9، EDTA با pH برابر با 7) بود تزریق گردید.

شمارش هموسیت‎ها‎ی همولنف: از نمونه همولنف تهیه شده برای تعیین تعداد هموسیت کل (THC) و شمارش افتراقی هموسیت‎ها (DHC) استفاده شد. تعداد هموسیت کل همولنف به وسیله لام هموسیتومتر (نئوبار) و با بزرگ نمایی 40 در زیر میکروسکوپ شمارش شد. همچنین برای تعیین تابلوی هموسیتی یا شمارش افتراقی هموسیت‎ها، پس از تهیه گسترش از همولنف و خشک شدن کامل گسترش‎ها به وسیله جریان هوا، برای مدت زمان 10 دقیقه تثبیت شدند. سپس اقدام به رنگ‎آمیزی به روش می-گرانوالد-گیمسا شد و با میکروسکوپ نوری، تعداد 200 سلول هموسیت شمارش و تعداد هموسیت‎های دانه‎دار بزرگ، نیمه‎دانه‌دار و هیالین تعیین گردید (15).

میزان هموسیت کل و شمارش افتراقی هموسیت‎ها با استفاده از معادلات زیر محاسبه گردید:

تعداد هموسیت کل (THC)= سلول‌های شمارش شده×ضریب رقیق سازی×1000/ حجم اتاقک لام نئوبار  (0.1mm³)

شمارش افتراقی هموسیت‌ها (DHC)= (تعداد انواع سلول‌های هموسیتی مختلف/ هموسیت کل شمارش شده) × 100

آنزیم‎های‌سرمی میگو: به منظور تعیین تغییرات فاکتورهای بیوشیمیایی همولنف در پست‎لاروها، به علت کوچکی اندازه آن‎ها‎ و عدم همولنف دهی به میزان کافی، از روش همگن کردن بدن آن‎ها‎ استفاده شد (34،35). نمونه‎ها‎ی هر تکرار با هم آمیخته شده (14) و در دستگاه هموژنایزر له شدند. سپس بدن له شده پست‎لاروها به لوله‎ها‎ی شیشه‎ای استریل در C° 4 انتقال داده شد و پس از آن درون دستگاه سانتریفیوژ با دور 14000 در دقیقه قرار گرفتند (34،35). در مرحله بعد مایع قسمت فوقانی لوله‎ها‎ که همان عصاره بدن می‎باشد، برای آنالیز فاکتورهای بیوشیمیایی، به آزمایشگاه منتقل گردید.

سنجش ALT و AST: آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) که قبلاً به نام گلوتامیک پیروویک ترانس آمیناز (GPT) نامیده می‎شد، و آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) که قبلاً به نام گلوتامیک اگزال استیک ترانس آمیناز (GOT) نامیده می‎شد، مهم‎ترین آنزیم‎های گروه آمینو ترانسفراز‎ها یا ترانس آمیناز‎ها هستند که با انتقال واحدهای آمین، a-Keto acid را به آمینو اسیدها کاتالیز می‎کنند. برای اندازه‎گیری آنزیم‎های ALT و AST از روش IFCC و در طول موج nm 340 استفاده شد.

سنجش آلکالین فسفاتاز (ALP): آلکالین فسفاتاز آنزیم هیدرولیتیکی است که اپتیمم فعالیت آن در پی- اچ قلیایی است. برای اندازه‎گیری آن از روش DGKC (استاندارد انجمن بیوشیمی آلمان) و در طول موج nm 405 استفاده گردید .

تجزیه و تحلیل آماری: تفاوت بین میانگین‌ها برای بررسی از نظر معنی‌داری آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) تحلیل و بر اساس آزمون چند دامنه دانکن دنبال گردید. همچنین سطح معنی‌داری بکار رفته در مطالعه حاضر 05/0>P بود.

نتایج

در این آزمایش، تأثیر باسیلوس‎های پروبیوتیکی بر برخی پارامترهای رشد میگوی پا سفید غربی نشان داده شده است (جدول 1). نتایج آزمایش حاکی از اختلاف معنی‌داری در وزن، طول، نرخ وزن نسبی بدست آمده و نرخ رشد ویژه شدند (05/0>P). بیشترین وزن (mg 12 / 1101)، طول (mm 46/56)، نرخ رشد ویژه (78/4) و نرخ وزن نسبی (2252/8) میگوی پا سفید غربی در تیمار تغذیه شده با غذای مکمل شده با پروبیوتیک تجاری بدست آمد.

شاخص‌های همولنف: اثر پروبیوتیک‌ها بر پارامترهای همولنف میگو در جدول 2 آمده است. نتایج حاصل از آنالیز داده‌ها بیانگر این بود که بکارگیری باسیلوس‌های پروبیوتیکی مورد استفاده در این آزمایش تأثیر معنی‎داری بر تعداد هموسیت کل همولنف در تیمارهای آزمایشی نسبت به گروه شاهد داشت (05/0>P). به طوری که کمترین تعداد هموسیت کل برای تیمار شاهد (10⁶×Cell/mL 7/10) بدست آمد، در حالی که بیشترین تعداد آن در تیمار آزمایشی اول (10⁶×Cell/mL 4/13) که پست‎لاروهای میگوی سفید غربی در آن با جیره حاوی باسیلوس‎ها‎ی پروبیوتیکی تجاری تغذیه شده بودند مشاهده گردید.

تعداد سلول‎های دانه‎دار بزرگ پست‎لاروهای میگو در تیمارهای آزمایشی نسبت به گروه شاهد اختلاف معنی‌داری را نشان دادند (05/0>P). بطوری که بیشترین تعداد از این نوع هموسیت در تیمار آزمایشی اول و معادل 10⁶×Cell/mL 40/2 (85/17 درصد از هموسیت کل تیمار اول) بدست آمد در حالی که کمترین میزان این پارامتر در گروه شاهد و معادل 10⁶×Cell/mL 20/1 (21/11 درصد از هموسیت کل گروه شاهد) مشاهده گردید.

تعداد سلول‎های نیمه دانه‎دار پست‎لاروها در تیمارهای آزمایشی نسبت به گروه شاهد اختلاف معنی‎داری را نشان دادند (05/0>P). به طوری که کمترین تعداد آن در گروه شاهد و معادل 9/2 (11/27 درصد از هموسیت کل گروه شاهد) و بیشترین تعداد آن در تیمار آزمایشی اول و معادل 45/3 (65/25 درصد از هموسیت کل تیمار اول) مشاهده گردید.

استفاده از باسیلوس‌های پروبیوتیکی در این مطالعه، اختلاف معنی‌داری در تعداد هیالین تیمارهای آزمایشی در مقایسه با گروه شاهد را نشان داد (05/0>P). کمترین تعداد سلول هیالین در گروه شاهد و معادل 60/6 (68/61 درصد) و بیشترین آن درتیمار آزمایشی اول 60/7 (50/56 درصد) مشاهده گردید.

آنزیم‌های سرم: نتایج بدست آمده از تأثیر پروبیوتیک‌ها بر آنزیم‌های سرم بدن در جدول 3 آمده است. نتایج حاصل از آنالیز داده‌های مربوط به ALT سرم بدن پست‎لاروهای میگوی پا سفید غربی نشان داد که باسیلوس‌های پروبیوتیکی، به طور معنی‌داری میزان ALT را کاهش داده‎اند و اختلاف معنی‌داری با تیمار شاهد بدست آمد (05/0>P). کمترین میزان ALT معادلIUL-1 125 برای تیمار اول بود که در این تیمار پست‎لاروها با جیره غذایی حاوی باسیلوس‎های پروبیوتیک تجاری تغذیه شده بودند، در حالی که بیشترین میزان آن در تیمار شاهد معادل  IUL-1163 به دست آمد.

آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز سرم بدنی پست‎لاروهای میگو در تیمارهای آزمایشی در مقایسه با گروه شاهد اختلاف معنی‎داری را با تیمار شاهد نشان داد (05/0>P). کمترین میزان AST سرم در تیمار آزمایشی اول (IUL-11045) و بیشترین میزان آن در گروه شاهد (IUL-11560) مشاهده شد.

استفاده از باسیلوس‎های پروبیوتیکی در این مطالعه، تأثیر معنی‎داری بر ALP سرم بدن پست‎لاروهای میگو در تیمارهای مختلف نداشت (05/0<P). ولی از نظر عددی کاهش نسبی بین تیمارهای آزمایشی و گروه شاهد مشاهده شد و کمترین میزان این پارامتر در تیمار اول معادل IUL-14450 و بیشترین میزان این پارامتر در گروه شاهد و معادل  IUL-18195 بدست آمد.

بحث

 زندگی میگوها هم مانند سایر آبزیان ارتباط نزدیکی با میکروارگانیسم‌ها دارد، استفاده از پروبیوتیک‌ها منجر به متعادل سازی فلور میکروبی روده شده و به سبب آن عملکرد دستگاه گوارش را ارتقا می‌دهد. بدین موجب میگوهای پرورشی از عملکرد رشد بالاتری برخوردار خواهند شد (5،52،53).

در آزمایش حاضر افزایش رشد در میگوهای تغذیه شده با مکمل‌های باسیلوس‌های پروبیوتیکی در مقایسه با گروه شاهد گزارش شد. در کل پروبیوتیک‌ها با افزایش سطوح آنزیم‌های گوارشی به هضم پرروتئین‌ها، نشاسته، چربی و سلولز بهبود بخشیده و منجر به افزایش جذب مواد غذایی شده و در نهایت افزایش پارامترهای رشد را در میگو به همراه دارد (47،52)، با وجود اینکه این آنزیم‌های خارجی نسبت به آنزیم‌های مترشحه از دستگاه گوارش کمتر هستند ولی عامل محرک ترشح آنزیم‌های داخلی محسوب می‌شوند (47،53) علاوه بر این تولید مکمل‌هایی مانند بیوتین، ویتأمین B12، اسیدهای چرب، آمینو اسیدهای ضروری و بسیاری از فاکتورهای رشد ضروری توسط باسیلوس‌ها به پیشرفت و ارتقای رشد کمک می‌کند (10،45).

مکانیسم عمل پروبیوتیک‌ها در اصل به تعاملات بین گونه‌های پروبیوتیکی و فلور میکروبی میزبان یا سلول‌های ایمنی مخاط روده بستگی دارد، پارامترهای زیادی در اتصال پروبیوتیک‌ها به موکوس روده نقش دارند که از آن جمله می‌توان به شرایط محیطی و مقاومت ژنتیکی اشاره کرد (9).

Wang و همکاران در سال2012 در تحقیقی اثر باسیل‌های پروبیوتیکی را بر روی پارامترهای رشد میگوی پا سفید غربی (Litopenaeus vannamei) بررسی کردند و بیان داشتند که استفاده از این باکتری‌ها بعنوان مکمل‌های غذایی افزایش رشد و بازماندگی را در پی داشتند (48).

Ziaei-Nejad و همکاران در سال 2006 از آرتمیا فرانسیسکانای غنی سازی شده با باسیلوس‎های پروبیوتیکی تجاری به منظور رشد و بقاء در پرورش میگوی سفید هندی استفاده کردند (53). همچنین در مطالعه‎ای دیگر Rengpipat و همکاران در سال 1998 با استفاده از باسیلوس‎های پروبیوتیکی (Bacillus S11) منجر به افزایش رشد میگوی ببری سیاه (P. monodon) شدند (36).

در میگو مهم‎ترین نقش گردش هموسیت‎ها، حفاظت از جانور در برابر میکروارگانیزم‎ها‎ی مضر از طریق شرکت در بازشناسی، فعالیت ذره‌خواری و تجمع است (18،42). علی‎رغم وجود تنوع در پاسخ‎های میگو، بسیاری از آن‌ها از هموسیت‏ میگو سرچشمه می‎گیرند. هموسیت‎های میگو در مکانیسم‎ها‎ی دفاعی مانند ذره‌خواری، کپسول گذاری، تشکیل لخته و بازشناسی دخالت دارند (20). سطح هموسیت کل در پاسخ به عفونت، تغییرات محیطی و پوست اندازی در بیشتر سخت‎پوستان متفاوت است (22). هموسیت‎ها‎ی سیال نه فقط از طریق ذره‌خواری و کشتن عوامل عفونی بلکه با سنتز و اگزوسیتوز ترکیبات ضد میکروبی، نقش مهمی در سیستم ایمنی میگو ایفا می‎کنند (39).

یکی دیگر از ویژگی‌های عملکردی پروبیوتیک‌ها کمک به افزایش شرایط سلامت و کنترل زیستی بیماری‌ها از طریق بهبود فعالیت ایمنی میگواست (41). تعداد کل هموسیت‌ها بعنوان یکی از شاخص‌های سلامت میگو، جذب مواد غذایی به صورت کارآمد و بازماندگی مناسب محسوب می‌شود (31). بر اساس نتایج حاصل از این تحقیق، باسیلوس‎ها‎ی پروبیوتیکی موجب افزایش معنی‎داری در تعداد کل هموسیت‎ها‎ نسبت به گروه شاهد شدند که می‎تواند به دلیل عملکرد‎ها‎ی مختلف پروبیوتیک در بدن از جمله تأثیر مثبت بر سلول‎ها‎ی همولنف و سلامتی میگو باشد. در موافقت با نتایج این مطالعه Kongnum و Hongpattarakere در سال 2012 گزارش دادند که استفاده از پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم (Lactobacillus plantarum) در جیره غذایی میگوی پا سفید غربی باعث افزایش تعداد کل هموسیت پس از رویارویی با ویبریو‌هارویی نسبت به گروه شاهد شده است (21). نتایج مشابهی نیز توسط Vieira و همکاران در سال 2007 گزاراش شده است، آن‎ها‎ بیان کردند که پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم جدا سازی شده از میگوی مولد سفید غربی که به عنوان یک محرک ایمنی استفاده شده بود پس از تزریق ویبریو‌هارویی موجب افزایش تعداد کل هموسیت و همچنین افزایش باکتری اسید لاکتیک در دستگاه گوارش این میگو شد (46). افزایش در گرانولوسیت‌ها (LGC, SGC) و هیالین نتیجه فعالیت محرک ایمنی است (40) و توانایی تحریک ایمنی باسیلوس‌ها به واسطه ترکیبات اصلی دیواره سلولی آن است که منجر به افزایش ایمنی میگو می‌شود (41). همسوی با نتایج تحقیق حاضر Jussila و همکاران در سال 1997 در مطالعه‎ای تعداد هموسیت کل و تعداد هموسیت افتراقی را در لابسترهای صخره‎ای غربی (Panulirus cygnus George) تحت استرس پس از جمع آوری بررسی کردند و بیان نمودند که نسبت SGC در لابسترها افزایش نشان داده است (21). در مخالفت با این نتایج، Gullian و همکاران در سال 2004 ضمن بیان این مطلب که تغییر در تعداد افتراقی هموسیت نشان دهنده یک هشدار ایمنی است، گزارش نمودند که تحریک میگوی سفید غربی با باسیلوس و ویبریو آلجینولیتیکوس تفاوت قابل توجهی را در تعداد هموسیت کل نشان نداد اما به طور معنی‎داری باعث افزایش در جمعیت سلول‎ها‎ی هیالین شد. همچنین اگر چه هیچ گونه تفاوت معنی‎داری از لحاظ تعداد سلول‎ها‎ی دانه‎دار بزرگ و نیمه دانه‎دار مشاهد نشد و جمعیت آن‎ها‎ ثابت باقی ماند اما این سلول‎ها‎ به شدت تحریک شدند (14). کاهش در نسبت SGC می‎تواند با توجه به نوسانات HC، SGC، LGC نسبت به زمان باشد (10). نسبت LGC پایین‎تر و SGC بالاتر در لابستر صخره‎ای غربی در معرض هوا (air-exposed) کمتر از آن‎ها‎یی بود که در معرض هوا نبودند (11).

Van de Braak و همکاران در سال 2002 اشاره کردند که افزایش در هموسیت‎ها‎ی جوان و نابالغ ممکن است شاخصی از فعالیت تکثیر شدید از بافت خونساز باشد. همچنین کاهش در سلول‎ها‎ی نیمه دانه‎دار می‎تواند توسط نفوذ بالا از این نوع سلول به بافت همبند، معده و آبشش‎ها‎ در زمان عفونت‎ها‎ی باکتریایی اتفاق بیفتد (27).

کاهش معنی‌دار میزان آنزیم‌های آلانین آمینوترانسفراز (ALT) و آسپارات آمینوترانسفراز (AST) در گروه‌های آزمایشی نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. این آنزیم‌ها شاخص‌ها سلامت هپاتوپانکراس محسوب می‌شوند و در حیواناتی که هپاتوپانکراس آن‌ها آسیب دیده است به همولنف رها می‌شوند (23).  Vargas-Alboresو همکاران در سال 2016 (44) کاهش فعالیت این دو آنزیم را در میگوی سفید Litopenaeus vannamei که از مخلوط پروبیوتیکی استفاده کرده بودند را گزارش دادند.

از جمله مکانیسم‎ها‎یی که منجر به افزایش روند رشد در میگو می‎شود، افزایش آنزیم‎ها‎ی گوارشی است. آلکالین فسفاتاز آنزیمی است که دارای انواع روده‌ای، استخوانی و کبدی است و نوع روده‌ای آن از بافت داخل روده‎ها‎ ترشح می‎گردد. میزان این آنزیم در روده بیانگر وضعیت فعالیت روده می‎باشد. مطالعات انجام شده توسط برخی محققان حاکی از این مطلب می‎باشد که میزان تغییرات سطح آلکالین فسفاتاز تحت تأثیر فاکتورهای مختلفی مانند وضعیت شیمیایی آب میزان جذب غذا، مصرف و نوع غذا، دما و سن و به علاوه ترکیبات موجود در جیره غذایی به‎ویژه، فسفر می‎باشد (39). میزان این آنزیم از لحاظ عددی در تیمار حاوی پروبیوتیک تجاری، کمتر از سایر تیمارهای آزمایشی و نیز تیمار شاهد بوده است ولی از لحاظ آماری این فاکتور معنی‎دار نشد (05/0<P).

اگر چه آلکالین فسفاتاز در بسیاری از گونه‎ها‎ی جانوری ردیابی شده است، اما اطلاعات دقیق در مورد آن در بی‎مهرگان محدود است. اخیراًً این آنزیم در سخت‎پوستانی مانند خرچنگ بهار (spring lobster)، خرچنگ منزوی (Hermit (crab، خرچنگ دراز آب شیرین (cray fish) و میگوی جاوالا (Jawala shrimp) نشان داده شده است (6).

در مجموع نتایج این مطالعه حاکی از آن است که باسیلوس‌های پروبیوتیکی منجر به ارتقای عملکرد رشد، افزایش پارامترهای همولنفی و کاهش سطح آنزیم‌های آلانین آمینوترانسفراز و اسپارات آمینوترانسفراز شده است. بنابراین پروبیوتیک‌ها مکمل‌های غذایی مناسبی در جهت بهبود شرایط پرورشی میگوی سفید غربی محسوب می‌شوند. لازم به ذکر است که در بین تیمارهای پروبیوتیکی،پروبیوتیک‌های تجاری عملکرد بهتری در مقایسه با پروبیوتیک‌های بومی از خود نشان دادند. در حالیکه Ghosh و همکاران در سال 2002 در تحقیق خود بیان داشتند که باکتری‌های جدا شده از دستگاه گوارش فیل ماهی عملکرد بهتری نسبت به نوع تجاری آن بر ماهی داشتند (13)، همچنین Jafaryan و همکاران در سال 2011 باکتری‌های زیست یار بومی را نسبت به غیر بومی کارآمدتر دانستند (19). تفاوت در عملکردهای متفاوت باکتری‌های زیست یار می‌تواند به ژنتیک، تغذیه و فاکتورهای محیطی برگردد(3). البته تفاوت در شرایط محیط گوارشی ماهی (محل جداسازی باکتری‎ها‎ی پروبیوتیک بومی) و میگو، و یا استفاده از سویه‎ها‎ی برتر در پروبیوتیک تجاری نیز می‌تواند از جمله علل تفاوت عملکرد پروبیوتیک‌ها تجاری و بومی باشد.

تشکر و قدردانی

بدین‎وسیله از مجموعه دانشگاه گنبد کاووس، آزمایشگاه آبزی‎پروری و همچنین مرکز تکثیر و پرورش آبزیان گمیشان به جهت فراهم آوردن تسهیلات لازم برای انجام این پروژه صمیمانه قدردانی می‎شود.

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.