مقدمه

یکی از مهم‌ترین عواملی که باعث ضرر و زیان اقتصادی فراوان در نشخوارکنندگان می‌شود، مرگ‌ومیر نوزادان به‌ویژه در اوایل تولد است. ازطرفی مهم‌ترین علت مرگ‌ومیر نوزادان مربوط به عوامل عفونی است. بنابراین دریافت ­میزان کافی آغوز در ساعات ابتدایی تولد در نوزادان نشخوارکنندگان جهت مقابله با عوامل عفونی مانند سپتی سمی­ها، پنومونی­ها و اسهال­ها ضروری است. حیات نوزادان درارتباط‌با میزان دریافت ایمنی غیرفعال از مادران از طریق آغوز است (1-4). شیوه‌های مدیریت و نگهداری در دامداری به‌طور مستقیم بر کیفیت و کمیت تولید آغوز توسط میش تأثیر می‌گذارد. استفاده از ذخایر بدن در 3‌ماهه آخر بارداری نیز به‌طور بالقوه بر تولید آغوز ازنظر کیفیت و کمیت در میش‌ها مؤثر است. این توسعه غدد پستانی و همچنین تمایز سلول‌های پستانی عمدتاً تحت تأثیر سطح تغذیه‌ای میش در 3‌ماهه آخر بارداری قرار دارد. ایمنوگلوبولین‌ها در درجه اول در گردش خون میش جریان دارند و در زمان نزدیک به زایمان ازطریق گردش خون میش به غدد پستانی منتقل می‌شوند (2، 5). آغوز، ایمونوگلوبولین G (IgG) را تا زمانی که سیستم ایمنی کارا شود تأمین می‌کند. از عوامل مؤثر بر جذب ایمونوگلوبولین‌های آغوز، زمان دریافت آغوز و مقدار دریافت ایمونوگلوبولین‌ها از طریق آغوز در بدو تولد نوزادان است (6-8). میزان و مقدار جذب ایمنوگلوبولین‌های آغوز به زمان وابسته است و تأخیر در رسیدن آغوز به روده کوچک می‌تواند تأثیر منفی بر سرعت و میزان جذب آن داشته باشد (9).

در نوزادان دام­های بزرگ، توانایی سلول­های اپیتلیوم روده در برداشت ماکرومولکول­هایی مانند ایمونوگلوبولین­ها، آغوز دریافتی 1 یا 2 روز پس از تولد تحت فرآیندی به نام بسته شدن روده­ها خاتمه می‌یابد (10). این فرآیند در بره­ها به‌صورت طبیعی 24 تا 36 ساعت بعد از تولد اتفاق ‌می‌افتد (11-13). پس از تولد، سلول­های ویلوس روده، به‌سرعت توانایی جذب ماکرومولکول‌ها را از دست می‌دهند (14). فرآیند بسته شدن روده‌ها، در ابتدا با پایان یافتن انتقال ماکرومولکول­ها به خون آغاز می‌شود و در ادامه آن، سلول­های ویلوس، جذب مولکول­ها را از روده متوقف می­کنند (15، 16)، محققین، فرآیند بسته شدن روده­ها را مکانیسمی چند عاملی می‌دانند. مکانیسم بسته شدن و عوامل مؤثر بر آن نامشخص است، اما زمان بسته شدن تا 24 ساعت، مورد وفاق محققین است (17). حداکثر جذب گاماگلوبولین‌ها از روده، در طول 6 ساعت پس از تولد رخ می‌دهد و به مرور سطح جذب پس از این زمان طلایی (6 ساعت بدو تولد) افت می‌کند و تقریباً 24 ساعت بعد از زایش، بسته شدن در روده نوزادان نشخوارکنندگان ایجاد می‌شود، (18). اثر استروئیدها بر تکامل روده و جذب ایمونوگلوبولین‌های در بدو تولد شناخته شده‌اند (19). بنابراین در مطالعه حاضر از گیاه بابونه به‌دلیل اینکه حاوی اجزای استروئیدی فراوان مانند بیزابولول و کامازولن است که نزدیک به 50 درصد عصاره الکلی را تشکیل می‌دهند استفاده شده است (20) تا بتواند از طریق به تأخیرانداختن بسته شدن روده میزان IgG سرم خون را بالا ببرد.  

مواد و روش کار

انتخاب نمونه و طراحی مطالعه: 20 راس بره تازه‌زای به ظاهر سالم در قالب 4 گروه 5 راسی انتخاب شدند. در گروه کنترل تزریق نرمال سالین، در گروه آزمایش 1 تزریق عصاره با دُز 5/5 میلی گرم به‌ازای هر کیلوگرم وزن بدن، در گروه آزمایش 2 تزریق عصاره با دز 11 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن و در گروه آزمایش 3، تزریق عصاره با دُز 22 میلی‌گرم به‌ازای هر کیلوگرم وزن بدن از طریق ورید وداج انجام شد.

عصاره‌گیری: گیاهان به‌دلیل اثر مخرب نور خورشید و اشعه‌های آن در سایه خشک شدند. این گیاهان در محل مناسب از لحاظ جریان هوا قرار گرفتند تا هوا بتواند به‌طور مرتب در داخل گیاه و زیر آن جریان یابد و هرازچندگاهی گیاهان زیرو رو شده تا حالت گندیدگی در آن ایجاد نگردد. در مرحله بعد گیاهان خشک‌شده توسط آسیاب برقی به پودر تبدیل شدند.500 گرم از این پودر در 5/3 لیتر اتانول 70 درصد به‌مدت 72 ساعت خیسانده شد سپس عصاره حاصل از گیاه فیلتر شده و توسط دستگاه تقطیر در خلأ  با دمای 50 درجه سانتی‌گراد و فشار 4000 میلی‌متر جیوه تا حد خشک شدن تغلیظ و در سالین نرمال حل شد، به‌نحوی‌که غلظت آن به 25 میلی‌گرم در میلی‌لیتر برسد. برای سترون کردن، عصاره از فیلتر 22/0 میکرون عبور داده شد. سپس مطالعه کمی و کیفی بر روی آن انجام و با فرمولاسیون مخصوص به‌صورت محلول قابل‌تزریق تهیه شد. درنهایت پس از اطمینان از فرم اولیه دارویی آماده‌شده، در ویال‌های استریل بسته‌بندی گردید.

جمع‌آوری آغوز: قبل از شروع مطالعه، آغوز  موردنیاز از میش‌ها گرفته شد و در فریزر با دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. درنهایت همه آغوزهای فریزشده پس از ذوب شدن به جهت یکسان‌سازی سطح ایمونوگلوبولین، با هم مخلوط و سپس در داخل کیسه‌های پلاستیکی تقسیم شدند. از این کیسه‌های پلاستیکی چندین نمونه برای اندازه­گیری ایمونوگلوبولین g اخذ و به‌صورت جداگانه فریز گردید.

مدیریت بره‌های تازه‌زا: پس از تولد، بره‌ها از میش مادر جدا ‌شدند تا هیچ بره­ای شانس دریافت آغوز از پستان مادرش را پیدا نکند. ابتدا آغوزهای فریزشده در آب گرم ذوب و با استفاده از بطری به همه بره‌ها به مقدار 8 درصد وزن بدن آغوز خورانده شد. سپس بره‌ها 6 وعده شیر به‌صورت روزانه دریافت کردند. بره‌ها در طی و بعد از انجام مطالعه، ازلحاظ ظاهری و علائم بالینی ارزیابی می‌شدند.

تزریق عصاره و نمونه‌گیری :پس از تولد هر بره، بلافاصله نمونه خون (1-) گرفته شد. سپس نیم ساعت بعد و دقیقاً قبل از تجویز عصاره و یا نرمال سالین نمونه خون صفر (0) جمع‎آوری شد. بعد از گرفتن نمونه خون صفر، عصاره و یا نرمال سالین براساس گروه‌بندی تجویز شد. بلافاصله پس از تزریق آهسته داخل وریدی عصاره یا نرمال سالین، آغوز به میزان 8 درصد وزن بدن خورانده و بلافاصله پس از خوراندن آغوز، نمونه خون ساعت 1 گرفته شد. در 3 گروه تیمار، عصاره بابونه با غلظت  25 میلی‌گرم در میلی‌لیتر در مقادیر ذکرشده (11، 22 و 5/5 میلی‌گرم به‌ازای هر کیلوگرم) به‌صورت آهسته به داخل ورید وداج و در گروه کنترل، سالین نرمال به داخل ورید وداج تزریق شد. بعد از گرفتن نمونه خون 1، نمونه‌ها در ساعات 6، 12، 18، 24، 36 و 48 دریافت شدند. نمونه‌های خون گرفته‌شده برای مدت 15 دقیقه با دور 3000 در دقیقه سانتریفوژ شدند. درنهایت همه سرم‌ها به آزمایشگاه ایمونولوژی دانشکده دامپزشکی جهت تعیین میزان IgG انتقال یافت.

تمام سرم‌های حاصل با استفاده از کیت‌های حاصل از آنتی‌سرم ( Anti bovine IgG) و ایمنوگلوبولین G استاندارد ( ساخت شرکت AbD serotec ) به روش الایزای مستقیم و با میکروپلیت الیزا (Maxisopr, Nunc, Netherland) در اسپکتروفتومتر با طول موج 630 نانومتر قرائت شد. پس از کسب نتایج، نمودار تهیه‌شده از استاندارد IgG برای محاسبه غلظت پادتن در سرم و آغوز استفاده شد. برای محاسبه از مدل رگرسیون خطی به‌دست‌آمده از نمودار استاندارد استفاده شد (نمودار 1) (21).

داده‌ها به‌منظور رسم نمودارهای لازم در صفحه نرم‌افزار اکسل و سپس جهت تحلیل آماری در نرم‌افزار SPSS (نسخه 16) وارد شدند. جهت مقایسه بررسی اثر زمان بر فاکتور ایمونوگلوبولین، از روش آماری آنووای تکرارشونده (Repeated Measured Anova) و برای مقایسه بین ساعات هر گروه از رویه Post Hoc LSD استفاده گردید.

نتایج

میانگین غلظت  IgGسرم طی ساعات مختلف و گروه‌های موردمطالعه در جدول 1 ذکر شده است. بعد از 1 ماه بررسی و تحقیق، موارد ابتلا به بیماری و مرگ‌ومیر در هیچ‌کدام از بره­های تحت مطالعه مشاهده نگردید. همچنین مقایسه روند تغییرات میانگین غلظت IgG سرم بین 4 گروه در نمودار 1 ارائه شده است. روند تغییرات غلظت IgG در ساعت 18 پس از تجویز عصاره یا نرمال سالین، بین گروه کنترل و تیمار 1 (023/0P=)  و گروه کنترل با تیمار 2 (035/0P=) اختلاف معنی‌دار مشاهده شد. همچنین غلظت  IgGسرم در ساعت 18 بین تیمار 2 و تیمار 3 (029/0P=)  و تیمار 1 با تیمار 3 (019/0P=) اختلاف معنی‌داری وجود داشت، اما در این ساعت بین گروه کنترل با تیمار 3 اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد. غلظت  IgG سرم در ساعت 24 بین گروه تیمار 1 با تیمار 3 اختلاف معنی‌داری وجود داشت (049/0P=). بین بره­های تیمار 1 و تیمار 2 در ساعات 18 و 48 اختلاف معنی‌داری ازلحاظ غلظت  IgGسرم مشاهده نشد (84/0P=) و (962/0P=) (نمودار 2).

بحث

  با مقایسه میان گروه­های مختلف آزمایش و گروه کنترل، اختلاف معنی‌دار در غلظت IgG سرم در گروه تیمار 3 با گروه کنترل طی ساعت 48 مشاهده نشد. برای گروه‌های آزمایش 1 و 2 نیز در ساعت 48 معنی‌دار نبود. در  مطالعه حاضر، افزایش معنی‌دار در غلظت IgG سرم در میان گروه­های آزمایش 1 و 2 در مقایسه با دو گروه دیگر مشاهده شد که بیانگر افزایش جذب IgG آغوز طی ساعت 18 پس از تزریق عصاره است. بیشترین میانگین غلظت IgG در مطالعه حاضر برای گروه تیمار 1 در ساعت 18 (54/48 میلی‌گرم بر میلی لیتر) حاصل شد. میانگین ایمونوگلوبولین G در ساعت 18 برای گروه تیمار 2 هم (53/47 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) اندازه‌گیری شد. در ساعت 18 بین گروه آزمایش 1 و آزمایش 2 اختلاف معنی‌داری وجود نداشت (84/0P=)، اما به‌دلیل اینکه حداکثر غلظت ایمونوگلوبولین‌ها در ساعت 18، با تجویز هر دو دُز 5/5 و 11 میلی­گرم به‌ازای هر کیلوگرم وزن بدن با کمی اختلاف به‌ دست آمده است، تجویز این دو دُز (5/5-11میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) جهت استفاده و مشاهده نتایج ایمنی­زایی پیشنهاد می­گردد. باتوجه‌به نتایج مطالعه حاضر و تأثیر عصاره بابونه بر سطح جذب IgG طی ساعت 18، می‌تواند این اثر درارتباط‌با پاسخ روده نسبت به اجزای استروئیدی گیاه بابونه باشد که متعاقباً به تأخیر در بسته شدن روده منجر شده است، چراکه پدیده بسته شدن روده­ها، از ساعت 6 پس از تولد شروع می‌شود و میزان جذب ایمونوگلوبولین­ها را کاهش می‌دهد. این کاهش تا ساعت 24 پس از تولد ادامه پیدا می­کند و جذب ایمونوگلوبولین­های آغوز به صفر می­رسد (15، 16). نتایج مطالعه حاضر نشان داد تزریق عصاره بابونه در دزاژ 5/5 و 11 میلی­گرم به‌ازای هر کیلوگرم وزن بدن می‌تواند باعث افزایش سطح ایمنی بره‌ها در اوایل تولد شود.

محققین طی مطالعات متعدد مشاهده کردند استروئیدهای اندوژن و شیمیایی بر تکامل روده­ اثرگذار است و می‌توانند جذب ایمنوگلوبولین‌های آغوز را افزایش دهد (12، 22، 23). همچنین مشاهده شده است کورتیزول می‌تواند به افزایش مقادیر آنتی‌بادی‌های مختلف IgG، IgM و IgA طی 20 ساعت بعد از تولد در خون بره‌ها منجر شود (12). مطالعات مشابه دیگری در سایر حیوانات درمورد پدیده بسته شدن روده در این خصوص وجود دارد (19، 22-24). بابونه حاوی استروئیدهایی مانند بیزابولول و کامازولن است که حدود 50 درصد از عصاره این گیاه را شامل می‌شود (20). بنابراین می‌توان نتایج به‌دست‌آمده از مطالعه حاضر را به خواص استروئیدی این گیاه ارتباط داد. در مطالعه‌ای مشابه در گوساله­ها مشاهده شد تزریق عصاره گیاه بابونه با دُز 11 میلی‌گرم بر کیلوگرم می‌تواند به افزایش ایمونوگلوبولین­های سرم در گوساله‌ها منجر شود (10). بنابراین داده­های مطالعه حاضر  با مطالعه پیشین همخوانی دارد. تفاوتی که در نتایج مطالعه حاضر و پژوهش مشابه وجود دارد را می‌توان به تفاوت­های بین گونه­ای ارتباط داد، چراکه شرایط انجام کارآزمایی بالینی مشابه هم بوده است و تنها تفاوت موجود بین این دو مطالعه، همان تفاوت­های بین گونه­ای موجود بین بره و گوساله است.

نتیجه‌گیری نهایی: دُزهای 5/5 و 11 میلی­گرم به‌ازای هر کیلوگرم وزن بدن از عصاره بابونه می‌تواند به افزایش سطح ایمنی نوزادان منجر شود. باتوجه‌به اینکه عوارض جانبی خاصی در تجویز مقادیر پیش‌گفت مشاهده نشد، بنابراین عصاره این گیاه می‌تواند به‌عنوان یک داروی گیاهی مؤثر با عوارض جانبی کمتر برای سیستم ایمنی بره­های نوزاد معرفی شود.

ملاحظات اخلاقی

در طول دوره مطالعه و نیز در تمام مراحل نمونه‌گیری، اصول اخلاق زیستی بر پایه مقررات دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان در‌مورد نحوه برخورد و استفاده از حیوانات مزرعه تطابق داشت و با شناسه اخلاق IR.SU.REC.1403.05 انجام شد.

سپاسگزاری

نویسندگان مطالعه حاضر از اعضاء محترم گروه بیماری‌های داخلی دام‌های بزرگ و گروه میکروبیولوژی-ایمونولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران و شرکت کشت و صنعت جوین به‌دلیل حمایت‌های ارزشمندشان در پیشبرد و فراهم کردن امکانات لازم جهت انجام مطالعه قدردانی می‌نمایند.

تعارض منافع

هیچ گونه تعارض منافعی در ارتباط با این مطالعه وجود ندارد.